Tách dòng và xác định trình tự gene kháng thể tái tổ hợp kháng tế bào lympho bệnh ung thư vú

Ung thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo có tỉ lệ tử vong cao, đứng thứ hai sau bệnh tim mạch. Hằng năm, trên thế giới có hàng triệu người chết vì ung thư và dường như tỉ lệ mắc bệnh ung thư ngày một cao hơn.

LỜI MỞ ĐẦUUng thư là một trong những căn bệnh hiểm nghèo có tỉ lệ tử vong cao, đứngthứ hai sau bệnh tim mạch Hằng năm, trên thế giới có hàng triệu người chết vìung thư và dường như tỉ lệ mắc bệnh ung thư ngày một cao hơn Vì rằng căn bệnhnày có thể xảy ra với bất kỳ ai và ở bất kỳ cơ quan nào của cơ thể cũng như ở mọilứa tuổi Ung thư biểu hiện khi sự kiểm soát quá trình điều hoà sinh trưởng của tếbào bị sai lệch, dẫn đến sự tăng sinh tế bào một cách bất thường, tạo thành cáckhối u ác tính.

Ung thư có thể xảy ra ở bất kỳ bào quan nào, bất kỳ mô nào trong cơ thể Phụthuộc vào vị trí xuất hiện của các khối u mà người ta gọi tên các bệnh ung thưkhác nhau: ung thư máu xảy ra với các tế bào máu và tế bào mầm, ung thư vú là sựtăng sinh của các tế bào vú, ung thư phổi xảy ra với các tế bào phổi Ung thư cóthể do di truyền, do virus hoặc do các điều kiện ngoại cảnh gây nên như hoá chất,tia tử ngoại nhưng cho dù bát cứ nguyên nhân nào thì ung thư đều có chung mộthậu quả là sự phát triển vô tổ chức của một tế bào hoặc một nhóm tế bào ban đầu

và cuối cùng tạo thành các khối u và di căn ở giai đoạn cuối

Một trong những đặc điểm khác biệt của tế bào ung thư với các tế bào bìnhthường được các nhà khoa học quan tâm đó là các phân tử protein đặc hiệu của tếbào ung thư, chúng là sản phẩm của các gene “đặc biệt” trong tế bào ung thư Cácphân tử protein đặc hiệu của tế bào ung thư hoặc được gắn trên bề mặt màng tếbào hoặc được giải phóng vào hệ tuần hoàn dưới dạng các phân tử tự do Sử dụngcác protein này làm chỉ thị trong chẩn đoán sớm đối với các bệnh ung thư đangđược các nhà nghiên cứu đặc biệt quan tâm

Trong số các bệnh ung thư thì một trong những bệnh ung thư phổ biến nhất ở phụ

nữ nhiều nước trên thế giới là ung thư vú Tại Việt nam, theo ghi nhận của Hà nộinăm 1998, tỷ lệ ung thư vú chuẩn theo tuổi là 20,3/100.000 dân, đứng đầu trong

các ung thư của phụ nữ Tại thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ này là 17,1/100.000dân, đứng hàng thứ 2 sau ung thu cổ tử cung Tỷ lệ mắc ung thư vú đang tăngkhông chỉ ở Việt Nam mà hầu hết các nước trên thế giới Vì vậy, ung thư vú chiếm

vị trí rất quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ cộng đồng

Để góp phần xây dựng bộ kit chẩn đoán sớm bệnh ung thư vú, chúng tôi tiếnhành nghiên cứu tạo kháng thể kháng lại dòng tế bào ung thư vú Tuy nhiên, trong

khuôn khổ đồ án này, chúng tôi chỉ chú trọng nghiên cứu : “Tách dòng và xác định trình tự gene kháng thể tái tổ hợp kháng tế bào lympho bệnh ung thư vú”.

I

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ BỆNH UNG THƯ

Ung thư là tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khác nhau vềnguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng cónhững đặc điểm chung, đó là sự phân chia không kiểm soát được của tế bào, khảnăng tồn tại và phát triển ở các cơ quan và tổ chức lạ

Các ung thư thường phát triển từ một tế bào ban đầu và phải mất nhiều nămcho tới khi có một kích thước đủ lớn để có thể nhận thấy được Quá trình pháttriển từ một tế bào duy nhất thành một khối ung thư trải qua nhiều giai đoạn

