Nghiên cứu vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (GmARF) ở đậu tương và strigolactone ở arabisopsis trong chịu hạn và mặn (TT)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HÀ VĂN CHIẾN NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA CÁC YẾU TỐ PHIÊN MÃ ĐÁP ỨNG AUXIN (GmARF) Ở ĐẬU TƯƠNG VÀ STRIGOLACTONE Ở ARABIDOPSIS TRONG CHỊU HẠN VÀ MẶN Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 62 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2016 Công trình hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Đồng TS Trần Phan Lam Sơn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp Viện họp Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ngày… tháng.… năm… Có thể tìm hiểu luận án thư Viện: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Thư viện Viện Di truyền Nông nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Sự gia tăng dân số cách nhanh chóng làm cho vấn đề an ninh lương thực trở thành vấn đề giới nói chung Việt Nam nói riêng Thêm vào đó, sản lượng phát triển sản xuất nông nghiệp bền vững bị đe dọa ảnh hưởng tượng biến đối khí hậu điều kiện bất lợi (như hạn, ngập úng, dịch bệnh, sói mòn đất ô nhiễm môi trường) Sự hiểu biết chế đáp ứng với điều kiện bất lợi thực vật giúp tạo giống trồng có khả thích nghi cao Các nhân tố phiên mã loại hormone thực vật (như Abscisic acid (ABA), auxin, cytokinins (CK), strigolactones (SL)) biết đến với vai trò quan trọng điều hòa biểu gen trình sinh lý thực vật Do vậy, nghiên cứu tập trung mô tả xác định gen có tiềm ứng dụng việc chọn tạo giống trồng có khả chống chịu lại điều kiện bất lợi môi trường đường Một là, nghiên cứu điều hòa biểu gen thông qua nhân tố phiên mã, cụ thể họ yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (ARF); hai là, nghiên cứu trình sinh tổng hợp hormone thực vật nhằm phát gen tham gia vào trình trao đổi dẫn truyền tín hiệu hormone thực vật Để đạt mục tiêu này, đồng thời tiến hành nghiên cứu mô hình Arabidopsis thaliana trồng có vai trò quan trọng đậu tương (Glycine max) với đề tài: Nghiên cứu vai trò yếu tố phiên mã đáp ứng auxin (GmARF) đậu tương strigolactone Arabisopsis chịu hạn mặn Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Xác định gen tiềm mã hóa yếu tố phiên mã đáp ứng auxin đậu tương (GmARF) phục vụ công tác chọn tạo giống trồng có khả chống chịu điều kiện hạn công nghệ gen - Đánh giá vai trò SL đáp ứng với điều kiện hạn mặn mức độ kiểu hình mức độ phân tử Nội dung nghiên cứu đề tài 3.1 Nghiên cứu vai trò yếu tố phiên mã đáp ứng auxin điều kiện hạn đậu tương 3.2 Nghiên cứu vai trò strigolactone điều kiện hạn, mặn Arabidopsis Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu nghiên cứu đầu tiên, cung cấp liệu khoa học vai trò gen mã hóa yếu tố phiên mã đáp ứng auxin đậu tương SL Arabidopsis thalianana trình đáp ứng lại điều kiện bất lợi, đặc biệt tập trung vào điều kiện khô hạn Các kết nghiên cứu | Page tạo tiền đề cho nghiên cứu vấn đề Đồng thời, cung cấp tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật công nghệ sinh học nông nghiệp 4.2 Ý nghĩa thực tiễn - Nghiên cứu cho phép xác định số gen tiềm nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống đậu tương có khả chống chịu với điều kiện bất lợi (hạn, mặn) môi trường công nghệ gen - Kết nghiên cứu mở hướng nghiên cứu ứng dụng SL việc giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực yếu tố bất lợi môi trường đến suất trồng Những đóng góp luận án - Cung cấp có hệ thống đặc điểm chức gen GmARF đáp ứng với điều kiện hạn đậu tương - Xác định số gen GmARF đặc hiệu mô, quan có tiềm ứng dụng cho công nghệ gen để chọn tạo giống đậu tương có khả chống chịu điều kiện hạn - Chứng minh vai trò SL trình chống chịu hạn mặn mô hình Arabidopsis thaliana - Mở hướng nghiên cứu ứng dụng SL nhằm tăng cường khả chống chịu hạn, mặn trồng sản xuất nông nghiệp Cấu trúc luận án Luận án trình bày 107 trang, bao gồm 28 hình, bảng Luận án sử dụng 185 tài liệu tham khảo, có tài liệu tham khảo tiếng Việt, 176 tài liệu tham khảo tiếng Anh trang web sử dụng | Page CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặt vấn đề Đậu tương trồng có vai trò kinh tế hàng đầu giới, cung cấp nguồn