NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Ngọc Quỳnh NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hướng dẫn: TS Lê Tiến Dũng PGS TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội  2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Tiến Dũng PGS.TS Nguyễn Quang Huy, người Thầy tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập, nghiên cứu khoa học thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình giảng dạy, dìu dắt thời gian học tập Trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán học viên Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp hết lòng giúp đỡ thực thành công luận văn Cuối cùng, không phần quan trọng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên, giúp đỡ chỗ dựa vững cho thời gian qua Luận văn thực khuôn khổ đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine vai trò enzyme methionine sulfoxide reductase nông nghiệp” Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46 Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Lê Thị Ngọc Quỳnh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các ROS thể sinh học Bảng 1.2 Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi 12 Bảng 1.3 Số lượng gen MsrA MsrB số nhóm sinh vật 17 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 2.3 Trình tự số yếu tố điều hòa cis điều hòa biểu gen đáp ứng với điều kiện bất lợi 27 Bảng 3.1 Phân loại chức gen mã hóa MRP Arabidopsis theo MAPMAN 31 Bảng 3.2 Các MRP dự đoán có đích tác động ty thể lục lạp 35 Bảng 3.3 Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán độ mặn cao 38 Bảng 3.4 Kết phân loại chức gen MAPMAN gen đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi 41 Bảng 3.5 Một số yếu tố cis có mặt promoter gen AtMRP 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Quá trình sinh tổng hợp Methionine Hình 1.2 Sự tạo thành Met sulfoxide Met sulfone từ Met 13 Hình 1.3 Phản ứng khử MetO Met Msr 16 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm sử dụng nghiên cứu 25 Hình 3.1 Sự phân bố gen mã hóa MRP trình sinh học khác Arabidopsis 31 Hình 3.2 Phân loại chức gen AtMRP theo trình sinh học 32 Hình 3.3 Phân loại chức gen AtMRP theo thành phần tế bào 33 Hình 3.4 Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức phân tử 33 Hình 3.5 Dự đoán vị trí MRP tế bào Arabidopsis thaliana phần mềm ChloroP, pSORT CELLO 34 Hình 3.6 Dự đoán vị trí MRP tế bào Arabidopsis thaliana phần mềm Blast2GO 36 Hình 3.7 Biểu đồ Venn thể số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng giảm gấp lần điều kiện chịu mặn hạn hán 37 Hình 3.8 Số lượng gen AtMRP có chứa yếu tố cis khác 44 Hình 3.9 Dòng RBC1 nảy mầm, A môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B môi trường ½ MS đặc 45 Hình 3.10 Hình thái dòng RBC1 đối chứng kiểu dại đĩa thạch 46 Hình 3.11 Hình thái dòng RBC1 đối chứng giá thể đất 48 Hình 3.12 Đĩa thạch mang RBC1 kiểu dại môi trường ½ MS 50 Hình 3.13 Thử nghiệm chịu mặn dòng đối chứng dòng RBC1 51 Hình 3.14 Thử nghiệm cadmium dòng đối chứng dòng RBC1 52 Hình 3.15 Thử nghiệm paraquat dòng đối chứng dòng RBC1 54 BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt, Tiếng Anh kí hiệu ABA Abscisic acid ABRE ABA responsive element Arabidopsis thaliana AtMRP Methionine-rich protein ATP Adenosine triphosphate bHLH basic Helix loop helix bZIP Basic region-leucine zipper subCELlular LOcalization CELLO predictor Cystathionine gammaCgS synthase cs Full-length cDNA OverFOX eXpressing Induction of CBF ICEr2 Expression region Met Methionine MetO Methionine sulfoxide MetO2 Methionine sulfone MRP Methionine-rich protein MS Murashige & Skoog Methionine sulfoxide Msr reductase OPH O-phosphohomoserine PCR Polymerase Chain Reaction PEL Pseudo-Etiolation in Light Protein Subcellular PSORT lOcalization pRedicTion RBC1 RIKEN Bioresource Center ROS Reactive oxygen species Rapid Stress Response Element S - Adenosyl Methionine Threonine synthase RSRE SAM TS Tiếng Việt Axit abscisic Yếu tố đáp ứng ABA Protein giàu Methionin Arabidopsis thaliana Adenosin triphotphat Cấu trúc xoắn vòng xoắn Khóa kéo vùng leucine Dự đoán