Thông thường, các tế bào lành có một tuổi thọ nhất định và tuân thủ theo mộtqui luật chung là phát triển – già - chết Các tế bào chết đi lại được thay thế bằngcác tế bào mới Cơ thể có một cơ chế kiểm soát qui luật một cách chặt chẽ và duytrì số lượng tế bào ở mỗi cơ quan, tổ chức ở mức ổn định Còn khối u, về cơ bản là

do sự phát triển và phân chia tế bào bình thường trở nên quá mức, do đó các tế bàophân chia liên tục và mất kiểm soát Phân chia tế bào bình thường là quá trình tíchcực cần thiết, nó khiến tóc mọc, da tự đổi mới và hàng loạt những điều quan trọngcho sức khoẻ khác Quá trình phân chia xảy ra theo nhu cầu Đôi khi có điều gìkhiến đó khiến các tế bào sinh sản nhanh hơn như tổn thương hoặc phẫu thuật màquá trình liền vết thương đòi hỏi các tế bào phân chia nhiều hơn bình thường

Vấn đề then chốt là sự phát triển tế bào để khoẻ mạnh hoặc để thay thế bất cứ

là theo nhịp bình thường hay tăng tốc trong lúc khẩn cấp đều được kiểm soát.Ngoài ra, mọi tế bào già đi và sẽ chết ở một thời điểm ấn định Trong ung thư, sựphát triển nói chung mất điều tiết và sự chết của tế bào bị chậm lại, hậu quả là các

tế bào ung thư cứ tiếp tục phát triển Ngoài sự phát triển mất kiểm soát, các tế bàoung thư còn có thể phát triển lan sang các cơ quan xa hơn trong cơ thể và quá trìnhnày gọi là di căn và đây cũng là lý do chính mà ung thư gây ốm và cuối cùng là tửvong

Khi các dòng tế bào ung thư phát triển khắp cơ thể chúng trở thành vật ký sinh

sử dụng tất cả chất dinh dưỡng, glucose, và oxy của cơ thể để tiếp tục phát triển

Đó là những lý do giải thích tại sao ung thư giai đoạn cuối thì lại sụt cân và trôngrất suy mòn: Tất cả các chất dinh dưỡng đều bị tế bào ung thư sử dụng Tuỳ thuộcvào cơ quan nào bị ung thư mà chúng nhanh chóng cản trở một số cấu trúc hoặcchức năng sống cònvà dẫn đến tử vong.Bệnh ung thư bắt đầu khi có một tế bàovượt qua cơ chế kiểm soát này của cơ thể, bắt đầu phát triển và sinh sôi khôngngừng nghỉ, hình thành một đám tế bào có chung một đặc điểm phát triển vô tổchức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan và tổ chức xung quanh Các tế bào ungthư có liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạchbạch huyết di cư đến các tổ chức và cơ quan mới, bám vào và tiếp tục sinh sôi nảy

nở ( quá trình này gọi là “di căn”) Các ung thư chèn ép hoặc di căn vào các cơquan giữ chức năng sống của cơ thể như não, phổi, gan, thận bệnh nhân sẽ tửvong

Chìa khoá để hiểu ung thư là chỉ ra gene kiểm soát sự phát triển, xâm nhập và

di căn của tế bào Cái gì khiến cho các tế bào phát triển? Cái gì khiến chúng ngừngphát triển? Cái gì khiến chúng xâm nhập và di căn? Môi trường ảnh hưởng như thếnào đến sự phát triển của các tế bào? Tất cả các điều này đều được định sẵn tronggene

Ngày nay, người ta đã biết rằng sự phát triển không bình thường của tế bàotrong cơ thể được kiểm soát bằng ba nhóm gene:

- Nhóm gene sinh trưởng (oncogenes): chịu trách nhiệm về sự phát triển vàbiệt hoá của tế bào Nếu nhóm gene này bị tổn thương (biến dị), nó hoạtđộng không theo đúng qui luật và sẽ khiến các tế bào phân chia liên tục vàphát triển một cách không kiểm soát được

- Nhóm gene ức chế (oncogene supressors): chịu trách nhiệm ức chế genesinh trưởng, không cho các tế bào tham gia tuỳ tiện vào chu kì sinh trưởng,Nếu gene này bị mất hoặc bị tổn thương, các gene sinh trưởng bị mất kiểmsoát và hoạt động một cách bất thường khiến cho các tế bào sẽ sinh sản bấtbình thường

- Nhóm gene sửa chữa: là nhóm gene chịu trách nhiệm điều chỉnh những saisót trong hoạt động của hai loại gene trên Nếu loại gene này bị tổn thươngthì những biến dị của hai loại gene trên sẽ không được khắc phục và sẽ dẫnđến sự sinh trưởng bất bình thường của tế bào

Đôi khi dấu hiệu khác đáng chú ý là một chỗ lồi trong nách, do ung thư lan đếnhạch máu trắng U có thể lan đến xương, phổi, gan.