dầu thực vật, protein, khoáng chất cho người thức ăn gia súc Tuy nhiên, suất đậu tương bị tác động lớn điều kiện bất lợi ngoại cảnh, đặc biệt hạn hán Thực vật nói chung đậu tương nói riêng kích hoạt nhiều chế nhằm thích nghi với điều kiện khô hạn Trong vòng 20 năm trở lại đây, nhiều gen, có gen chức gen điều hòa, xác định nhiều loại trồng quan trọng lúa (Oryza sativa) đậu tương, tham gia vào chế chống chịu hạn Tuy nhiên thông tin cụ thể thành phần chế điều hòa trình thích nghi thực vật chưa sáng tỏ Do đó, nghiên cứu chế chống chịu hạn hán đậu tương, điển hình thông qua mô tả họ phiên mã đáp ứng auxin nghiên cứu thiết thực, góp phần phát triển giống đậu tương chịu hạn Bên cạnh đó, yếu tố mặn gây ảnh hưởng không nhỏ tới suất trồng Để làm sáng tỏ đáp ứng thực vật điều kiện mặn hạn, sử dụng mô hình Arabidopsis sâu vào nghiên đường tín hiệu hormone thực vật SL Bởi vì, Arabidopsis chọn mô hình nhiều ưu điểm: vòng đời ngắn, có hệ gen nhỏ, biết đầy đủ trình tự, không tốn diện tích trồng lại tạo nhiều hạt, tự thụ có mối quan hệ gần gũi với loài lương thực họ cải SL mô tả nhiều nghiên cứu với vai trò quan trọng điều hòa trình sinh lý thực vật Tuy nhiên, vai trò SL chống chịu với điều kiện hạn mặn chưa cụ thể Vì vậy, việc tìm nghiên cứu sâu rộng vai trò SL điều kiện hạn mặn cần thiết nhằm bổ sung thêm vào nguồn kiến thức sinh học, xa ứng dụng nông nghiệp cải tiến giống Tóm lại, để đánh giá gen mục tiêu ứng dụng cho kỹ thuật di truyền, nghiên cứu này, tập trung vào họ yếu tố phiên mã đáp ứng auxin đậu tương (GmARF) SL đáp ứng với yếu tố bất lợi phi sinh học thực vật 1.2 Cơ chế đáp ứng thực vật với điều kiện bất lợi môi trường Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi khô hạn, mặn lạnh, thực vật thường có phản ứng sinh lý đa dạng, phức tạp để thích nghi tồn (Manavalan et al., 2009) Về chế sinh lý, để thích nghi với điều kiện khô hạn, mặn lạnh, thực vật đóng khí khổng, giảm hô hấp quang hợp, giảm thể tích nước mô thực vật, trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu lan rộng để hút nước (Tran and Mochida, 2010) Về chế phân tử, khả chống chịu thực vật với điều kiện bất lợi môi trường, có tính trạng chịu hạn, thường tính trạng kiểm soát nhiều gen (Dorothea and Ramanjulu, 2005) Trong trình đáp ứng với điều kiện bất | Page lợi, có tham gia nhiều yếu tố phiên mã nhân tố cis-acting promoter thuộc hệ thống điều hòa biểu gen đóng vai trò phân tử khởi động biểu gen tín hiệu dẫn truyền kết thúc trình điều hòa, giúp cho đáp ứng tốt với nhân tố stress Bên cạnh đó, phytohormone có vai trò vô quan trọng chống chịu hình thành chế thích nghi 1.3 Tổng quan yếu tố phiên mã đáp ứng auxin thực vật 1.3.1 Khái niệm, phân loại yếu tố phiên mã 1.3.1.1 Khái niệm Yếu tố phiên mã protein gắn đặc hiệu với trình tự DNA vùng điều khiển, tham gia điều khiển trình phiên mã gen (Latchman, 1997; Brivanlou and Darnell, 2002) 1.3.1.2 Phân loại Các yếu tố phiên mã phân loại dựa vào chế hoạt động, chức tương đồng trình tự cấu trúc vùng trình tự đặc trưng liên kết với DNA (DNA-binding domain, DBD) chúng (Karin, 1990; Latchman, 1997; Brivanlou and Darnell, 2002) Dựa vào trình tự tương đồng vùng đặc trưng DBD, yếu tố phiên mã có chung vùng trình tự đặc trưng DBD xếp chung vào họ (nhóm) yếu tố phiên mã 1.3.2 Cấu trúc chức yếu tố phiên mã 1.3.2.1 Cấu trúc Cấu trúc yếu tố phiên mã bao gồm số vùng trình tự đặc trưng: vùng trình tự liên kết với DNA (DBD), Vùng kích hoạt trans (trans-activating domain, TAD) Vùng cảm biến tín hiệu (signal sensing domain, SSD) 1.3.2.2 Chức Chức yếu tố phiên mã tham gia điều hòa phiên mã gen (Weinzierl, 1999) Vai trò yếu tố phiên mã đảm bảo tính đặc hiệu phiên mã Các yếu tố phiên mã giữ vai trò điều hòa phát triển tế bào thể sinh vật (Lobe, 1992) Một vai trò quan trọng yếu tố phiên mã tham gia vào đáp ứng với yếu tố môi trường ngoại cảnh (Fujita et al., 2005; He et al., 2005; Hu et al., 2006; Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Fang et al., 2008; Nakashima et al., 2009; Cutler et al., 2010; Fujita et al., 2011) 1.3.3 Tình hình nghiên cứu yếu tố phiên mã chống chịu điều kiện bất lợi môi trường 1.3.4 Yếu tố phiên mã đáp ứng auxin 1.3.4.1 Khái niệm, đặc điểm cấu