vị trí cư trú tế bào Cystathionin gamma-synthaza Cộng Biểu mức cDNA hoàn chỉnh Vùng biểu cảm ứng CBF Methionin Methionin sufoxit Methionin sulfone Protein giàu methionin Môi trường MS Methionin sulfoxit reductaza O-phosphohomoserine Phản ứng chuỗi trùng hợp Sự giả vàng úa ánh sáng Dự đoán vị trí cư trú protein tế bào Dòng chuyển gen từ TT Tài nguyên Sinh học RIKEN Các dạng oxy phản ứng Yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện lạnh S - Adenosyl Methionine Threonine synthaza MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Methionine protein giàu Methionine 1.1.1 Tổng quan chung Methionine 1.1.2 Các protein giàu Methionine 1.2 Quá trình oxy hóa sửa chữa oxy hóa Methionine 1.2.1 Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo dạng oxy phản ứng 1.2.2 Quá trình oxy hóa Methionine dạng oxy phản ứng 12 1.2.3 Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine 15 1.3 Tình hình nghiên cứu protein có methionine mẫn cảm với dạng oxy phản ứng 19 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 19 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 21 Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 2.1 Vật liệu 23 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 23 2.1.2 Hóa chất 23 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp tiếp cận tin sinh học 24 2.2.2 Phương pháp tiếp cận thực nghiệm 28 Chương – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Phân tích tin sinh học cho gen mã hóa MRP 30 3.1.1 Tìm kiếm xác định gen mã hóa MRP Arabidopsis 30 3.1.2 Đánh giá biểu gen mã hóa MRP Arabidopsis điều kiện thường điều kiện bất lợi 37 3.1.3 Dự đoán yếu tố điều hòa cis promoter gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi 41 3.2 Phân tích thực nghiệm Arabidopsis tăng cường biểu gen At3G55240 (dòng RBC1) 44 3.2.1 Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử dòng chuyển gen 44 3.2.2 Đánh giá hình thái dòng chuyển gen 45 3.2.3 Đánh giá đáp ứng dòng chuyển gen với điều kiện bất lợi 49 KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Tài liệu tiếng Việt 59 Tài liệu tiếng Anh 59 PHỤ LỤC i MỞ ĐẦU Ở thực vật, hình thành loại bỏ dạng oxy phản ứng (ROS) kiểm soát chặt chẽ thông qua đường dẫn truyền tín hiệu Tuy nhiên, tình trạng môi trường bất lợi, nồng độ ROS tăng lên cách đột ngột kiểm soát, gây tổn thương cho chất phân tử lớn tế bào lipit, protein, axit nucleic dẫn đến giảm tuổi thọ sức sống sinh vật Các dạng oxy phản ứng ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng tế bào thông qua nhiều trình khác nhau, bao gồm oxy hóa Methionine (Met), axit amin chứa lưu huỳnh có mặt phân tử protein, tạo thành Met sulfoxide (MetO) Đây nguyên nhân gây hoạt tính, khả điều hòa trao đổi chất protein, dẫn đến làm giảm sức đề kháng, giảm sức sống trồng Trong thể sinh vật, MetO sửa chữa enzyme Methionine sulfoxide reductase (Msr) Quá trình sửa chữa tạo tác động tích cực, đặc biệt tăng khả đề kháng cao, chống lại oxy hóa gây điều kiện bất lợi từ môi trường thực vật Nghiên cứu trình oxy hóa Met sửa chữa MetO thông qua hiểu biết protein giàu Met đích tác động Msr cho phép tiếp cận vấn đề này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển giống trồng có khả chống chịu với điều kiện bất lợi Tuy nhiên, protein giàu Met chưa công bố cách hệ thống nghiên cứu nước Xuất phát từ lý trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò protein giàu methionine Arabidopsis thaliana” Luận văn nằm khuôn khổ đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu protein mẫn cảm với oxy hóa methionine vai trò enzyme methionine sulfoxide reductase nông nghiệp” Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ Chương 1- TỔNG QUAN 1.1 Methionine protein giàu Methionine 1.1.1 Tổng quan chung Methionine Methionine (Met) α – axit amin chứa lưu huỳnh, sử dụng nhiều đường chuyển hóa tế bào thành phần cấu tạo nên protein, ba mở đầu (AUG) mã hóa cho tín hiệu bắt đầu trình sinh tổng hợp chuỗi polypeptide Ngoài Met đóng vai trò phân tử tham gia vào trình điều hòa thông qua dạng dẫn xuất S - Adenosyl Methionine (SAM) [40] SAM đóng vai trò chìa khóa cho