1.2.1 Nguyên nhân ung thư vú

Nguyên nhân của ung thư vú không thể được cắt nghĩa bởi một yếu tố bệnhcăn đơn độc Hơn nữa, tạo ung thư vú có thể coi là hậu quả của sự tích luỹ các tổnthương qua nhiều năm với các tế bào trong một vú Nói một cách ngắn gọn, có hailoại chấn thương phân tử gây nên ung thư vú: đột biến của DNA và kích thích tăngsinh tế bào

Các đột biến xảy ra trong các gene quan trọng chịu trách nhiệm điều hoà pháttriển, chết, biệt hoá và phiên mã nhiễm sắc thể của tế bào Các đột biến có thểđược hoạt hoá hoặc làm mất hoạt hoá các gene bị ảnh hưởng Mặt khác, tăng sinhlàm tăng hiệu quả tạo thành u của các tế bào bằng cách khởi động sự bành trướngcủa một quần thể tế bào Kích thích tăng sinh và hoạt động theo hai cơ chế Cáctác nhân sinh phân bào tác động trực tiếp đến sự phân chia và tăng sinh trong khicác tác nhân độc gây tăng sinh trên các tế bào sống để tạo lại quần thể tế bào trongmột mô bị tổn thương

1.2.2 Tiến triển của bệnh

Lúc đầu là sự phát triển mất kiểm soát của các tế bào giới hạn hoàn toàn ở ốngdẫn hoặc các tiểu thuỳ của vú ( tổn thương tiền ung thư) Sau đó, có thể thêm độtbiến hoặc những thay đổi di truyền học biểu sinh mà những tế bào này có thể phá

vỡ ống hoặc tiểu thuỳ vú vào mô mỡ và mô xung quanh Có thể chỉ là do một tếbào gây phá vỡ nhưng một khi nó bắt đầu phân chia và nhân lên thì nhanh chóngtrở thành khối u xâm nhập

Trong khi đang phát triển, khối u cần các chất dinh dưỡng, do đó no phát ra

những thông điệp protein gọi là các yếu tố mạch khối u Những protein này gây

hình thành các mạch máu mới để mang chất dinh dưỡng tới cho khối u phát triển

Đó là cách tồn tại hợp lý nhất

Nếu tất cả các bước này xảy ra, khối u sẽ xuất hiện ở vú và hình thành nguồncấp máu mới Và những thay đổi về sau khiến các tế bào có thể phá vỡ thaàn khối

u vào mạch máu Khi đó, tế bào có thể bị chết hoặc tồn tại trong dòng máu và bị

hệ miễn dịch tiêu diệt Cuối cùng, nó có thể có những thay đổi khác cho phép nótrốn tránh được hệ miễn dịch Những tế bào này đi khắp cơ thể và xâm nhập, pháttriển ở các cơ quan khác nhau Tuy nhiên, chúng không xâm nhập vào bất kỳ cơquan nào mà có những yếu tố ở nội mạc mạch máu, ở những cơ quan nhất địnhthu hút các tế bào (ung thư vú đặc biệt thu hút tới phổi, gan và xương) Một khi tếbào gắn vào mạch máu ở cơ quan (như phổi) và xuyên qua thành mạch vào cơquan đó thì có thể hình thành nguồn cấp máu mới dẫn đến các tế bào phát triểnnhiều hơn ở phổi và tiếp tục gửi thông điệp mới đến mô phổi xung quanh Cuốicùng, ung thư vú đã di căn đến phổi Trong thời gian nhất định, khối u chiếm gầnhết không gian cần thiết của phổi và cuối cùng con người sẽ chết

Do vậy, việc ung thư xâm nhập và gây tử vong thực sự không dễ vì phải quacác bước, mỗi bước lại mất một thời gian dài tương đối

1.2.3 Phân loại ung thư vú

1.2.3.1 Phân loại dựa vào cấu trúc

Mỗi vú có khoảng 15 đến 20 “ khu vực”, gọi là “ thuỳ” ; mỗi thuỳ được chiathành nhiều vùng nhỏ, gọi là tiểu thuỳ Thuỳ và tiểu thuỳ liên kết với nhau bằngnhững ống dẫn nhỏ Dựa vào cấu trúc này, ung thư vú được phân thành nhiều loạikhác nhau, chủ yếu là:

Ung thư ống dẫn sữa có giới hạn ( ductal carcinoma in situ hay còn gọi là DCIS).Như tên gọi, loại ung thư này chỉ giới hạn trong các ống dẫn sữa và không lansang các mô chung quanh Loại ung thư này rất khó phát hiện bằng mắt thường,

mà chỉ có thể phát hiện qua quang tuyến X Khoảng 20% các trường hợp ung thư

vú là thuộc dạng “ ung thư hiền” này

Ung thư ống dẫn sữa lan rộng ( invasive ductal cancer) Đây là loại ung thư vúthường thấy nhất Khoảng 70% các trường hợp ung thư vú là thuộc dạng này Nóthường được biểu hiện dưới hình thức một cục bướu cứng, và thường thấy trong tếbào của các ống dẫn sữa.