trúc Auxin loại phytohormone biết đến với vai trò điều hòa sinh trưởng phát triển thực vật (Kieffer et al., 2010; de Jong et al., 2011; Lau et al., 2011; Ha et al., 2012) Các | Page nghiên cứu di truyền hóa sinh Arabidopsis chứng tỏ rằng, điều hòa phiên mã gen đáp ứng với auxin (auxin response gen) điều khiển hai họ yếu tố phiên mã lớn nhân tố đáp ứng auxin (ARF) auxin/indole acetic acid (Aux/IAA) (Guilfoyle and Hagen, 2007) Ở Arabidopsis, có 23 ARF, hầu hết có chứa vùng trình tự liên kết DNA đầu N (Nterminal DNA-binding domain, DBD), vùng điều hòa trình phiên mã (transcriptional regulatory region, TRR hay middle region, MR) vùng trình tự lặp kép đầu C (carboxy-terminal dimerization domain, CTD) (Perez-Rodriguez et al., 2010; Zhang et al., 2011) DBD ARF có chứa trình tự đặc biệt liên kết với trình tự đáp ứng với auxin (auxin response element, AuxRE, TGTCTC) vùng promoter gen đáp ứng với auxin giai đoạn giai đoạn sớm Cấu trúc TRR ARF thường hoạt động yếu tố hoạt hóa ức chế Vùng hoạt hóa (activation domain, AD) ARF thường có chứa trình tự giàu glutamine (Q), serine (S) leucine (L), vùng ức chế (repression domain, RD) chứa trình tự giàu S, L proline (P); S, L glycine (G) S Trình tự ARF CTD có chứa trình tự amino acid liên quan đến domain III IV protein Aux/IAA, làm chức tạo lặp kép domain (dimerization domain) ARF CTD protein Aux/IAA (Guilfoyle and Hagen, 2007) 1.3.4.2 Vai trò tình hình nghiên cứu họ yếu tố phiên mã đáp ứng auxin Đặc điểm, cấu trúc, chức hoạt động yếu tố phiên mã ARF nghiên cứu đầy đủ mô hình Arabidopsis thanliana (Guilfoyle and Hagen, 2007) Các đột biến gen AtARF01 AtARF02 dẫn đến kết làm chậm trình chết tự nhiên rụng hoa (Ellis et al., 2005; Lim et al., 2010) Trong đó, hai gen AtARF07 AtARF19 biết có vai trò điều hòa dương tính phát triển rễ phụ (Fukaki et al., 2006) Với tầm quan trọng yếu tố phiên mã ARF đa dạng sinh học trình sinh lý tiềm ứng dụng phát triển nâng cao khả chống chịu điều kiện bất lợi trồng chuyển gen, họ yếu tố phiên mã ARF xác định phân tích nhiều loại trồng ngô (Zea mays) (Xing et al., 2011; Wang et al., 2012), lúa (Oryza sativa)(Jain, 2009; Song et al., 2009; Shen et al., 2010), kê (Sorghum bicolor) (Wang et al., 2010a), cà chua (Solanum lycopersicum) (Wu et al., 2011); cải bắp (Brassica rapa) (Mun et al., 2012) cam đường (Citrus sinensis) (Li et al., 2015) 1.3.5 Các yếu tố phiên mã đậu tương Ở đậu tương có 61 họ yếu tố phiên mã phát với tổng số 5035 yếu tố phiên mã Tuy nhiên, số có 857 gen chưa nghiên cứu đặc điểm, chức vai trò chúng Có nhiêu họ yếu tố phiên mã xác định đóng vai trò điều khiển đáp ứng điều kiện bất lợi đậu tương họ GmNAC (Le et al., 2011), GmNFYA (Ni et al., 2013), GmWRKY (Lou et al., 2013) | Page 1.4 Tổng quan strigolactone 1.4.1 Định nghĩa, phân loại strigolactone Strigolactone loại hormone thực vật, chúng terpenoid có nguồn gốc từ carotenoid SL mô tả lần đầu cách 45 năm chất kích thích nảy mầm thực vật ký sinh Striga, Orobanche Phelipanche (Xie and Yoneyama, 2010; Ruyter-Spira et al., 2013) SL chứng minh tín hiệu giúp tăng cường tương tác cộng sinh thực vật nấm cộng sinh với rễ thực vật (arbuscular mycorrhizal fungi, AMF), tăng cường khả phát sinh đa chồi AMF (Akiyama et al., 2005) Gần đây, SL biết đến với vai trò quan trọng ức chế phát sinh chồi phụ nách (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008) Các gen liên quan đến SL phân thành nhóm chính, bao gồm gen sinh tổng hợp SL gen truyền dẫn tín hiệu SL 1.4.2 Đặc điểm cấu trúc strigolactone Cho tới ngày nay, 19 loại SL tự nhiên tìm thấy từ nhiều loài thực vật, chúng có cấu trúc khung gồm vòng (A, B, C and D), vòng A B chỗ bám nhiều chất thay thế; vòng C D lactone dị vòng liên kết liên kết enol-ether (Hình 1.5).