Tách dòng và thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ cây arabidopsis thaliana

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA THỊ THU LỆ TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6 TỪ CÂY Arabidopsis thaliana LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2019 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM MA THỊ THU LỆ TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE CHỊU HẠN AtYUCCA6 TỪ CÂY Arabidopsis thaliana Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số ngành: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Tiến Dũng GS TS Ngơ Xn Bình Thái Ngun - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu Các số liệu có nguồn gốc rõ ràng tuân thủ quy tắc Kết trình bày luận văn thu thập trình nghiên cứu trung thực, chưa công bố trước Thái Nguyên, ngày tháng năm 2019 Tác giả Ma Thị Thu Lệ ii LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập hoàn thành luận văn, em nhận giúp đỡ nhiều mặt cấp lãnh đạo, tập thể cá nhân Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Tiến Dũng GS TS Ngơ Xn Bình ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt q trình thực hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm Trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIỂU vii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ảnh hưởng hạn thực vật 1.2 Đáp ứng hạn thực vật 1.3 Nhóm gene chịu hạn AtYUCCA đặc điểm gene chịu hạn AtYUCCA6 11 1.4 Những kết nghiên cứu chuyển gene chịu hạn 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu chuyển gene chịu hạn 13 1.4.2 Những kết nghiên cứu chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 15 1.5 Phương pháp chuyển gene thực vật qua Agrobacterium 16 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, phạm vi, vật liệu nghiên cứu 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 18 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 18 2.3 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 18 2.3.1 Vật liêu nghiên cứu 18 2.3.2 Hóa chất trang thiết bị nghiên cứu 19 iv 2.4 Nội dung nghiên cứu 21 2.4.1 Nội dung 1: Sàng lọc gen chịu hạn AtYUCCA6 21 2.4.2 Nội dung 2: Tách dòng gen AtYUCCA6 21 2.4.3 Nội dung 3: Thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 22 2.4.4 Nội dung 4: Nghiên cứu chuyển gen Arabidopsis thaliana 22 2.5 Phương pháp nghiên cứu 22 2.5.1 Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6 22 2.5.2 Tách dòng gene AtYUCCA6 22 2.5.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6 28 2.5.4 Phương pháp chuyển gen Arabidopsis thaliana 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Phân tích gene AtYUCCA6 sở liệu database 33 3.2 Tách dòng gene AtYUCCA6 34 3.3 Gắn vào vector chuyển gene 39 3.4 Tạo Arabidopsis chuyển gene AtYUCCA6 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ABA : Axit abxixic BR : Brassinosteroid DREB : Dehydration - responsive element binding ERF : Ethylene - responsive factor FMOs : Monooxygenease flavin GPCRs : G-protein-couple receptor IAA : Indole-3-acetic acid PBS : pBluescript) RAV : Related to ABI3/VP1 RLKs : Eceptor-like kinase ROS : Reactive oxygene species T6P : Trehalose - - phosphate Trp : Tryptophan vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Sơ đồ đáp ứng thực vật điều kiện hạn Hình 1.2 Sơ đồ chuyển đổi Trp thành IAA có tham gia YUCs 11 Hình 2.1 Sơ đồ tạo A thaliana chuyển gen 30 Hình 3.1 Vị trí gen AtYUCCA6 (At5g25620) nhiễm sắc thể số 33 Hình 3.2 Cấu trúc gen AtYUCCA6 33 Hình 3.3 Biểu gene AtYUCCA6 Arabidopsis thaliana 34 Hình 3.4 Trình tự vùng mã hóa gen AtYUCCA6 trình tự protein tương ứng 35 Hình 3.5 Hình vẽ cấu trúc vector nhân dòng vector chuyển gene AtYUCCA6 37 Hình 3.6 Kết kiểm tra khuẩn lạc mang gene AtYUCCA6 PCR enzyme giới hạn 38 Hình 3.7 Kết giải trình tự gene tách dòng AtYUCCA6 với cặp mổi ngược M13 38 Hình 3.8 Kết giải trình kiểm tra kết thiết kế vector chuyển gen AtYUCCA6 40 Hình 3.9 Kết phân tích chuyển gen PCR sử dụng cặp mồi AtYUCCA6-F pER8-R 42 vii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Danh mục