Ung thư miu – xin ( Mucinous carcinoma) cũng là một dạng bướu ác tính, nhưngung thư này có chứa các tế bào sản xuất chất nhầy, và chất nhầy làm cho cục bướu

có màu lóng lánh Chỉ có khoảng 3% trường hợp ung thư vú thuộc dạng này.Ung thư tiểu thuỳ lan rộng ( invasive lobular carcinoma) Đây là một dạng ung thưhiện diện trong hai đầu ống dẫn sữa hay trong các tiểu thuỳ Loại ung thư nàychiếm khoảng 5% trong các trường hợp ung thư vú

1.2.3.2 Phân loại mô bệnh học.

Những cố gắng để có được một hệ thống phân loại mô bệnh học ung thư biểu

mô tuyến vú vừa đơn giản, dễ áp dụng trong chẩn đoán vừa phản ánh bản chất củatổn thương, được thừa nhận rộng rãi luôn luôn là mục tiêu của các nhà giải phẫubệnh học Chính vì vậy mà phân loại ung thư biểu mô tuyến vú đã được đề nghị

Từ năm 1968 đến nay, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đưa ra nhiều bảngphân loại khác nhau có bổ sung và sửa chữa chi tiết hơn và dễ áp dụng trong lâmsàng Ở đây, tôi xin trích dẫn bảng phân loại ung thư biểu mô tuyến vú của Tổchức Y tế Thế giới vào năm 1981 Bảng phân loại như sau:

Phân loại mô học các ung thư biểu mô vú theo TCYTTG năm 1981

1 Ung thư biểu mô không xâm nhập

Ung thư biểu mô nội ống

Ung thư biểu mô tiểu thuỳ tại chỗ

2 Ung thư biểu mô ống xâm nhập

Ung thư biểu mô ống xâm nhập

Ung thư biểu mô ống xâm nhập với thành phần nội ống trội

Ung thư biểu mô tiểu thuỳ xâm nhập

Ung thư biểu mô nhầy xâm nhập

Ung thư biểu mô tuỷ xâm nhập

Ung thư biểu mô nhú xâm nhập

Ung thư biểu mô ống nhỏ

Ung thư biểu mô tuyến nang

Ung thư biểu mô chế tiết ở thanh niên

2.10 Ung thư biểu mô chế tiết rụng đầu

2.11 Ung thư với thành phần dị sản

- Loại vảy (dạng biểu bì)

- Loại tế bào thoi

- Loại dạng sụn và dạng xương

- Loại hỗn hợp

2.12 Các loại khác

3 Bệnh Paget vú

1.2.4 Điều trị bênh ung thư vú

Có rất nhiều tiến bộ trong việc xác định sớm và trị liệu ung thư vú thành công.Khi tìm thấy khối u trong vú, người phụ nữ có cơ hội lựa chọn về cách trị bệnhcho thích hợp với tình trạng của mình Đối với mỗi người bệnh có những phươngpháp trị liệu thích hợp

Các phương pháp điều trị chính cho bệnh ung thư vú là:

Giải phẫu: tuỳ từng giai đoạn của bệnh mà bác sĩ có thể giải phẫu cắt bỏ mộtphần (lumpectomy , Partical Mastectomy, Segmental Mastectomy) hay phải giảiphẫu cắt bỏ toàn thể vú ( Total or Simple Mastectomy, Modified RadicalMastetomy) Cũng có trường hợp phải giải phẫu hạch bạch huyết (lymph NodeDissection) để cắt bỏ các hạch bạch huyết ở dưới nách

Quang tuyến trị liệu ( radiation therapy): sử dụng năng lực quang tuyến X cao

độ để giết chết tế bào ung thư Cách trị liệu này được dùng để ngăn chặn ung thưtăng trưởng trước khi giải phẫu, hay tiêu diệt tế bào ung thư còn sót lại sau cuộcgiải phẫu Quang tuyến trị liệu thường được sử dụng sau lumpectomy hay particalmastectomy, nhưng đôi khi cũng được dùng sau khi làm total masectomy haymodified radical mastectomy nếu ung thư quá lớn hay có nhiều hạch ở nách bị ungthư Quang tuyến trị liệu được chia làm nhiều ngày, bệnh nhân ung thư vú thườngđược chiếu quang tuyến khoảng từ sáu đến bảy tuần