(+)-5Deoxystrigol biết đến tiền thân SL khác (Matusova et al., 2005) 1.4.3 Quá trình sinh tổng hợp strigolactone SL có tiền thân phân tử carotenoid, trải qua trình phân cắt khác loại enzyme, sau liên kết với thụ thể, truyền tín hiệu biểu thành tính trạng 1.4.4 Quá trình vận chuyển truyền dẫn tín hiệu strigolactone SL giống loại phytohormone khác, chúng vận chuyển thể thực vật hệ thống tiếp nhận chuyên biệt Hai thành phần truyền dẫn tín hiệu SL α/β-fold hydrolase, D14(Arite et al., 2007; Arite et al., 2009; Hamiaux et al., 2012; Waters et al., 2012b) F-box protein, MAX2/D3/RMS4 (Dun et al., 2009a; Nelson et al., 2011) 1.4.5 Vai trò strigolactone SL phát lần thông qua vai trò kích thích nảy mầm loài thực vật ký sinh (Xie and Yoneyama, 2010; Ruyter-Spira et al., 2013) Chức SL trình sinh trưởng phát triển thực vật tiếp tục nghiên cứu năm gần Chúng biết đến với vai trò loại hormone thực vật (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008; Xie and Yoneyama, 2010) Với vai trò hormone, SL tham gia điều tiết phát triển thân, giảm phát triển nhánh (Gomez-Roldan et al., 2008; Umehara et al., 2008) 1.4.6 Tiềm ứng dụng strigolactone SL nhân tố quan trọng điều khiển trình sinh trưởng phát triển thực vật SL chức sinh học đa dạng chúng trở thành tiềm năng, công cụ để phát triển phương thức công nghệ lĩnh vực nông nghiệp theo đường nông nghiệp bền vững | Page CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu thực vật Giống đậu tương mô hình Williams 82 (W82) sử dụng làm vật liệu thực vật nghiên cứu họ yếu tố phiên mã đáp ứng auxin điều kiện hạn đậu tương Cây mô hình thực vật Arabidopsis thaliana sử dụng cho nghiên cứu vai trò SL đáp ứng với điều kiện bất lợi phi sinh học (hạn, mặn) bao gồm dòng đột biến Arabidopsis thaliana max2-3 (SALK_092836), max2-4 (SALK_028336), max3-11 (SALK_023975), max3-12 (SALK_015785), max4-7 (SALK_082552), max4-8 (SALK_072750) sử dụng nghiên cứu có nguồn gốc di truyền từ Arabidopsis thaliana Columbia-0 (Col-0, nguyên thủy, wildtype, WT) mô tả nghiên cứu trước (Umehara et al., 2008) 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị phần mềm 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2.1 Thời gian nghiên cứu Các nội dung nghiên cứu thực từ 4/2012 đến 3/2015 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực Nhóm nghiên cứu Phương thức dẫn truyền tín hiệu, Trung tâm Khoa học nguồn tài nguyên bền vững, RIKEN 1-7-22 Suehiro, Tsurumi, Yokohama, Nhật Bản 230-0045; Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp, đường Phạm Văn Đồng, Từ Liêm, Hà Nội 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu tương Arabidopsis 2.3.1.1 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu đậu tương 2.3.1.2 Phương pháp trồng, xử lý thu mẫu Arabidopsis 2.3.2 Phương pháp xác định thành viên GmARF gen liên quan đến sinh tổng hợp truyền dẫn tín hiệu strigolactone đậu tương Toàn yếu tố phiên mã ARF dự đoán đậu tương (GmARF) thu thập trực tiếp từ nguồn sở liệu yếu tố phiên mã sẵn có (Mochida et al., 2009, 2010a; Wang et al., 2010b; Zhang et al., 2011) GmARF có chứa đầy đủ khung đọc mở (open reading frames, ORFs), kiểm tra lại Glyma v1.1 (http://www.phytozome.net/soybean) sử dụng cho phân tích tiếp sau Các gen giống 90% trở lên trình tự nucleotide xác định gen nhân đôi hay gen tương đồng (duplicated gen) (Cheung et al., 2003) | Page Các gen tương đồng liên quan đến sinh tổng hợp truyền dẫn tín hiệu SL đậu tương xác định dựa tương đồng trình tự nucleotide với gen MAX Arabidopsis thaliana thông qua phương pháp BLAST Glyma v1.1 (http://www.phytozome.net/soybean) 2.3.3 Phương pháp xây dựng phân tích phát sinh chủng loại Sự liên kết trình tự tất ARF xác định từ Arabidopsis đậu tương thể thông qua phần mềm Clustal W MEGA (Thompson et al., 1997; Tamura et al., 2007) Sự xếp quan sát thông qua sử dụng phần mềm GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) Cây phát sinh chủng loại xây dựng phương pháp neighbor-joining phần mềm MEGA Mức độ tin cậy nhóm đơn ngành ước tính cách sử dụng phân tích bootstrap với 10.000 lần nhắc lại Chỉ có giá trị bootstrap cao 50% hiển thị bên cạnh giao điểm nhánh 2.3.4 Phương pháp phân tích mức độ biểu gen GmARF sử dụng liệu microarray Illumina transcriptome sẵn có đậu tương Đối với phân tích mức độ biểu gen liên quan đến mô đặc hiệu gen GmARF, liệu từ 68 loại mô quan khác lấy từ Genevestigator (https://www.genevestigator.com/) (Hruz et al., 2008) Dữ liệu trình tự Illumina transcriptome cung cấp Libault et al (Libault et al., 2010b; Libault et al., 2010a) sử dụng cho phân tích mức độ biểu gen GmARF mô: nốt sần 35 ngày tuổi (thu hoạch sau 32 ngày lây nhiễm ngày