nhiều đường chuyển hóa khác thông qua việc cung cấp nhóm methyl (-CH3) tế bào Bên cạnh đó, SAM tiền chất cho hợp chất chuyển hóa như: ethylene (CH2=CH2) - hormone quan trọng liên quan đến kiểm soát nhiều trình thực vật làm chín già hóa, vitamin B1, 3dimethylsulphoniopropionate (chất bảo vệ thẩm thấu, giúp thực vật chống lại điều kiện bất lợi thẩm thấu), đóng vai trò nguồn sulfur khí quyển: dimethylsulphide [8] SAM hợp chất cung cấp nhóm propyl amin cho trình sinh tổng hợp polyamine, spermidine, spermine, chất đóng vai trò định cho trình phát triển thực vật bao gồm tăng trưởng biệt hóa tế bào, tế bào chết theo chương trình (apoptosis), cân nội môi điều hòa biểu gen [7] Dẫn xuất Met, S-methylmethionine, sử dụng phân tử vận chuyển để giảm lượng sulfur số loài động vật, hợp chất liên quan đến việc hình thành dạng lưu động dạng dự trữ Met [14] Met axit amin thiết yếu, cung cấp thông qua thức ăn động vật không nhai lại Động vật có vú nói chung người nói riêng tổng hợp khoảng nửa số axit amin tổng số 20 axit amin cấu tạo nên protein Do đó, axit amin tổng hợp cần phải bổ sung qua chế độ ăn uống Cây trồng phổ biến ngũ cốc (lúa, gạo ) loại đậu thường có hàm lượng Met thấp [40] Ở nước phát triển, cải thiện chất lượng dinh dưỡng cách để giải nhiều vấn đề mà thức ăn có nguồn gốc từ thực vật nguồn cung cấp protein chủ yếu cho người cho gia súc gia cầm Để giải nhu cầu cung cấp axit amin thiết yếu thức ăn chăn nuôi, phụ gia thêm vào sử dụng đa dạng nguồn thực vật Do đó, nâng cao hàm lượng axit amin thiết yếu trồng nông nghiệp mong muốn nhiều nhà nghiên cứu, người chăn nuôi người tiêu dùng [29] Met, axit amin chứa sulfur (methionine cysteine) axit amin khác lysine, threonine isoleucine tổng hợp từ họ aspartate Aspartate kinase enzyme đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine, threonine, Met isoleucine Enzyme xúc tác trình phosphoryl hóa aspartate cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate [77] Thông thường, có hai dạng aspartate kinase tìm thấy thực vật β-aspartyl phosphate chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde sau homoserine, xúc tác tương ứng aspartic semialdehyde dehydrogenase homoserine kinase Trong vi khuẩn nấm, homoserine điểm trung gian tạo thành threonine Met [77] Tuy nhiên, thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine sinh tổng hợp Met Ophosphohomoserine (OPH), chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS) cystathionine gamma-synthase (CgS) OPH chuyển hóa trực tiếp thành threonine tham gia TS tham gia vào chế ba bước để tạo thành Met: phản ứng trùng ngưng cysteine OPH tạo thành cystathionine, sau thành homocysteine cuối thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine βlyase homocysteine methyltransferase [40] (Hình 1.1) Cuối cùng, có khoảng 20% Met sử dụng làm thành phần tạo nên protein, có đến 80% Met biến đổi để tạo thành SAM, sản phẩm cuối đường sinh tổng hợp Met [32] 55 Lee, B.C., Dikiy, A., Kim, H.-Y., Gladyshev, V.N (2009), "Functions and evolution of selenoprotein methionine sulfoxide reductases", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1790(11): 1471-1477 56 Li, C.-W., Lee, S.-H., Chieh, P.-S., Lin, C.-S., Wang, Y.-C., Chan, M.-T (2012), "Arabidopsis root-abundant cytosolic methionine sulfoxide reductase B genes MsrB7 and MsrB8 are involved in tolerance to oxidative stress", Plant and Cell Physiology, 53(10): 1707-1719 57 Liang, X., Kaya, A., Zhang, Y., Le, D.T., Hua, D., Gladyshev, V.N (2012), "Characterization of methionine oxidation and methionine sulfoxide reduction using methionine-rich cysteine-free proteins", BMC Biochemistry, 13(1): 21 58 Liu, L., Zhang, Z., Mei, Q., Chen, M (2013), "PSI: a comprehensive and integrative approach for accurate plant subcellular localization prediction", Plos One, 8(10): e75826 59 Ma, J., Hanssen, M., Lundgren, K., Hernández, L., Delatte, T., Ehlert, A., Liu, C.M., Schluepmann, H., Dröge‐Laser, W., Moritz, T (2011), "The sucrose‐ regulated Arabidopsis transcription factor bZIP11 reprograms metabolism and regulates trehalose metabolism", New Phytologist, 