Hoá chất trị liệu (chemotherapy): sử dụng các dược liệu đặc biệt để tiêu diệtnhững tế bào ung thư Hoá chất trị liệu thường được dùng thêm với với việc giảiphẫu, quang tuyến trị liệu hay dùng để chống ung thư khi nó tái phát hay lây lan Nhiều loại hoá chất được dùng trị ung thư vú, thông thường nhất là chấtadriamycin, epirubucin, cytoxan, 5-FU, taxol Taxotere, xeloda, navelbine có thểdùng riêng rẽ hay tổng hợp

Trị liệu qua kích thích tố (hormonal therapy): trị ung thư bằng cách ngăn chặnhay thêm kích thích tố vào cơ thể Rất nhiều ung thư vú tăng trưởng dưới sự kíchthích của các kích thích tố nữ Nếu chế ngự được các kích thích này, các tế bàoung thư có thể ngưng phát triển hay bị tiêu huỷ

Một phương pháp điều trị mới đối với bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh ungthư vú nói riêng là sử dụng các kháng thể, đặc biệt là kháng thể đơn dòng vàkháng thể tái tổ hợp Kháng thể không chỉ được sử dụng để chẩn đoán sớm bệnhung thư thông qua việc phát hiện kháng nguyên cuả tế bào ung thư mà còn được

sử dụng để tạo ra các phân tử tái tổ hợp có tác dụng làm tan các khối u giúp điềutrị hiệu quả bệnh ung thư

1.3.KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ

1.3.1 Kháng nguyên

Thuật ngữ kháng nguyên (antigen – Ag) dùng để chỉ một chất có khả năng gây

ra đáp ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể của một động vật thích hợp hoặcmột chất có khả năng phản ứng với một kháng thể hoặc một tế bào của hệ thốngmiễn dịch Như vậy, tất ca những chất tự nhiên hoặc tổng hợp được hệ thống miễndịch nhận biết đều được gọi là kháng nguyên

Sự liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể hay giữa kháng nguyên và tế bàolympho luôn mang tính đặc hiệu cao Tuy nhiên, không phải toàn kháng nguyêntham gia vào kích thích hệ thống miễn dịch mà chỉ có một phần nhất định củakháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay epitop, mới liên kết với khángthể hoặc tế bào lympho Mỗi epitop khoảng 6-8 acid amin với trọng lượng phân tửkhoảng 750 dalton Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên mỗikháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop, còn phần tương ứng trên

tế bào lympho là thụ thể

Sự nhận biết giữa kháng nguyên và kháng thể hoặc giữa kháng nguyên và cácthụ thể của tế bào có thẩm quyền miễn dịch mang tính đặc hiệu cao Điều đó cónghĩa là một kháng nguyên A chỉ có thể được nhận biết bởi một kháng nguyên anti– A hoặc chỉ có thể nhận biết bởi một loại tế bào lympho có thụ thể liên kết đặchiệu với kháng nguyên A

Kháng nguyên trong tự nhiên rất đa dạng, chủ yếu dựa vào cấu trúc hoá học( kháng nguyên protein, lipid, acid nucleic), dựa theo nguồn gốc (kháng nguyênđồng loại, đa loài, tự kháng nguyên) và vi sinh vật (vi khuẩn, virus) Trong số cácloại kháng nguyên đó thì kháng nguyên protein và polysaccharid là hai nhómkháng nguyên lớn và quan trọng nhất

1.3.2 Kháng thể

Định nghĩa: Kháng thể (antibody) là một loại protein có đặc tính chống lại các

thể vi khuẩn gây bệnh Ngày nay, nó được gọi là kháng thể miễn dịch(immunoglobulin, kí hiệu là Ig) hay kháng thể đặc hiệu

Bản chất và tính chất của kháng thể: Như chúng ta đã biết thì bản chất của

kháng thể là protein, nên các tác nhân hoá, lý như nhiệt độ, acid, kiềm làm biếntính protein thì cũng có thể phá huỷ kháng thể Hoạt tính kháng thể phụ thuộc vào

pH môi trường và nhiều yếu tố khác ( Amon sulfat, natri sulfat ) vì thế người ta

đã sử dụng tính chất này để tinh khiết kháng thể

Hai đặc tính quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với khángnguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích kháng thểchống lại chính nó- kháng kháng thể Có thể tạo kháng thể kháng từng loại Ig(IgA, IgG, IgM ) hoặc khán từng cấu trúc của phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc)

Cấu trúc của kháng thể: Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm

một hay nhiều đơn vị (monomer) hợp thành Mỗi đơn vị là một phân tử proteinchứa 4 chuỗi polypeptid Hai chuỗi nhẹ, ngắn, kí hiệu là L và hai chuỗi nặng, dài,

ký hiệu là H được gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S) Trình tự acid amin ở khángthể giống hệt nhau theo từng đôi chuỗi nặng và từng đôi chuỗi nhẹ Cả phân tử cócấu tạo đối xứng Cấu trúc phân tử Ig điển hình được trình bầy tại hình 1

Cấu tạo của kháng thể

Chuỗi nhẹ: Có trọng lượng phân tử 25.000, chứa khoảng 211-221 acid amin.

Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ, chuỗi nhẹ kappa vàchuỗi nhẹ lambda Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ lambda hoặc haichuỗi nhẹ kappa mà không bao giờ chứa cả hai loại Mỗi chuỗi nhẹ Ig chứa haivùng acid amin Một vùng có trình tự acid amin có thể thay đổi gọi là vùng biếnđổi, ký hiệu là VL Vùng còn lại có trình tự acid amin không thay đổi gọi là vùng

cố định, hiệu là CL, vùng này nằm ở phía đầu cacboxyl (-COOH) của phân tử.Trình tự acid amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớpkháng thể Ngược lại, trình tự acid amin của vùng biến đổi luôn khác nhau kể cả ởcác Ig do cùng một tế bào sinh ra

Chuỗi nặng: có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, chứa khoảng 450 acid

amin Có 5 loại chuỗi nặng là: mu, gamma, alpha, delta, epsilon ứng với 5 lớpkháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD, IgE Mỗi chuỗi nặng chứa 4 vùng acid amin, mộtvùng biến đổi và 3 vùng cố định Cũng như chuỗi nhẹ, vùng biến đổi của chuỗinặng nằm ở phần đầu amin, ký hiệu là VH Vùng cố định nằm ở đầu cacboxyl và

có trình tự acid amin giống nhau ở tất cả globulin miễn dịch thuộc cùng một lớp,

ký hiệu là CH1, CH2, CH3

Vùng nằm giữa CH1, CH2 của chuỗi nặng gọi là khớp nối làm cho phân tử có cấutạo hình chữ Y, đây là nơi dễ bị tác động của enzyme phân giải protein (papain).Nhìn chung, phân tử kháng thể được chia làm hai phần: Fab là phần dễ kết tinhphản ứng với các tế bào của hệ thống miễn dịch qua các thụ thể của các tế bào Do

đó, nếu kháng thể được cố định trên vi khuẩn bằng phần Fab thì nó sẽ liên kết vớicác tế bào thực bào bằng phần Fc

1.3.2.1 Kháng thể đơn dòng.

Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng do Kohler hoặc Milstein đề xuất năm

1975 đã cho phép ta tạo ra các tế bào lai có khả năng sản xuất các kháng thể đơndòng có tính đặc hiệu loài cao, có khả năng chọn lọc các kháng nguyên đích đặchiệu Tuy nhiên, kỹ thuật lai tế bào này rất tốn kém về thời gian, tiền bạc và thiết

bị chuyên dụng đắt tiền, phải sử dụng đến động vật thí nghiệm, đồng thời phải tạo

ra một lượng lớn các tế bào dung hợp mới có thể chọn được những tế bào tốt nhất

có khả năng sản xuất kháng thể đơn dòng Lượng cơ chất có thể sử dụng để gâymiễn dịch trên động vật là có hạn và sự đa dạng tối đa có thể có đối với phản ứngmiễn dịch động vật là có hạn và sự đa dạng tối đa có thể có đối với phản ứng miễndịch của động vật là 6.106 các kháng thể khác nhau Quan trọng hơn, không thểthay đổi tính chất của kháng thể do các tế bào lai tạo ra Mặt khác các kháng thể

được tạo ra bằng kĩ thuật này có thời gian tồn tại ngắn trong điều kiện in vitro, và

thường gây ra phản ứng dị ứng khi sử dụng cho người vì các kháng thể này đều cóbản chất từ động vật

Sự quan tâm tới việc tách và biểu hiện các gene kháng thể đã được chú trọngsau khi Kohler và Milstein tạo kháng thể đơn dòng bằng kĩ thuật dung hợp tế bàonăm 1975 Kỹ thuật tạo kháng thể tái tổ hợp dựa trên những hiểu biết về cấu trúc

và chức năng của kháng thể, đặc tính sinh học của quá trình nhân bản thực thểkhuẩn, những kĩ thuật mới về DNA và tạo ra đột biến Sau khi xác định đượctrình tự vùng hay biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của nhiều kháng thể khácnhau, các mồi là các đoạn oligonucleotid bảo thủ được tổng hợp để nhân các genecủa các kháng thể mới Kỹ thuật PCR đã được sủ dụng để nhân bản các gene từmARN

Kháng thể đơn dòng được ứng dụng trong:

 Chuẩn đoán và điều trị bệnh ung thư

 Tạo chất ức chế miễn dịch trong điều trị các bệnh tự miễn dịch và đào thảicác mảnh ghép

 Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và ức chế sự tích tụ neurotphil đểgiảm sự huỷ hoại mô trong bệnh viêm màng não do vi khuẩn.