tuổi), 14 ngày tuổi, hoa (giai đoạn R2), xanh (giai đoạn R6), rễ 18 ngày tuổi (giai đoạn V2), đầu rễ lông rễ ngày tuổi Phân tích biểu gen GmARF đậu tương giai đoạn V6 R2 điều kiện hạn, đậu tương sinh trưởng chậu xử lý hạn độ ẩm đất giảm xuống 5%, liệu micoarray công bố Le et al (Le et al., 2012a) sử dụng nghiên cứu 2.3.5 Phương pháp tách chiết RNA tổng hợp cDNA, thiết kế mồi cho phân tích biểu gen đậu tương Arabidopsis 2.3.5.1.Tách chiết RNA, tổng hợp cDNA đậu tương 2.3.5.2.Tách chiết RNA, tổng hợp cDNA Arabidopsis 2.5.3.3 Thiết kế mồi cho RT-qPCR 2.3.6 Phương pháp xử lý hạn phân tích microarray Arabidopsis Các nguyên thủy Col-0 max2-3 (30 loại) trồng môi trường GM (chứa muối Murashige-Skoog (MS), vitamin B5, sucrose 1%, agar 0.7%, pH 5.7) đến 14 ngày tuổi (220C, chu kỳ 16 h sáng/8 h tối, cường độ chiếu sáng 60 μmol·m-2·s-1 photon flux), sau chuyển đất mô tả thí nghiệm đánh giá kháng hạn tiếp tục trồng điều kiện có nước đầy đủ 10 ngày Phần thân (phía mặt đất) 24 ngày tuổi cắt tiến hành xử lý với hạn cách đặt giấy Towel bàn thí nghiệm Ở thời điểm xử lý hạn, hàm | Page Hình 3.1: Thành phần, phân bố gen GmARF NST cấu trúc protein GmARF (A) Tỷ lệ phân bố (theo %) gen GmARF nhiễm sắc thể (B) Vị trí tương đối gen GmARF nhiễm sắc thể (C) Sơ đồ kết cấu của tâm phản ứng protein GmARF Trình tự ARF điển hình bao gồm vùng trình tự đặc hiệu liên kết với DNA (DBD)), có chứa tiểu phần B3 tiểu phần đáp ứng auxin (auxin-response, ARF), vùng trình tự (middle region (MR)) vùng trình tự phần đuôi (carboxy-terminal dimerization domain (CTD)) 11 | Page Hình 3.2: Cây phân tích phát sinh chủng loại yếu tố phiên mã đáp ứng auxin đậu tương Arabidopsis Cây phân loại thiết lập sử dụng trình tự protein ARF có đầy đủ khung đọc mở Đơn vị khoảng cách thể đa dạng tương đối trình tự kiểm tra Giá trị bootstrap (bootstrap value, giá trị xác định độ tin cậy tính xác cho nhánh phân loại) cao 50% thể phần bên cạnh nhánh 12 | Page 3.1.3 Biểu gen GmARF mô quan khác điều kiện bình thường Trong nội dung nghiên cứu này, tập trung tìm hiểu biểu đặc hiệu mô gen GmARF giúp nhận gen tham gia vào phát triển chuyên hóa mô riêng biệt Hơn nữa, nhận biết gen đặc hiệu mô, ví dụ gen đặc hiệu rễ, cung cấp nguồn promoter đặc hiệu rễ cho phát triển khả chống chịu hạn cách tăng cường sinh trưởng phát triển rễ (Werner, Nehnevajova et al 2010; Ha, Vankova et al 2012) Kết nghiên cứu mức độ biểu gen GmARF điều kiện bình thường thân rễ đậu tương thể hình 3.3 Hình 3.3: Sự biểu 51 gen GmARF rễ thân đậu tương 12 ngày tuổi điều kiện bình thường Dựa mức độ biểu gen, GmARF chia làm nhóm (A-F) Kết thể giá trị trung bình sai số chuẩn tính từ mẫu độc lập.Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê sử dụng qua phương Student’s t-test (*P< 0.05; **P< 0.01; ***P< 0.001) Sự biểu tương đối (relative expression) gen tính dựa mức độ biểu gen so sánh với gen tham chiếu 60s Kết cho thấy rằng, 18 gen xác định biểu đặc hiệu mô, quan riêng biệt, có gen đặc hiệu thân (GmARF25, 29, 34, 35, 36, 48, 50), 11 gen đặc hiệu rễ (GmARF02, 05, 09, 15, 18, 22, 27, 28, 32, 33, 49) 13 | Page 3.1.4 Biểu gen GmARF rễ thân điều kiện hạn Kết phân tích mức độ biểu 51 gen GmARF điều kiện hạn thông qua phương pháp RT-qPCR Việc phân tích biểu gen mô riêng biệt cung cấp thông tin hữu ích hoạt động gen GmARF liên quan đến điều kiện bất lợi loại mô cụ thể Sự biểu gen Sự biểu gen Sự biểu gen A ** Sự biểu gen Sự biểu gen 40 GmARF04 ** GmARF07 ** 30 0.5 35 30 10h GmARF11 * 60 50 25 * 20 10 0.5 10h GmARF12 ** 40 0.004 0.003 20 0.002 10 0 * 10h 10h 12 0.0003 GmARF19 GmARF18** 0.00025 * * 0.0002 0.6 0.00015 0.2 0.0001 ** 0.04 GmARF32 ** 0.01 * 0.005 0.5 10h GmARF20 0.15 0.6 0.2 GmARF15 10h GmARF17 * ** ** 0.15 0 0.008 10h GmARF28 0.12 10h GmARF31 * 0.006 ** 0.004 0.06 0.2 ** 0.02 ** 0 10h GmARF38 *** 0.03 *** 10h GmARF37 1.2 GmARF44 ** 0.015 0.002 10h 1.5 * ** 0.8 GmARF49 0.4 0.15 GmARF26 ** * *** GmARF50 * 0.3 ** 0.8 10h 10h *** 0.002 0.5 0.005 *** 10h 0.5 0.006 0.4 ** 10h 0.1 0.01 0.2 GmARF24 0.09 0.6 10h 10h GmARF27 * 1.5 ** * 10h ** 0.4 0.8 *** 0.1 2.5 10h ** 10h 0.0002 0.0001 0 10h GmARF34 0.6 0.1 0.3 0.4 0.1 0.06 0.2 ** 0.05 0.1 GmARF21 ** 0.4 0.3 2 10h GmARF33 * 0.4 GmARF14 * 0.5 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.04 0.03 0.0003 0.0002 0.0001 0 10h *** 10h 0.015 0.00005 *** 0 0.001 * 0 10h 0.006 GmARF13 *** 0.005 30 0.02 GmARF10 * 10 15 * 20 GmARF09 1.5 Sự biểu gen 2.5 GmARF02 1.5 0.02 B GmARF01 * 0.05 ** * 10h GmARF35 0.15 10h GmARF41 0.5 ** 0.02 *** ** 0.04 10h GmARF43 0 0.3 *** 10h GmARF51 0.4 1.5 0.1 0.2 0.3 ** 0.5 0 * ** 10h ** 0.05 0.2 * ** ** 10h 0.1 0.1 *** ** ** * ** 10h 0 10h Hình 3.6 Kết phân tích RT-qPCR gen GmARF rễ (cột màu đen) thân (cột màu trắng) đậu tương điều kiện khô hạn (A) Các gen GmARF tăng cường biểu thân lần (B) Các gen GmARF giảm biểu thân lần Giá trị thể giá trị trung bình sai số chuẩn tính từ mẫu độc lập Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê tính theo phương pháp Student’s t-test (*P< 0.05; **P< 0.01; ***P< 0.001) Sự biểu tương đối tính mức độ biểu gen đích so sánh với gen tham chiếu 60s 14 | Page A Sự biểu gen C 1.5 60 GmARF12 ** 50 GmARF08 0.4 GmARF16 0.5 10h 0.1 0.3 0.1 0.06 0.006 0 0 10h ** *** 0.02 10h GmARF50 * 10h Rễ Tăng ** Rễ *** 0.002 0.1 * 0.5 0.08 0.04 20 10 ** 0.2 30 GmARF48 0.3 40 * 0.12 21 Giảm 0.0002 0.0001 0 Rễ 10h Sự biểu gen B Sự biểu gen Sự biểu gen GmARF06 2.5 GmARF09 * 15 GmARF10 * 0.3 10h GmARF20 0.6 0.4 ** GmARF21 ** ** 1.2 0.15 GmARF22 GmARF26 2.5 0.8 Giảm Thân 13 Tăng * ** 0.02 ** 10h Thân Tăng 12 GmARF18** 0.2 0.04 ** * 10h Thân 23 0.6 0.1 10h 0.4 0.3 * 0.5 GmARF15 0.2 ** *** 0.4 1.5 10 *** 0 10h GmARF27 * 0.15 10h GmARF28 0.12 ** 0.1 0.09 1.5 0.6 0.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0.4 0.2 0.1 ** 0 0.05 ** 10h ** 0 0.4 ** 0.3 0.8 GmARF45 0 10h * ** 0 GmARF41 ** 0.05 ** ** 0.3 10h GmARF47 10h 1.5 10h GmARF49 0.25 ** ** 0 GmARF42 1.5 0.5 0.04 *** 0.02 0.3 10h GmARF51 0.2 0.15 ** 0.1 ** 0.1 0.5 ** 0.1 *** ** ** 0.05 *** 10h * 0.2 * 0.4 10h GmARF37 0.2 ** 10h 0.1 0.04 0.2 * ** 0.15 GmARF40 0.06 10h 0.4 * ** 0.5 0.02 0.4 0.1 10h 0.1 ** 0.8 0.08 1.2 GmARF44 GmARF43 0.2 *** 0.12 GmARF35 ** 0.14 GmARF39 0.5 0.3 ** 10h 10h 0.6 0.02 2 *** 0.03 *** 1.5 0.06 0.02 10h GmARF34 0.04 0 10h 0.4 *** 0.04 *** 0.5 0.6 0.06 0.005 0.8 0.08 0.01 *** 10h 0.1 ** 0.015 ** *** GmARF33 * 0.12 GmARF38 10h 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.04 0.03 0.0003 0.0002 0.0001 GmARF29 0 ** 0.06 * 0.05 0.2 *** * 10h 0.1 0.02 Sự biểu gen GmARF05 20 0.5 Sự biểu gen 16 12 Giảm 25 2 10h 0 10h 0 10h 0 10h Hình 3.7 Kết phân tích RT-qPCR gen GmARF rễ (cột màu đen) thân (cột màu trắng) đậu tương điều kiện khô hạn (A) Các gen GmARF tăng cường biểu rễ lần (B) Các gen GmARF giảm biểu rễ lần Giá trị thể giá trị trung bình sai số chuẩn tính từ mẫu độc lập (C) Hình phân tích gen GmARF thân rễ đậu tương 12 ngày tuổi Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê tính theo phương pháp Student’s t-test (*P< 0.05; **P< 0.01; ***P< 0.001) Sự biểu tương đối tính mức độ biểu gen đích so sánh với gen tham chiếu 60s 15 | Page Từ kết phân tích qRT-PCR gen GmARF điều kiện hạn (Hình 3.6 3.7) cho thấy, có nhiều gen gen tăng cường điều kiện bất lợi Trong đó, gen (GmARF12, 50) tăng gen (GmARF20, 26, 34, 35, 41, 43, 51) giảm mức độ biểu rễ thân Trong số 30 gen GmARF giảm biểu rễ, có 12 gen (GmARF09, 10, 15, 18, 21, 27, 28, 33, 37, 38, 44, 49) tăng cường biểu thân Hai gen GmARF33 GmARF50 có mức độ biểu cao nhất, gen tiềm ứng dụng cho công tác chọn tạo giống đậu tương chống chịu hạn công nghệ gen 3.1.5 Biểu gen GmARF điều kiện hạn giai đoạn trưởng thành đậu tương Như trình bày nội dung trước, hạn làm thay đổi biểu nhiều gen GmARFs rễ thân đậu tương 12 ngày tuổi Gần đây, sử dụng 66 K Affymetrix Soybean Array GenChip, thực nghiên cứu tổng thể phiên mã toàn gen đậu tương giai đoạn V6 R2 điều kiện hạn hán (Le, Nishiyama et al 2012) Các kết cho thấy, gen GmARF biểu phổ phiên mã đa dạng giai đoạn sinh trưởng khác đậu tương 3.2 Vai trò strigolactone điều kiện hạn, mặn Arabidopsis 3.2.1 Khả chịu hạn mặn đột biến gen max Nhằm xác định vai trò SL chịu hạn mặn Arabidopsis, Arabidopsis đột biến gen max nguyên thủy đánh giá phản ứng điều kiện hạn nồng độ muối cao Các kết đánh giá khả chịu hạn mặn tóm tắt hình 3.9 hình 3.10 Từ kết cho thấy, đột biến gen max thể nhạy cảm cao với điều kiện