loại hóa chất sử dụng nghiên cứu 19 Bảng 2.3 Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 24 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 26 Bảng 3.1 Kết chọn lọc chuyển gen AtYUCCA6 môi trường kháng sinh kanamycin 41 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hạn hán yếu tố thách thức an ninh lương thực giới vào kỉ 21 Trong bối cảnh biến đổi khí hậu tồn cầu, Việt Nam, hạn hán xảy ngày thường xuyên hơn, nhiều vùng rộng lớn, với mức độ thời gian khác gây thiệt hại to lớn kinh tế xã hội, đặc biệt sản xuất nông nghiệp Vấn đề trở nên cấp thiết hầu hết đất canh tác bị hạn lại tập trung vùng sâu vùng xa - nơi mà sống người dân nhiều thiếu thốn, chủ yếu dựa vào sản phẩm nơng nghiệp Vì vậy, việc tạo giống trồng chuyển gene có tính chịu hạn cao có ý nghĩa đặc biệt quan trọng việc giữ vững nâng cao suất trồng, góp phần xóa đói giảm nghèo, ổn định xã hội Trong thể thực vật, hạn hán gây nhiều phản ứng, từ việc thay đổi biểu gene, trao đổi chất tế bào thay đổi lớn liên quan đến mức sinh trưởng suất trồng Ở mức độ phân tử, yếu tố môi trường bất lợi làm gia tăng mức độ biểu tích lũy hàng loạt gene đáp ứng điều kiện hạn, bao gồm gene liên quan đến tổng hợp chất điều hòa thẩm thấu, gene mã hóa cho protein, phân tử tín hiệu yếu tố phiên mã [37] Trong đó, yếu tố phiên mã nghiên cứu nhiều hoạt động chúng gây tác động đến biểu hàng loạt đáp ứng với điều kiện bất lợi môi trường AtYUCCA6 gene thuộc họ gene YUCCA mã hóa cho protein nhóm flavin monooxyenases có vai trò quan trọng q trình tổng hợp auxin - hormone sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng tế bào thể thực vật Auxin kích thích phát triển rễ, thúc đẩy hấp thụ vận chuyển nước cây, giúp vượt qua điều kiện hạn hán, bất lợi [30] Nhiều báo Quốc tế có mặt tăng cường biểu gene AtYUCCA6 làm tăng khả chịu hạn thúc đẩy tổng hợp auxin thể thực vật [45, 32] Tuy nhiên, nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu phân lập có hệ thống gene AtYUCCA6 43 PT cho khả chịu hạn cao đối chứng khoảng 12 ngày [30] Tương tự Ke cộng (2015) [31] sử dụng vector pCAMBIA2300 mang promoter cảm ứng SWPA2 để tạo hướng dương chuyển gen AtYUCCA6 Kết cho thấy chuyển gene sinh trưởng nhanh chống chịu với điều kiện hạn đối chứng khoảng ngày Park cộng (2019) [38] tạo đậu tương chuyển gen AtYUCCA6 sử dụng cấu trúc vector pPZP-p35S: AtYUCCA6 cho thấy chuyển gen có khả chịu hạn sau 14 ngày thiếu nước Từ kết nghiên cứu cho thấy gene AtYUCCA6 có khả ứng dụng cao để tạo chuyển gene chịu hạn Trong nghiên cứu thiết kế vector sử dụng promoter định Ubiqutin 14 ( UBQ14) điều khiển gene AtYUCCA6 nhằm ứng dụng tạo chuyển gene chịu hạn Việt Nam Promoter Ubiquitin có vai trò tương tự promoter 35S nhiều nhà khoa học sử dụng nghiên cứu chuyển gen 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Dựa sở liệu database, gen AtYUCCA6 lựa chọn nghiên cứu có kích thước 3719bp, vùng gen mã hóa có chiều dài 1,25kb biểu mạnh quan sinh sản (hoa, hạt phấn) Gen AtYUCCA6 tách dòng thành cơng vector tách dòng pBluescript Kết tách dòng kiểm tra giải trình tự gen đảm bảo độ xác 100% Vector chuyển gene pER8::pUBQ14-AtYUCCA6 thiết kế thành công với promoter UBQ14 gen chọn lọc kanamycin Cấu trúc chuyển gen pER8:pUBQ14-AtYUCCA6 chuyển thành công vào Arabidopsis thaliana Tỷ lệ chuyển gen môi trường kháng kanamycin đạt 18,9% Kiến nghị Cần triển khai tiếp thí nghiệm chuyên gen pUBQ14-AtYUCCA6 mơ hình đánh giá khả biểu gen chuyển AtYUCCA6 sư khiển promoter pUBQ14 điều kiện hạn 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình (2008), Phát triển trồng chuyển gene Việt Nam, Bộ sách chuyên khảo, Nxb Khoa học Cơng nghệ Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu thiệt hại môi trường lúa, Nxb Nông nghiệp Tp.HCM Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Cơng nghệ chuyển gene thực vật, Giáo trình cho Cao học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Như Khanh (2009), Sinh lý thực vật, Nxb Giáo Dục, Hà Nội Trần Thị Phương Liên (1998), “Cơ chế phân tử tính chịu hạn thực vật”, Tạp chí Khoa học Phát