Để khẳng định một cách chắc chắn việc gắn đoạn gene mong muốn vào vector tách dòng pCR 2.1, chúng ta có thể sử dụng các enzyme cắt giới hạn để cắt thử.
Enzyme cắt giới hạn (RE) là các endonuclease có khả năng thuỷ giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những vị trí ( trình tự ) xác định. Do đặc tính cơ bản của các RE là khả năng nhận biết và cắt một trình tự xác định trên phân tử DNA nên dựa vào khả năng này, người ta chia chúng làm ba loại:
- Loại I: Khi enzyme nhận biết được trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000- 5000 nucleotid và giải phóng độ vài chục nucleotid.
- Loại II: Enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đó.
- Loại III: Enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide.
Tuy nhiên, chúng ta chỉ quan tâm đến các RE loại II vì đó là nhóm duy nhất được sử dụng trong các thao tác sinh học phân tử.
- Cắt tạo đầu bằng: Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp trở lại. Để nối chúng lại phải dùng enzyme T4 ligase.
- Cấu tạo đầu so le hay đầu dính: ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai
mạch. Trong trường hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại.
Đặc tính này được sử dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai
phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau nhưng cùng được cắt bởi một RE sẽ
có khả năng kết hợp thông qua các đầu dính (như enzyme EcoRI...).
Yêu cầu của một phản ứng cắt bởi RE:
- Mồi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm. Các dung dịch đệm dùng trong phản ứng RE thường cơ bản khác nhau về nồng độ NaCl. Do đó, khi trong một phản ứng cần sử dùng RE: ( 1) Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể sử dụng đồng thời; (2) nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải được cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trước, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục thuỷ giải.
- RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu
luôn luôn được bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thuỷ giải, chỉ lấy
RE ra vào cuối cùng sau khi đã cho đủ các thành phần khác và giữ trong đá
trong thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào – 200C.
- Nên tiến hành phản ứng trong thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme cơ chất. Tuy nhiên, phải đảm bảo thể tích RE không vượt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động của enzyme.
Việc sử dụng các RE có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gene khổng lồ của các sinh vật. Các RE chủ yếu được sử dụng trong phương pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một trình tự
xác định với số lượng lớn. Ngoài ra, chúng còn được dùng vào việc lập bản đồ giới hạn, vào việc phân tích so sánh bộ gene của các loài khác nhau thông qua kỹ thuật RFLP ( tính đa hình kích thước của các trình tự giới hạn)...
Sau đó, sản phẩm cắt được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8 %
2.3.7.Tinh sạch DNA plasmid.
Sau khi đem nuôi lượng lớn, DNA plasmid trong các mẫu sẽ được tinh sạch theo phương pháp S.N.A.P. Miniprepkit. Quá trình gồm 3 bước cơ bản.
- Phá màng tế bào và thu tủa. - Gắn plasmid
- Đẩy DNA Plasmid ra khỏi cột
Các mẫu DNA dùng trong việc xác định trình tự yêu cầu phải đậm đặc và tinh sạch tuyệt đối.
Tiến hành tinh chế các DNA plasmid tái tổ hợp chọn được bằng cách trộn các
DNA plasmid đã được tách chiết trong đệm gắn, cho qua cột S.N.A.PTM (ivitrogen).
DNA plasmid được giữ lại cột, rửa cột bằng đệm rửa, cuối cùng plasmid được đẩy ra khỏi cột bằng nước khử ion vô trùng.