191(3): 733-745 60 Masumura, T., Shibata, D., Hibino, T., Kato, T., Kawabe, K., Takeba, G., Tanaka, K., Fujii, S (1989), "cDNA cloning of an mRNA encoding a sulfurrich 10 kDa prolamin polypeptide in rice seeds", Plant Molecular Biology, 12(2): 123-130 61 Mittler, R., Feng, X., Cohen, M (1998), "Post-transcriptional suppression of cytosolic ascorbate peroxidase expression during pathogen-induced programmed cell death in tobacco", The Plant Cell, 10(3): 461-473 62 Mittler, R., Herr, E.H., Orvar, B.L., Van Camp, W., Willekens, H., Inzé, D., Ellis, B.E (1999), "Transgenic tobacco plants with reduced capability to detoxify reactive oxygen intermediates are hyperresponsive to pathogen infection", Proceedings of the National Academy of Sciences, 96(24): 1416514170 65 63 Moskovitz, J., Weissbach, H., Brot, N (1996), "Cloning the expression of a mammalian gene involved in the reduction of methionine sulfoxide residues in proteins", Proceedings of the National Academy of Sciences, 93(5): 2095-2099 64 Nishiyama, R., Le, D.T., Watanabe, Y., Matsui, A., Tanaka, M., Seki, M., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., Tran, L (2012), "Transcriptome analyses of a salt-tolerant cytokinin-deficient mutant reveal differential regulation of salt stress response by cytokinin deficiency", Plos One, 7(2): e32124 65 Nishiyama, R., Watanabe, Y., Leyva-Gonzalez, M.A., Van Ha, C., Fujita, Y., Tanaka, M., Seki, M., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K., HerreraEstrella, L (2013), "Arabidopsis AHP2, AHP3, and AHP5 histidine phosphotransfer proteins function as redundant negative regulators of drought stress response", Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(12): 4840-4845 66 Pedersen, K., Argos, P., Naravana, S., Larkins, B.A (1986), "Sequence analysis and characterization of a maize gene encoding a high-sulfur zein protein of Mr 15,000", Journal of Biological Chemistry, 261(14): 6279-6284 67 Penfield, S., Josse, E.-M., Halliday, K.J (2010), "A role for an alternative splice variant of PIF6 in the control of Arabidopsis primary seed dormancy", Plant molecular biology, 73(1-2): 89-95 68 Reddy, V., Pizzo, S.V., Weiss, S (1989), "Functional inactivation and structural disruption of human alpha 2-macroglobulin by neutrophils and eosinophils", Journal of Biological Chemistry, 264(23): 13801-13809 69 Reddy, V.Y., Desorchers, P., Pizzo, S.V., Gonias, S.L., Sahakian, J.A., Levine, R.L., Weiss, S.J (1994), "Oxidative dissociation of human alpha 2macroglobulin tetramers into dysfunctional dimers", Journal of Biological Chemistry, 269(6): 4683-4691 66 70 Rinalducci, S., Murgiano, L., Zolla, L (2008), "Redox proteomics: basic principles and future perspectives for the detection of protein oxidation in plants", Journal of Experimental Botany, 59(14): 3781-3801 71 Rosen, H., Klebanoff, S.J., Wang, Y., Brot, N., Heinecke, J.W., Fu, X (2009), "Methionine oxidation contributes to bacterial killing by the myeloperoxidase system of neutrophils", Proceedings of the National Academy of Sciences, 106(44): 18686-18691 72 Sadanandom, A., Poghosyan, Z., Fairbairn, D.J., Murphy, D.J (2000), "Differential regulation of plastidial and cytosolic isoforms of peptide methionine sulfoxide reductase in Arabidopsis", Plant Physiology, 123(1): 255264 73 Saito, K (2000), "Regulation of sulfate transport and synthesis of sulfurcontaining amino acids", Current Opinion Plant Biology, 3(3): 188-95 74 Shechter, Y (1986), "Selective oxidation and reduction of methionine residues in peptides and proteins by oxygen exchange between sulfoxide and sulfide", Journal of Biological Chemistry, 261(1): 66-70 75 Shechter, Y., Burstein, Y., Patchornik, A (1975), "Selective oxidation of methionine residues in proteins", Biochemistry, 14(20): 4497-4503 76 Shewry, P (2002), "The Major Seed Storage Proteins of Spelt Wheat, Sorghum, Millets and Pseudocereals", in Pseudocereals and Less Common Cereals, Springer Berlin Heidelberg, 1: 1-24 77 Singh, B.K (2000), "Plant Amino Acids: Biochemistry and Biotechnology", Biologia Plantarum, 43(3): 