triển Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết ứng dụng công nghệ gene chọn tạo giống trồng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Ong Xuân Phong, Nguyễn Văn Mã (2014), Một số biến đổi sinh lý hạt nảy mầm non đậu tương điều kiện nhiệt độ thấp, Tạp chí Khoa học Phát triển, số 7: 1114-1119 Hoàng Minh Tấn (2006), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Đại học Sư Phạm Trần Văn Tựa, Nguyễn Trung Kiên, Đỗ Tuấn Anh, Đặng Đình Kim (2011) Nghiên cứu khả chống chịu hấp thu chì, kẽm Dương xỉ Ptreris vittataL Tạp chí khoa học cơng nghệ 101 - 109 10 Lê Duy Thành (2001) Cơ sở di tryền chọn giống thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 11 Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M (1997) GeneGenGenes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant Plant Cell 9: 841-857 12 Bartels, D and Sunkar R (2005) Drought and salt tolerance in plants, Critical reviews in plant sciences, 24 (1), pp 23-58 46 13 Bhargava, S and Sawant K.(2013) Drought stress adaptation: metabolic adjustment and regulation of genegengene expression Plant Breeding, 132 (1), pp 21-32 14 Blum, A.(2005) Drought resistance, water-use efficiency, and yield potential—are they c ompatible, dissonant, or mutually exclusive, Crop and Pasture Science, 56 (11), pp 1159-1168 15 Collins W K; Hawks S N.Jr, (1993) Principles of hte Flue - cured Tobaco Production N.C State Univesity 2nd Ed 300 16 Cha, J.-Y et al (2015).A novel thiol-reductase activity of Arabidopsis ATYUCCA6 confers drought tolerance independently of auxin biosynthesis.nature Commun 6: 8041 doi: 10.1038 / ncomms9041 17 Chaves, M., Flexas J., and Pinheiro C (2009) Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell, Annals of botany, 103 (4), pp 551-560 18 Davis D L.; Nielsen M T (1999).Tobaco Production, Chemistry and technology B Blackwell Science 467 19 Ding Z S., Zhao M., Jing Y X., Li L B and Kuang T Y (2006) “EfficientAgrobacterium, Mediated transformation of Rice by Phosphomannose Isomerase/Mannose selection”,Plant Molecular Biology Reporter, (24), pp.29)5-303 20 Ditt R F., Nester E W and Comai L (2005) The plant cell defense andAgrobacterium tumefaciens.FEMS Microbiology letters, 247, pp 207-213 21 Feng, J.-X., Liu D., et al (2005).An annotation update via cDNA sequence analysis and comprehensive profiling of developmental, hormonal or environmental responsiveness of the Arabidopsis AP2/EREBP transcription factor genegengene family, Plant molecular biology, 59 (6), pp 853-868 22 Gelvin S B (2003).“Agrobacterium - mediated plant transformation the biology behind the “GeneGenGene - jockeying” Tool”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 67 (1), pp.16-37 47 23 Guo, H and Ecker J.R (2004) The ethylene signaling pathway: new insights, Current opinion in plant biology, (1), pp 40-49 24 Hao, D., Ohme-Takagi M., and Sarai A.(1998) Unique mode of GCC box recognition by the DNA-binding domain of ethylene-responsive elementbinding factor (ERF domain) in plant, Journal of Biological Chemistry, 273 (41), pp 26857-26861 25 Harb, A., Krishnan A., Ambavaram M.M., and Pereira A (2010) Molecular and physiological analysis of drought stress in Arabidopsis reveals early responses leading Plant Physiol, pp 1254 - 1271 26 Hayano-Kanashiro, C., Calderón-Vázquez C., Ibarra-Laclette E., HerreraEstrella L., and Simpson J.(2009) Analysis of genegengene expression and physiological responses in three Mexican maize landraces under drought stress and recovery irrigation, PLoS One, (10), pp e7531 27 Jeong Im Kim , ( 2011) YUCCA6 over-expression demonstrates auxin function in delaying leaf senescence in Arabidopsis thaliana J Exp Bot 21/4/2011 28 K S Mysore, R P Tuori, and G.B, Martin (2001).Arabidopsis gengeneome sequence as a tool for functional gengeneomics in tomato, GenGeneome Biol 1086 - 1186 29 Kaspar TC, Taylor HM and Shibles RM(1984) Taproot elongation rates of Soybean cultivars in the glasshouse and their relatio to field rooting depth Crop Sci 24: 916 - 920 30 Kepinski S