hạn mặn Qua cho thấy rằng, SL đóng vai trò quan trọng đáp ứng thực vật với điều kiện bất lợi 16 | Page Hình 3.9: Đánh giá khả chịu hạn đột biến gen max (A) Cây tuần tuổi chuyển từ môi trường GM sang đất trồng thêm tuần (B) Cây tuần tuổi tiến hành xử lý hạn tưới nước trở lại Các khay chụp hình sau ngày tưới nước trở lại (C) Cây nguyên thủy max điều kiện bình thường (đối chứng) (D) Tỷ lệ sống sai số chuẩn nguyên thủy max tính từ thí nghiệm độc lập (n = 30 cây/kiểu gen) Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê, tính theo phương pháp Student’s t-test (*** P < 0.001, **P < 0.01) 17 | Page Hình 3.10: Đánh giá khả chống chịu mặn đột biến max (A) Cây tuần tuổi chuyển từ môi trường GM sang đất trồng thêm tuần Cây tuần tuổi tiến hành xử lý với điều kiện mặn với 2L NaCl 200mM ngày Từ ngày thứ đến ngày thứ 10 bổ sung nước Các khay chụp hình sau ngày tưới nước trở lại Tỷ lệ sống sai số chuẩn nguyên thủy max tính từ thí nghiệm độc lập (n = 30 cây/kiểu gen) (B) Thí nghiệm đánh giá nảy mầm max bị ức chế nồng độ muối cao Hạt nguyên thủy đột biến cho nảy mầm môi trường GM-sucrose 1% chứa NaCl 100 mM Tỷ lệ nảy mầm xác định số hạt có mầm mở hoàn toàn.Sai số chuẩn tính từ kết thí nghiệm độc lập với 50 hạt loại/thí nghiệm Sau ngày, toàn nguyên thủy đột biến nảy mầm 100% GM-sucrose 1% không chứa NaCl Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê, tính theo phương pháp Student’s t-test (**P < 0.01; ***P < 0.001) 18 | Page 3.2.2 Vai trò strigolactone ngoại sinh việc phục hồi khả kháng hạn đột biến gen max3 max4 tăng cường khả chịu hạn nguyên thủy Hình 3.11: Ảnh hưởng SL ngoại sinh đến kiểu hình khả chịu hạn (A) Cây tuần tuổi chuyển từ môi trường GM sang đất trồng thêm tuần (B) Cây tuần tuổi tiến hành xử lý hạn có bổ sung với SL dung môi đối chứng tưới nước trở lại Các khay chụp hình sau ngày tưới nước trở lại (C) Cây nguyên thủy (WT) max điều kiện bình thường (đối chứng) (D) Tỷ lệ sống sai số chuẩn nguyên thủy max tính từ thí nghiệm độc lập (n = 30 cây/kiểu gen) Ký hiệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê, tính theo phương pháp Student’s t-test (*** P < 0.001) Để khẳng định kết luận vai trò điều hòa dương SL đáp ứng với điều kiện hạn Arabidopsis, tiến hành ứng dụng SL ngoại sinh kết hợp với trình gây hạn nhân tạo Kết thể qua hình 3.11 cho thấy, SL tăng cường khả chịu hạn nguyên thủy; đồng thời SL phục hồi khả chịu hạn đột biến sinh tổng hợp SL so sánh với đối chứng Các kết khẳng định chắn vai trò điều hòa dương tính SL đáp ứng với điều kiện stress hạn 19 | Page 3.2.3 Phân tích tác động ABA ngoại sinh tới đột biến max ABA loại phytohormone quan trọng thực vật Nó coi chất giữ vai trò định thực vật trình đáp ứng lại điều kiện bất lợi phi sinh học (Yamaguchi-Shinozaki and Shinozaki, 2006; Tran et al., 2007a; Fujita et al., 2011; Osakabe et al., 2014b; Osakabe et al., 2014a) Nhằm xác định tham gia ABA đột biến SL điều kiện bất lợi, tiến hành phân tích đáp ứng đột biến gen max nồng độ ABA ngoại sinh khác giai đoạn nảy mầm sau nảy mầm Kết thể tóm tắt qua hình 3.12 cho thấy, đột biến thể nhạy cảm với ABA ngoại sinh so với nguyên thủy Qua cho thấy có tương tác SL Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) 120 A th day 100 80 * *** ** *** 60 WT max3-11 max4-7 max2-3 40 20 *** *** * 0.0 0.5 1.0 (µM ABA) 2.0 Tỷ lệ trọng lượng tươi (%) đường tín hiệu ABA điều khiển đáp ứng với điều kiện bất lợi thực vật 120 B 14th day 100 80 *** ** *** 60 40 *** *** *** 20 0.0 0.5 1.0 (µM ABA) Hình 3.12: Đáp ứng đột biến gen max xử lý với ABA ngoại sinh thời điểm ngày 14 ngày (A) Đáp ứng đột biến gen max với ABA ngoại sinh thông qua phương pháp đánh giá nảy mầm Tỷ lệ nảy mầm xác định sau ngày điều kiện 22oC phương pháp đếm số lượng hạt có mầm mở hoàn toàn.Sai số chuẩn tính từ kết thí nghiệm độc lập với 50 hạt kiểu gen/thí nghiệm (B) Đáp ứng max với ABA ngoại sinh thông qua phương pháp đánh giá ức chế sinh trưởng Trọng lượng tươi nguyên thủy đột biến gen max xác định sau 14 ngày 22oC Sai số chuẩn tính từ lần cân độc lập (n=6, lần cân cây) Ký hiệu biểu thị sai khác có ý nghĩa thống kê đươc xác định phương pháp Student’s t-test (* P[...]