NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lê Thị Ngọc Quỳnh NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA PROTEIN GIÀU METHIONINE TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Cán hƣớng dẫn: TS Lê Tiến Dũng PGS TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội  2015 Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 Methionine protein giàu Methionine 1.1.1 Tổng quan chung Methionine Met, axit amin chứa sulfur (methionine cysteine) axit amin khác lysine, threonine isoleucine tổng hợp từ họ aspartate Aspartate kinase enzyme đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine, threonine, Met isoleucine Enzyme xúc tác trình phosphoryl hóa aspartate cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate Thông thường, có hai dạng aspartate kinase tìm thấy thực vật β-aspartyl phosphate chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde sau homoserine, xúc tác tương ứng aspartic semialdehyde dehydrogenase homoserine kinase Tuy nhiên, thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine sinh tổng hợp Met Ophosphohomoserine (OPH), chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS) cystathionine gamma-synthase (CgS) OPH chuyển hóa trực tiếp thành threonine tham gia TS tham gia vào chế ba bước để tạo thành Met: phản ứng trùng ngưng cysteine OPH tạo thành cystathionine, sau thành homocysteine cuối thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-lyase homocysteine methyltransferase Cuối cùng, có khoảng 20% Met sử dụng làm thành phần tạo nên protein, có đến 80% Met biến đổi để tạo thành SAM, sản phẩm cuối đường sinh tổng hợp Met 1.1.2 Các protein giàu Methionine Met mã hóa ba AUG, mã mở đầu, xác lập tín hiệu bắt đầu trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit phân tử mRNA Do đó, nhóm sinh vật nhân chuẩn vi khuẩn cổ, Met thường xuất đầu N (Nterminal) chuỗi peptide Ở thực vật, vài protein giàu Met (MRP) nghiên cứu từ sớm nhiều loại trồng khác như: hạnh nhân Brazil, hạt hướng dương, ngô, lúa Các MRP tìm thấy hạt có hàm lượng Met khoảng 11-22% Gen mã hóa cho MRP có tên gọi 2S albumin nghiên cứu kỹ protein chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho trồng, đặc biệt cho họ đậu loại trồng thu củ rễ có hàm lượng thấp axit amin chứa sulfur Met 2S albumin từ hạnh nhân Brazil chứa 18% methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine Tuy nhiên, việc cải thiện hàm lượng Met loại hạt đậu không đủ để đáp ứng hàm lượng Met cần thiết thức ăn chăn nuôi Vai trò Met phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên cuộn gấp để tạo thành bậc cấu trúc không gian cho protein Met tìm thấy nhiều phần lõi kỵ nước cấu trúc không gian protein, protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép Tuy nhiên, protein có chứa Met bộc lộ bên bề mặt tiếp xúc dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide (MetO) tác động dạng oxy phản ứng Do đó, MRP xem protein mô hình để nghiên cứu cách hiệu oxy hóa Met loài sinh vật khác 1.2 Quá trình oxy hóa sửa chữa oxy hóa Methionine 1.2.1 Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo dạng oxy phản ứng Các dạng oxy phản ứng (ROS) phân tử hóa học cấu trúc chứa oxy, có khả phản ứng mạnh Khi nồng độ ROS tăng cao đem lại nhiều hậu nghiêm trọng Nghiên cứu ROS đóng vai trò phá hủy, bảo vệ truyền tín hiệu, tùy thuộc vào trình cân sản sinh loại bỏ ROS trung tâm hoạt động theo thời gian Khi điều kiện môi trường thay đổi, tín hiệu đáp ứng sớm tạo bao gồm: tăng tỷ lệ ion qua màng tế bào, tăng cường Ca2+ có mặt bào tương, kích hoạt protein MAPKs đặc biệt sản sinh ROS sau vài phút bị kích thích tác nhân sinh học phi sinh học ROS sinh bào quan khác dẫn đến thay đổi hệ phiên mã nhân tế bào, thông tin phải chuyển từ bào quan đến nhân tế bào Các tín hiệu thông qua ROS cần phải tiếp nhận khuếch đại, thường thông qua kinase hay phosphatase Hydrogen peroxide có khả oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu huỳnh Cys Met Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine tập trung nhiều nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác dẫn đến thay đổi khác protein Ngược lại, oxy hóa Met nhận quan tâm Trong thực vật, chức protein bị thay đổi trình oxy hóa Met công bố 1.2.2 Quá trình oxy hóa Methionine dạng oxy phản ứng Khi ROS tồn hàm lượng cao, Met tự Met phân tử protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) Met sulfone (MetO2) gắn thêm nguyên tử oxy MetO tồn với hai dạng đồng phân quang học methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) methionine-R-sulfoxide (Met-R-O) Ngược lại với MetO2 (một hợp chất tìm thấy hệ thống sinh học), cần lực oxy hóa mạnh tính thuận nghịch trình chuyển hóa Met MetO lại có tính thuận nghịch Protein mục tiêu mạnh trình oxy hóa gây gốc tự so với đại phân tử khác lipid DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa tế bào Trong tự nhiên, Met đóng vai trò chất chống oxy hóa, bảo vệ protein đại phân tử