 Trong điều trị bệnh nhồi máu cơ tim cũng như việc ngộ độc thuốc

Do những giá trị của việc sử dụng rộng rãi kháng thể đơn dòng mà sản xuấtkháng thể đơn dòng đang trở thành một lĩnh vực mới đầy hứa hẹn

1.3.2.2 Kháng thể tái tổ hợp và ứng dụng

Công nghệ kháng thể tái tổ hợp bao gồm việc thu nhận các gene kháng thể từcác tế bào nguồn, nhân bản và tách dòng các gene trong các vector thích hợp, biếnnạp các vector vào tế bào chủ để biểu hiện một lượng kháng thể đủ lớn có hoạttính kháng thể mong muốn Các kỹ thuật bổ trợ như việc sàng lọc các dòng tế bàomang các kháng thể mong muốn từ một “thư viện” lớn các dòng đã tách được Cáckháng thể tái tổ hợp có thể tách dòng từ bất kì loài động vật tạo kháng thể nào nếu

có được đoạn mồi hoặc các proble lai thích hợp Khả năng thao tác với các gene

kháng thể cho phép tạo ra kháng thể mới trong điều kiện in vitro Điều này có thể

thực hiện ở mức toàn bộ vị trí kết gắn bằng việc kết hợp chuỗi nặng và chuỗi nhẹ,hoặc cũng có thể thao tác trên các vùng CDR riêng biệt Các vùng thay đổi cũng

có thể nối kết với các trình tự có các đặc tính khác, đó là các phân tử kháng thể độc tố sử dụng trong việc điều trị các tế bào khối u Vì các đoạn Fab và Fc nhỏhơn nhiều so với toàn bộ phân tử kháng thể nên chúng rất thích hợp trong y học vàcác ứng dụng khác Một ưu thế khác là các kháng thể tái tổ hợp có thể biểu hiệntrong cơ thể chủ mới Một trong cơ thể chủ để tổng hợp kháng thể tái tổ hợp làE.coli Do những ưu điểm nổi bật của nó: tế bào phát triển nhanh và rẻ Nhiềuvector có thể sử dụng để tách dòng và biểu hiện các gene đã tách dòng DNA cóthể đưa trực tiếp vào E.coli (biến nạp) và bằng việc nhiễm vào thực thể khuẩn (quátrình chuyển nhiễm) Cấu trúc gene của một đoạn kháng thể (Fab và ScFv) có thểđược đánh giá nhanh và có nhiều phương pháp chọn lọc khác nhau Đương nhiên,việc mở rộng qui mô để sản xuất một lượng lớn các kháng thể tái tổ hợp trong

-E.coli dễ dàng hơn nhiều so với việc tạo sinh khối các tế bào lai trong qui trình sảnxuất kháng thể đơn dòng bằng việc dung hợp tế bào.

1.3.2.3 Các phương pháp tạo kháng thể

Kháng thể được tạo ra bằng các phương pháp khác nhau, ngoài các phươngpháp thông thường, hiện nay nhà nghiên cứu còn tạo kháng thể bằng công nghệgene Có thể tóm tắt các phương pháp tạo kháng thể như sau:

 Tách từ huyết thanh (serum)

 Sản xuất kháng thể từ các tế bào lympho B trong điều kiện in vitro

 Kỹ thuật dung hợp tế bào ( kháng thể đơn dòng, hybridoma method)

 Kỹ thuật bộc lộc trên thực thể khuẩn (phage display)

 Sản xuất kháng thể đơn dòng bằng động, thực vật chuyển gene

1.4 VECTOR TÁCH DÒNG

1.4.1 Khái niệm vector tách dòng

Vector là một phân tử DNA có kích thước nhỏ, cho phép gắn các gene cầnthiết, và có khả năng tự nhân lên không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào.Các vector thường có dạng vòng, chứa nhiều gene có nhiều đặc tính khác nhau, cókhả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, mượn bộ máy của tế bào vi khuẩn để tạo

ra nhiều bản sao giống hệt vector ban đầu Vector còn được gọi là phương tiện vậnchuyển gene