358-359 78 Snijder, J., Rose, R.J., Raijmakers, R., Heck, A.J (2011), "Site-specific methionine oxidation in calmodulin affects structural integrity and interaction with Ca 2+/calmodulin-dependent protein kinase II", Journal of Structural Biology, 174(1): 187-195 67 79 Stadtman, E.R., Moskovitz, J., Berlett, B.S., Levine, R.L (2002), "Cyclic oxidation and reduction of protein methionine residues is an important antioxidant mechanism", Molecular and Cellular Biochemistry, 234(1): 3-9 80 Sundby, C., Härndahl, U., Gustavsson, N., Åhrman, E., Murphy, D.J (2005), "Conserved methionines in chloroplasts", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics, 1703(2): 191-202 81 Takahashi, F., Mizoguchi, T., Yoshida, R., Ichimura, K., Shinozaki, K (2011), "Calmodulin-dependent activation of MAP kinase for ROS homeostasis in Arabidopsis", Molecular Cell, 41(6): 649-660 82 Tamura, K., Dudley, J., Nei, M., Kumar, S (2007), "MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0", Molecular Biology and Evolution, 24(8): 1596-1599 83 Tarrago, L.,Gladyshev, V (2012), "Recharging oxidative protein repair: catalysis by methionine sulfoxide reductases towards their amino acid, protein, and model substrates", Biochemistry (Moscow), 77(10): 1097-1107 84 Tarrago, L., Kieffer-Jaquinod, S., Lamant, T., Marcellin, M., Garin, J., Rouhier, N., Rey, P (2012), "Affinity chromatography: a valuable strategy to isolate substrates of methionine sulfoxide reductases?", Antioxidants & Redox Signaling, 16(1): 79-84 85 Thimm, O., Bläsing, O., Gibon, Y., Nagel, A., Meyer, S., Krüger, P., Selbig, J., Müller, L.A., Rhee, S.Y., Stitt, M (2004), "Mapman: a user‐driven tool to display genomics data sets onto diagrams of metabolic pathways and other biological processes", The Plant Journal, 37(6): 914-939 86 Tuteja, N (2007), "Mechanisms of High Salinity Tolerance in Plants", Methods in Enzymology, 428: 419-438 87 Valley, C.C., Cembran, A., Perlmutter, J.D., Lewis, A.K., Labello, N.P., Gao, J., Sachs, J.N (2012), "The methionine-aromatic motif plays a unique role in stabilizing protein structure", Journal of Biological Chemistry, 287(42): 3497934991 68 88 Waszczak, C., Akter, S., Eeckhout, D., Persiau, G., Wahni, K., Bodra, N., Van Molle, I., De Smet, B., Vertommen, D., Gevaert, K (2014), "Sulfenome mining in Arabidopsis thaliana", Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(31): 11545-11550 89 Wong, H.L., Sakamoto, T., Kawasaki, T., Umemura, K., Shimamoto, K (2004), "Down-regulation of metallothionein, a reactive oxygen scavenger, by the small GTPase OsRac1 in rice", Plant Physiology, 135(3): 1447-1456 90 Yamaguchi-Shinozaki, K.,Shinozaki, K (2005), "Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic-and cold-stress-responsive promoters", Trends in Plant Science, 10(2): 88-94 91 Yang, H., Yang, S., Li, Y., Hua, J (2007), "The Arabidopsis BAP1 and BAP2 genes are general inhibitors of programmed cell death", Plant Physiology, 145(1): 135-146 92 Yu, C.S., Chen, Y.C., Lu, C.H., Hwang, J.K (2006), "Prediction of protein subcellular localization", Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 64(3): 643-651 93 Zeh, M., Casazza, A.P., Kreft, O., Roessner, U., Bieberich, K., Willmitzer, L., Hoefgen, R., Hesse, H (2001), "Antisense inhibition of threonine synthase leads to high methionine content in transgenic potato plants", Plant Physiology, 127(3): 792-802 69 PHỤ LỤC Danh sách gen mã hóa MRP hệ gen Arabidopsis thaliana kết phân tích microarray thể thay đổi mức độ phiên mã gen AtMRP kiểu dại điều kiện hạn hán chịu mặn Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả Nhân tố tương tác với GRF2 At1G01160.1 7.22 14 195 1,799 -1,091 At1G06960.3 6.03 12 200 - - Ribonucleoprotein nhân / protein tham gia ghép nối At1G10586.2 6.06 133 - - Điều hòa trình phiên mã At1G10590.3 6.58 10 153 - - Protein liên kết DNA At1G15310.1 6.28 30 479 17,547 -1,251 Tương tác với peptide tín hiệu; Liên kết với RNA7S/GTP/mRNA At1G16225.1 6.57 13 199 -1,630 -2,339 Tương tự họ protein liên quan với syntaxin At1G16240.1 6.93 16 232 1,703 -1,095 Protein syntaxin At1G20790.1 7.14 31 435 1,426 -1,109 Protein F-box At1G21940.1 6.04 11 183 -1,494 1,507 Protein chưa biết 10 At1G22590.1 6.45 125 -3,955 -1,594 Nhân tố phiên mã AGL87 i Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 11 At1G30473.1 7.98 19 239 2,221 1,237 Liên kết với ion kim loại 12 At1G32560.1 6.02 134 135,330 3,312 Protein chứa vùng LEA nhóm 1, có nhiều giai đoạn phát sinh phôi muộn 13 At1G33820.1 16.02 29 182 4,431 -1,021 Protein chưa biết 14 At1G33860.1 8.55 13 153 2,370 2,157 Protein chưa biết 15 At1G40104.1 6.81 42 618 - - Protein chưa biết 16 At1G43320.1 7.69 118 1,588 -1,085 Protein chưa biết 17 At1G47389.1 6.28 15 240 - - Protein chưa biết 18 At1G48900.1 6.68 33 495 1,521 -1,108 Protein có tiểu phần 54 kDa nhận biết tín hiệu 19 At1G49800.1 6.54 108 2,291 -1,055 Protein chưa biết 20 At1G52415.1 6.09 116 1,746 -1,204 protein vận chuyển lipit/ 2S albumin protein dự trữ hạt 21 At1G56085.1 6.58 10 153 2,031 1,269 Protein chưa biết 22 At1G63055.1 6.48 109 1,411 2,766 Protein chưa biết 23 At1G63057.1 7.83 116 - - Protein chưa biết ii Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 24 At1G63800.1 6.52 12 185 -1,054 -3,558 Ubiquitin ligase (UBC5) 25 At1G64405.1 6.84 118 -9,615 -1,177 Protein chưa biết 26 At1G64690.1 6.25 17 273 1,287 -1,190 Protein chưa biết 27 At1G67350.1 6.15 131 -1,030 -1,207 Protein chưa biết 28 At1G67870.1 7.91 22 279 1,228 -4,102 Protein giàu glycine 29 At1G68160.1 6.62 18 273 1,646 -1,187 Protein chưa biết 30 At1G68240.1 6.52 12 185 -1,824 -2,767 Nhân tố phiên mã 31 At1G72510.1 6.1 10 165 -1,565 1,009 Protein chưa biết 32 At1G76640.1 7.59 12 159 -28,693 1,084 Protein liên quan calmodulin 33 At1G77682.1 6.73 105 1,498 -1,061 Protein kháng khuẩn thionin 34 At2G06530.1 6.25 14 225 2,185 1,180 Protein chưa biết 35 At2G07708.1 6.43 141 -1,403 -2,045 Protein chưa biết 36 At2G17190.1 6.7 36 538 1,554 -1,034 Thuộc họ protein ubiquitin 37 At2G17200.1 6.18 34 551 1,172 1,180 Thuộc họ protein ubiquitin 38 At2G21100.1 6.99 13 187 2,135 -1,555 Protein tham gia kháng bệnh, liên quan đến sinh tổng hợp lignan iii Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 39 At2G21655.1 7.1 11 156 1,576 -1,090 Protein chưa biết 40 At2G21727.1 6.67 10 151 1,913 1,303 Protein liên quan đến hình thành giao tử ECA1 41 At2G26975.1 6.94 10 145 -1,830 -1,342 Protein vận chuyển ion Cu 42 At2G27030.2 6.25 113 1,335 -1,557 Protein liên kết với ion Ca (calmodulin5) 43 At2G27050.1 6.17 36 584 -1,442 1,098 Một nhân tố phiên mã không nhạy cảm với ethylene (EIL1) 44 At2G28610.1 6.17 15 244 -1,247 2,205 Protein điều tiết trình phát triển cân xứng trục hoa Arabidopsis 45 At2G36355.2 6.25 113 -1,292 -1,251 Protein chưa biết 46 At2G36930.1 6.09 12 198 -1,820 1,065 Protein ngón tay kẽm (loại C2H2) 47 At2G37410.1 8.26 20 243 1,224 1,417 Là translocase xúc tác cho trình vận chuyển ty thể 48 At2G41780.1 6.35 127 1,101 -1,468 Protein chưa biết 49 At2G46600.1 8.21 11 135 -1,019 -2,458 Protein liên kết với ion Ca 50 At3G05220.1 8.33 48 577 -4,137 1,072 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng 51 At3G06130.1 6.14 29 473 -300,37 -1,331 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng iv Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả mã hóa cho peroxin 13 (PEX13) bao gồm vận chuyển protein đến peroxisome 52 At3G07560.1 7.26 22 304 1,444 1,235 53 At3G10640.2 6.51 11 170 - - 54 At3G11160.1 6.94 10 145 3,511 -1,599 Protein chưa biết 55 At3G11530.1 6.25 113 1,714 -1,496 Protein nằm không bào với số 55 (VPS 55), protein vận chuyển 56 At3G11825.1 6.06 100 1,711 -1,085 Ức chế protease/protein dự trữ hạt/protein vận chuyển lipid 57 At3G13227.1 6.36 111 1,165 2,764 Protein giàu serine 58 At3G16960.1 6.19 114 2,542 -1,191 Tương tự với protein liên quan đến tính bất tự hợp Arabidopsis 59 At3G18540.1 6.74 18 268 -1,621 -1,095 Protein chưa biết 60 At3G20557.1 6.2 130 1,507 -8,907 Protein chưa biết 61 At3G23050.1 6.2 15 243 -3,558 -1,744 Nhân tố phiên mã đóng vai trò chất kìm hãm biểu gen cảm ứng auxin 62 At3G28190.1 8.11 112 1,291 -1,046 Protein chưa biết 63 At3G28990.1 