Leyser O (2005) The Arabidopsis F-box protein TIR1 is an auxin receptor Nature 435: 446-451 31 Kim, J.I, Baek, D, Park, H.C, Chun, H.J, Oh, D.H, Lee, M.K, Cha, J.Y, Kim, W.Y, Kim, M.C, Chung, W.S, Bohnert, H.J, Lee, S.Y, Bressan, R.A, Lee, S.W, Yun, D.J (2013) Overexpression of Arabidopsis YUCCA6 in potato results in high-auxin developmental phenotypes and enhanced resistance to water deficit Mol Plant.6(2):337-349 48 32 Kim, J.I., Sharkhuu, A., Jin, J.B., Li, P., Jeong, J.C., Baek, D., Lee, S.Y., Blakeslee, J.J., Murphy, A.S., Bohnert, H.J., et al (2007) yucca6, a dominant mutation in Arabidopsis, affects auxin accumulation and auxin-related phenotypes Plant Physiol 145, 722-735 33 Le, M.Q., Pagter M., and Hincha D.K (2015) Global changes in genegengene expression, assayed by microarray hybridization and quantitative RTPCR, during acclimation of three Arabidopsis thaliana accessions to sub-zero temperatures after cold acclimation, Plant molecular biology, 87 (1-2), pp 134 Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M (2011) Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in Arabidopsis Planta 235, 923-938 35 Lee, M., Jung, J.H., Han, D.Y., Seo, P.J., Park, W.J., and Park, C.M (2011) Activation of a flavin monooxygenase gene YUCCA7 enhances drought resistance in Arabidopsis Planta 235, 923-938 36 Mashiguchia, K., Tanaka, K., Sakaic, T., Sugawaraa, S., Kawaideb, H., Natsumeb, M., Hanadaa, A., Yaenoa, T., Shirasua, K., Yaod, H., et al (2011) The main auxin biosynthesis pathway in Arabidopsis Proc Natl Acad Sci U S A 108, 18512-18517 37 Paponov, I.A, Teale, W.D, Trebar, M., Blilou I., Palme, K (2005) The PIN auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives Trends Plant Sci 10: 170-177 38 Park, J.S, Kim, H.J, Cho, H.S, Jung, H.W, Cha, J.Y, Yun, D.J, Oh, S.W, Chung, Y.S (2019) Overexpression of AtYUCCA6 in soybean crop results in reduced ROS production and increased drought tolerance Plant Biotech Rep (13), 161-168 39 Ross, J.J., Tivendale, N.D., Reid, J.B., Davies, N.W., Molesworth, P.P., Lowe, E.K., Smith, J.A., and Davidson, S.E (2011) Reassessing the role of YUCCAs in auxin biosynthesis Plant Signal Behav 6, 437-439 49 40 Van der Graaff, E., Boot, K., Granbom, R., Sandberg, G., and Hooykaas, P.J.J (2003) Increased endogenous auxin production in Arabidopsis thaliana causes both earlier described and novel auxin-related phenotypes J Plant Growth Regul 22, 240-252 41 Won, C., Shen, X., Mashiguchi, K., Zheng, Z., Dai, X., Cheng, Y., Kasahara, H., Kamiya, Y., Chory, J., and Zhao, Y (2011) Conversion of tryptophan to indole-e-acetic acid by Tryptophan aminotransferases of Arabidopsis and YUCCAs in Arabidopsis Proc Natl Acad Sci U S A 108, 18518-18523 42 Woo, Y., Park, H., Su’udi, M., Yang, J., Park, J., Back, K., Park, Y., and An, G (2007) Constitutively wilted 1, a member of the rice YUCCA gene family, is required for maintaining water homeostasis and an appropriate root to shoot ratio Plant Mol Biol 65, 125-136 43 Yunde zhao (2014), Auxin biosynthesis, Arabidopsis book 44 Zhao, Y (2012) Auxin biosynthesis: a simple two-step pathway converts tryptophan to indole-3-acetic acid in plants Mol.Plant 5, 334-338 45 Zhao, Y., Christensen, S.K., Fankhauser, C., Cashman, J.R., Cohen, J.D., Weigel, D., and Chory, J (2001) A role for flavin monooxygenase-like enzymes in auxin biosynthesis Science 291,306-309 50 PHỤ LỤC 51 52 53 54 55 56 57 ... thống gene AtYUCCA6 2 Xuất phát từ lý trên, thực đề tài Tách dòng thiết kế vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 từ Arabidopsis thaliana Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tách dòng thiết kế thành... Sàng lọc gene chịu hạn AtYUCCA6 22 2.5.2 Tách dòng gene AtYUCCA6 22 2.5.3 Phương pháp thiết kế vector chuyển gene AtYUCCA6 28 2.5.4 Phương pháp chuyển gen Arabidopsis thaliana. .. kế thành công vector chuyển gene chịu hạn AtYUCCA6 - Nghiên cứu chuyển gene đánh giá biểu gene Arabidopsis thaliana Đối tượng nghiên cứu - Gen chịu hạn AtYUCCA6 từ Arabidopsis thaliana Ý nghĩa