Như vậy, phân tử DNA mạch kép có khả năng tự sao chép trong tế bào vậtchủ, có thể gắn vào phân tử này một hoặc vài đoạn DNA khác nguồn gốc tạo nênphân tử DNA tái tổ hợp dùng để tạo dòng được gọi là vector tách dòng

Sự tách dòng (cloning) là để thu nhận gene hay một trình tự DNA tinh sạchvới hàm lượng lớn

Có nhiều loại vector khác nhau như: plasmid, phage, cosmid, BAC,YAC Tuỳthuộc vào kích thước đoạn DNA cần tạo dòng để lựa chọn loại vector thích hợp

Các vector tách dòng có thể mang các đoạn DNA có kích thước từ vài trăm bp đến1Mb.

 Vector có 3 đặc tính cơ bản:

- Có khả năng xâm nhập vào tế bào

- Có điểm mở đầu để tái bản tức là có khả năng tự tái bản tích cực, khôngphụ thuộc sự sao chép của bộ gene tế bào chủ

- Các thể biến nạp phải dễ dàng được chọn lọc và sinh trưởng tốt trên môitrường đặc Khả năng chọn lọc được mã hoá bởi các gene chọn lọc,thường là đặc tính kháng với chất kháng sinh

 Ngoài ra vector sẽ được xem là càng mạnh khi càng có thêm các ưu điểmsau đây:

- Có kích thước nhỏ để có thể thu nhận được tối đa lượng DNA, dễ xâmnhập vào tế bào vi khuẩn và sao chép nhanh

- Tồn tại qua nhiều thế hệ trong tế bào vi khuẩn và ít xáo trộn đối với traođổi chất của tế bào chủ

- Mang các vị trí nhận biết duy nhất của nhiều loại enzyme giới hạn và vịtrí đó nằm trong các gene chọn lọc, khi đoạn DNA ngoại lai được chènvào thì gene chọn lọc bị bất hoạt

- Trong số các loại vector hiện có thì plasmid được sử dụng phổ biến do

dễ dàng nhân lên trong tế bào vi khuẩn có kích thước nhỏ (1kb-200kb).Các thế hệ plasmid ngày càng được cải tiến và mang các đặc tính mớithuận lợi cho việc tách dòng

1.4.2 Plasmid pCR 2.1

Để tách dòng gene mã hóa cho kháng thể kháng tế bào lympho bệnh ung thư

vú, chúng tôi sử dụng plasmid pCR2.1

Đây là một vector thế hệ mới đang được sử dụng phổ biến, có ưu điểm nổi bật

là có thể gắn trực tiếp sản phẩm pCR vào vector đã được cắt mở vòng do có sẵnhai đầu dính, mỗi đầu có bazơ Timin

Vector pCR 2.1 có kích thước 3,9kb, mang điểm khởi đầu tái bản của plasmid

pUC nên có khả năng nhân lên với số lượng rất lớn trong tế bào E.coli.

Để có thể chọn lọc dễ dàng các tế bào có mang nó, vector được thiết kế manghai gene kháng lại chất kháng sinh: kanamycin và ampicillin, nhờ vậy vi khuẩnchủ có thể sinh trưởng bình thường trên môi trường có chứa một trong hai hay cảhai loại kháng sinh trên, pCR 2.1 được gắn thêm operon- lac có tácdụng chuyểnhoá đường lactoza, sau vị trí promoter là đoạn lacZ mã hoá cho146 acid aminđầu tiên của enzyme - galactosidase, vùng cắt gắn đa vị được thiết kế trên đoạn

này là 15 vị trí cắt duy nhất của enzyme giới hạn: Hind III, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, Bst X I, Eco RV, Not I, Ava I, Pae R7I, Xho I, Nsi I, Xba I, Apa I và hai vị trí cắt giới hạn của EcoRI.

Khi đoạn DNA lạ được chèn vào một trong các vị trí trên sản phẩm của gene

- galactosidase tạo ra sẽ không có hoạt tính enzyme làm cho cơ chất X- gal cótrong môi trường không được chuyển hoá, kết quả là xuất hiện các khuẩn lạc cómàu trắng trên môi trường thạch Dựa vào dấu chuẩn này có thể phát hiện các tếbào vi khuẩn mang vector tái tổ hợp với hiệu quả rất cao

Một ưu điểm nữa của pCR2.1 là có mang promoter của thực khuẩn thể T7 và

vị trí gắn mồi xuôi và ngược của thực khuẩn thể M13, nhờ đó có thể phiên mãđược đoạn ARN antisense và đọc trình tự đoạn DNA ngoại lai