8.77 10 88 -1,103 -1,063 Protein chưa biết v Protein nằm không bào với số 60.1 Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 64 At3G29070.1 7.59 17 225 1,523 -1,324 Protein vận chuyển xuyên màng 65 At3G30845.1 8.65 105 1,900 -1,028 Protein chưa biết 66 At3G43410.1 7.44 122 1,472 -1,087 Protein chưa biết 67 At3G44935.1 7.34 110 1,525 -1,197 Protein chưa biết 68 At3G46900.1 7.01 11 158 -4,507 -1,494 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng COPT2 69 At3G49270.3 7.28 11 152 - - 70 At3G50330.1 7.39 17 231 1,328 -1,003 Là nhân tố phiên mã liên kết với vùng DNA đặc hiệu HEC2 (HECATE 2) 71 At3G50360.1 6.55 11 169 3,116 1,194 Protein liên kết với ion Ca ATCEN2 (Centrin2) 72 At3G50890.1 6.45 16 249 -2,.608 -1,669 Là nhân tố phiên mã liên kết với vùng DNA đặc hiệu 73 At3G51920.1 7.33 11 151 -1,387 1,414 Protein liên kết với ion Ca (calmodulin 9) 74 At3G52270.1 6.64 19 287 -1,127 -1,466 Nhân tố phiên mã RNA polymerase II 75 At3G55240.1 6.12 95 -60,288 -26,876 Biểu mức dẫn đến kiểu hình “giả vàng úa điều kiện ánh sáng” vi Protein chưa biết Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 76 At3G56610.1 7.09 128 1,129 -1,230 Protein chưa biết 77 At3G59900.1 6.2 130 10,699 -2,570 Protein chưa biết 78 At3G62090.1 6.38 22 346 64,561 2,277 nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến yếu tố MYC 79 At3G62420.1 6.21 146 5,896 1,665 Nhân tố phiên mã bZIP liên kết với yếu tố cis có trình tự ACTCAT 80 At4G00050.1 7.54 30 399 1,070 2,151 Nhân tố phiên mã liên kết với DNA đặc hiệu 81 At4G00120.1 6.6 13 198 1,552 -2,254 Nhân tố phiên mã liên kết với DNA đặc hiệu 82 At4G00850.1 6.31 14 223 2,062 1,280 Nhân tố phiên mã tương tác với GRF1 83 At4G02450.1 9.58 23 241 1,569 -1,084 Protein giàu glycine, protein tham gia sửa chữa DNA bắt cặp sai 84 At4G03120.1 6.31 13 207 -1,071 -1,057 Protein giàu proline, protein mang hợp chất ty thể 85 At4G06490.1 6.21 146 1,701 -1,059 Protein chưa biết 86 At4G08395.1 6.93 16 232 1,256 -1,638 Protein chưa biết vii Met TT Tên gen (%) (#) chiều dài axit amin Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả 87 At4G12334.1 6.25 113 -9,787 -3,038 Gen giả mã hóa họ chuỗi truyền điện tử P450 88 At4G12860.1 7.95 12 152 1,466 -1,023 Liên kết với ion Ca 89 At4G16030.1 7.08 114 -1,472 -1,086 Protein thuộc họ L19e ribosome, tham gia cấu tạo nên ribosome 90 At4G16980.1 15.95 26 164 -40,311 1,015 Thuộc họ protein arabinogalactan 91 At4G20440.1 6.64 17 257 1,015 1,184 Protein giống với thụ thể protein kinase 92 At4G22670.1 6.59 29 441 -2,081 -1,078 Protein có khả tương tác với Hsp70/Hsp90 (ATHIP1 ) 93 At4G32470.2 7 101 - - 94 At4G33467.1 8.91 102 337,510 6,161 Protein chưa biết 95 At4G34590.1 6.33 10 159 8,256 3,271 Nhân tố phiên mã bZIP11, điều hòa biểu ASN1 ProDH2 96 At4G35070.2 6.22 13 210 - - 97 At4G37010.1 6.02 10 167 1,573 1,101 98 At5G09876.1 6.73 105 - - viii Có hoạt tính ubiquinol-cytochrome C reductase Protein chưa biết Protein caltractin / centrin Protein chưa biết Met Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) Mô tả (%) (#) chiều dài axit amin 41 587 -51,320 -1,106 Protein chứa vùng liên kết với kim loại nặng 100 At5G21990.1 7.59 42 554 2,228 1,064 Protein chứa vùng lặp lại tetratricopeptide 101 At5G23550.1 6.32 11 175 -3,809 1,203 Protein chưa biết 102 At5G26673.1 6.06 100 1,298 -1,832 Protein thionin kháng khuẩn 103 At5G37860.1 8.81 23 262 1,550 1,721 Protein liên kết với Cu 104 At5G39570.1 9.87 38 386 4,773 1,655 Protein chưa biết 105 At5G41170.1 6.27 33 527 4,180 -1,776 Protein chứa vùng pentatricopeptide lặp lại 106 At5G42325.1 6.03 14 233 2,702 2,448 Nhân tố phiên mã liên quan đến kéo dài 107 At5G42785.1 8.77 10 115 1,608 -4,315 Protein chưa biết 108 At5G44500.1 7.11 18 254 1,095 1,251 Protein B liên kết với ribonucleoprotein nhân nhỏ 109 At5G46300.1 6.76 14 208 1,558 -2,234 Protein chưa biết 110 At5G47410.1 7.38 123 2,134 1,097 Protein chưa biết 111 At5G48485.1 6.93 102 -1,124 -2,399 Protein vận chuyển lipit giả định liên quan đến tính kháng bệnh TT 99 Tên gen At5G19090.1 ix Met Xử lý hạn đối chứng (Số lần thay đổi) Xử lý mặn