... sinh trưởng khác nhau của cây đậu tương 3.2 Vai trò của strigolactone trong điều kiện hạn, mặn ở Arabidopsis 3.2.1 Khả năng chịu hạn và mặn của các cây đột biến gen max Nhằm xác định vai trò của SL trong chịu hạn và mặn ở Arabidopsis, các cây Arabidopsis đột biến gen max và cây nguyên thủy được đánh giá phản ứng trong điều kiện hạn và nồng độ muối cao Các kết quả đánh giá khả năng chịu hạn và mặn được... | Page CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Vai trò của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin trong điều kiện hạn ở đậu tương 3.1.1 Thành viên thuộc họ các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở đậu tương Gần đây, có 3 cơ sở dữ liệu, đó là SoybeanTFDB (Mochida, Yoshida et al 2009), SoyDB (Wang, Libault et al 2010) và PlantTFDB (Zhang, Jin et al 2011) cung cấp thông tin về các TF của đậu tương Chúng tôi xác định... khung đọc mở (open reading frame, ORF) được giữ lại để cho các nghiên cứu tiếp sau 3.1.2 Sự phân bố, cấu trúc và mối tương quan của các gen thuộc họ các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin trong hệ gen của đậu tương Trong số 51 GmARFs ở đậu tương, có 17 cặp gen được xác định là duplicates, trong đó mỗi cặp giống nhau ≥ 90% trình tự của nucleotide (Hình 3.1) Để dự đoán chức năng của các GmARF ở đậu tương, cây... trước, hạn làm thay đổi sự biểu hiện của rất nhiều gen GmARFs trong cả rễ và thân của cây đậu tương 12 ngày tuổi Gần đây, sử dụng 66 K Affymetrix Soybean Array GenChip, chúng tôi thực hiện nghiên cứu tổng thể sự phiên mã của toàn bộ các gen ở đậu tương ở giai đoạn V6 và R2 trong điều kiện hạn hán (Le, Nishiyama et al 2012) Các kết quả cho thấy, các gen GmARF biểu hiện phổ phiên mã đa dạng ở trong các. .. triển của rễ các cây max và WT trong điều kiện muối và áp suất thẩm thấu cao Kết quả cho thấy, sự sinh trưởng của rễ của các cây max và WT là không khác biệt trong các điều kiện nồng độ NaCl và manitol khác nhau (Hình 3.14) Điều này chứng tỏ rằng kiểu hình chống chịu kém với điều kiện bất lợi của các cây max không phụ thuộc vào ảnh hưởng của sự sinh trưởng và phát triển của rễ, ít nhất là ở điều ở cây... giống đậu tương chống chịu các điều kiện bất lợi, chúng tôi tiến hành xác định các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và truyền dẫn tín hiệu SL, đồng thời phân tích và đánh giá vai trò của SL trong sự đáp ứng với điều kiện mặn Các cây đậu tương được xử lý kết hợp giữa SL và NaCl thể hiện tính chịu mặn ưu việt trong điều kiện thí nghiệm Kết quả này cũng tương đồng với kết quả đánh giá khả năng chịu. .. của 3 mẫu khác nhau (D) Biểu đồ phân tích các gen giống và khác nhau ở các so sánh M-C, max2-3 ở điều kiện bình thường 0 h; M-D2, max2-3 ở điều kiện hạn 2 h; M-D4, max2-3 ở điều kiện hạn 4 h; W-C, Col-0 ở điều kiện bình thường, 0 h; WD2, Col-0 ở điều kiện hạn 2 h; W-D4, Col-0 ở điều kiện hạn 4 h 3.2.7 Strigolactone ngoại sinh tăng cường khả năng chịu mặn ở đậu tương Để phục vụ cho mục tiêu nghiên cứu. .. với DNA (DBD)), trong đó có chứa tiểu phần B3 và tiểu phần đáp ứng auxin (auxin- response, ARF), một vùng trình tự ở giữa (middle region (MR)) và một vùng trình tự phần đuôi (carboxy-terminal dimerization domain (CTD)) 11 | Page Hình 3.2: Cây phân tích phát sinh chủng loại của các yếu tố phiên mã đáp ứng auxin ở đậu tương và Arabidopsis Cây phân loại được thiết lập sử dụng trình tự của các protein ARF... kết quả đánh giá khả năng chịu mặn ở các dòng dột biến Arabidopsis Kết quả cho thấy tiềm năng ứng dụng SL trong chọn tạo giống đậu tương chịu mặn bằng công nghệ gen 23 | Page KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1 Xác định được 51 gen GmARF ở đậu tương, trong đó có 17 cặp gen tương đồng (gen chị em) Các yếu tố phiên mã GmARF được phân loại thành 6 nhóm dựa vào các đặc điểm trong cấu trúc phân tử protein... giảm sự biểu hiện ở rễ, có 12 gen (GmARF09, 10, 15, 18, 21, 27, 28, 33, 37, 38, 44, 49) tăng cường sự biểu hiện ở thân Trong đó, hai gen GmARF33 và GmARF50 có tiềm năng ứng dụng cho công tác chọn tạo giống đậu tương chống chịu hạn bằng công nghệ gen 4 Xác định được vai trò điều hòa dương tính của SL trong đáp ứng với điều kiện hạn và mặn Trong đó, các đặc điểm của phần thân đóng vai trò quan trọng hơn