đối chứng (Số lần thay đổi) (%) (#) chiều dài axit amin 112 At5G49500.1 6.85 34 497 1,175 -1,117 Protein nhận biết tín hiệu, có khả liên kết với mRNA/7S RNA/GTP 113 At5G55410.2 7.34 110 -1,798 -1,060 Ức chế protease/protein dự trữ hạt/protein vận chuyển lipid 114 At5G59030.1 8.28 14 170 -2,152 -1,427 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng (COPT 1) 115 At5G59040.1 6.67 10 151 1,371 3,801 Protein vận chuyển ion Cu xuyên màng (COPT 3) 116 At5G61710.1 8.44 13 155 1,852 -1,118 Protein chưa biết 117 At5G66815.1 6.73 105 1,777 -5,959 Protein chưa biết 118 At5G67060.1 6.25 15 241 1,500 -3,960 Nhân tố phiên mã HEC1 119 At5G67390.1 7.43 13 176 -4,172 -4,147 Protein chưa biết 120 ATMG00500.1 6.43 141 - - Protein chưa biết 121 ATMG00650.1 6.06 100 - - NADH dehydrogenase tiểu phần 4L TT Tên gen x Mô tả [...]... biết protein nào là mẫn cảm với oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây Arabidopsis thaliana Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam 22 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu. .. triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng 18 1.3 Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy phản ứng 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về sự oxy hóa Met bởi ROS trên các phân tử MRP và quá trình sửa chữa bởi enzyme Msr đã được thực hiện khá công phu Từ năm 1989, Reddy và cs đã chỉ ra α-2-macroglobulin đóng vai. .. cs đã gây sốc nhiệt nhẹ protein Hsp21 nằm trong lục lạp Kết quả là protein này bị bất hoạt do các Met trên bề mặt phân tử chuyển hóa thành MetO Cuối cùng, protein lại được hoạt hóa do tác dụng của Msr làm giảm lượng MetO [37] Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng được ghi nhận [18, 28, 46] Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên protein Calmodulin tham... vệ cây chống lại những bất lợi về oxy hóa cũng như có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp đường và các axit amin Bên cạnh đó, đa số đích tác động của MsrB1 là các protein chứa hàm lượng cao Met [84] Năm 2015, Jacques và cs đã sử dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị trí MetO trên hệ protein của cây mô hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa [45] Sử dụng cây Arabidopsis. .. Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng độ 750 µM Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 8 Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91]... dạng tự do và không có khả năng khử MetO liên kết trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O) Đặc biệt, fRMsr chỉ được tìm thấy trong một vài sinh vật đơn bào [26] Protein Protein Met Methionine- S-Sulfoxide ROS Protein Protein Methionine- R-Sulfoxide Hình 1.3 Phản ứng khử MetO về Met của các Msr 16 Met Arabidopsis thaliana chứa 5 gen mã hóa cho 5 protein MsrA khác nhau bao gồm MsrA1, MsrA2, MsrA3 nằm... bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến 1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu 21 về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu... ba chiều của protein [48] Ảnh hưởng của quá trình oxy hóa lên đặc tính của các protein là rất khác nhau Đối với một số enzyme, oxy hóa Met thành MetO hay thậm chí là thay thế Met bằng các axit amin khác có thể chỉ có ảnh hưởng nhỏ đến hoạt tính của enzyme nhưng cũng có thể dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, mất đi khả năng điều hòa các quá trình trao đổi chất [79] Khi nghiên cứu trên Arabidopsis thaliana, ... Gustavsson và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của ROS trên Hsp21, protein sốc nhiệt có hoạt tính giống như chaperone Hsp21 có mặt ở lục lạp, với đầu C bảo thủ và đầu N biến đổi Điều thú vị là đầu N lại chứa những trình tự giàu Met có tính bảo thủ cao Cấu trúc bậc 2 của chuỗi protein này được dự đoán là do sự có mặt của trình tự giàu Met tạo nên chuỗi xoắn α lưỡng cực do tất cả Met đều nằm về một bên của phân tử... MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các axit amin chứa sulfur như Met 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7] Protein 2S albumin cũng được biểu hiện