khác Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met protein bị oxy hóa đồng thời Tuy nhiên, tất gốc Met protein có mức nhạy cảm trình oxy hóa; mức phụ thuộc vào việc tác nhân oxy hóa tiếp cận Met vị trí khác bên cấu trúc protein nằm bề mặt hay phần lõi protein Shechter phát gốc Met chuỗi peptide protein bị biến tính bị oxy hóa hoàn toàn, protein tự nhiên gốc Met nằm bề mặt bị oxy hóa 1.2.3 Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine Oxy hóa Met xảy điều kiện hiếu khí điều tránh khỏi, tế bào sinh vật sống phát triển nhiều chế phức tạp enzyme để chống lại trình oxy hóa Met Ngược lại với MetO2, MetO chuyển hóa cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác enzyme Msr MsrA tham gia khử dạng Met-S-O tự Met-S-O protein MsrB khử Met-R-O tự thành Met hiệu so với dạng liên kết protein lực thấp với chất dạng tự Cả MsrA MsrB enzyme có tính bảo thủ cao vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực bao gồm tế bào người hầu hết sinh vật có chứa dạng enzyme MsrA MsrB MsrA dạng enzyme phổ biến, tìm thấy hầu hết sinh vật từ vi khuẩn đến trồng đến động vật có vú, có người Gần đây, họ enzyme Msr tìm thấy E.coli, có tính đặc hiệu hoạt tính khử Met-R-O dạng tự khả khử MetO liên kết protein gọi fRMsr (free Met-R-O) Đặc biệt, fRMsr tìm thấy vài sinh vật đơn bào Tuy nhiên điều kiện môi trường sống có nhiều bất lợi nay, đảm bảo cân việc sản sinh loại bỏ ROS bị phá vỡ nhiều tác nhân bất lợi ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt độ thấp cao tổn thương học Chính điều gây ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển trồng dẫn đến thiệt hại lớn sản lượng Tình hình nghiên cứu protein có methionine mẫn cảm với dạng oxy phản ứng 1.3.1.Tình hình nghiên cứu giới Các ảnh hưởng MetO đến protein chuỗi dẫn truyền tín hiệu ghi nhận Nhóm nghiên cứu Takahashi cs nghiên cứu protein Calmodulin tham gia vào trình dẫn truyền tín hiệu tế bào chức ổn định ROS đối tượng thực vật Mối liên quan trình oxy hóa Met với ổn định cấu trúc protein calmodulin chức protein ghi nhận Rosen cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả phân giải protein tế bào E.coli bị xử lý H2O2, HOCl với bạch cầu trung tính (neutrophil) Các phân đoạn peptide phân tích sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ Peptide phát tăng 16 Da Tuy nhiên, đáng tiếc nghiên cứu lại không danh sách hoàn chỉnh protein vị trí gốc Met bị mẫn cảm với trình oxy hóa Le cs (2009) việc biểu mức gen mã hóa Msr đem lại tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men tế bào động vật Bên cạnh đó, Liang cs tách dòng, biểu hiện, tinh phân tích khối phổ cho bốn MRP (chứa > 20% Met, chứa hay thiếu cystein) để nghiên cứu trình oxy hóa Met trình sửa chữa diễn nhờ Msr Thông qua đó, natri hypochlorite (NaOCl) có hiệu cao việc tạo MetO MRP Năm 2015, Jacques cs sử dụng phương pháp gọi COFRADIC để khảo sát phân bố vị trí MetO hệ protein mô hình điều kiện bất lợi oxy hóa Sử dụng Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả tìm thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa 400 protein, đồng thời định lượng protein đột biến bất hoạt enzyme catalase kiểu dại Tuy nhiên người ta ứng viên tiềm để tiếp cận phương pháp sắc kí lực khối phổ Hiện nay, có protein mẫn cảm với oxy hóa Met số có protein sửa chữa Msr điều chưa biết đến 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Ở Việt Nam, bước đầu có số nghiên cứu ảnh hưởng dạng oxy phản ứng đến trồng Mai Văn Chung công bố số kết bước đầu biểu dạng oxy phản ứng phản ứng bảo vệ đậu (Pisum sativum L.) chịu công rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn trùng chích hút nhựa có mức độ phá hoại đánh giá nguy hiểm nhiều trồng họ Fabaceae Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết nhân tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa diệp hạ châu, loài dược liệu quý trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp nhiều tỉnh Việt Nam Tuy nhiên, nghiên cứu sơ lược, bước đầu ảnh hưởng dạng oxy phản ứng với thực vật Việt Nam Tính đến thời điểm nay, chưa có công bố thức protein chứa Met mẫn cảm với tác nhân oxy hóa, oxy hóa Met ảnh hưởng qua lại chúng đến hoạt động Msr thực vật Đồng thời, để phát chứng minh protein đích tiềm cho việc can thiệp kĩ thuật di truyền, cần phải biết protein mẫn cảm với oxy hóa Met số chúng sửa chữa Msr Chính vậy, tiến hành “Nghiên cứu vai trò protein giàu Methionine Arabidopsis thaliana” Nghiên cứu hứa hẹn mở hướng nghiên cứu protein chứa Met mẫn cảm với trình oxy hóa Việt Nam Chƣơng – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Sau tìm gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất lợi, dòng Arabidopsis biểu mức gen tìm kiếm sở liệu Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản) Hạt Arabidopsis thaliana biểu mức gen mã hóa MRP nằm thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), cung cấp Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản Trong thư viện dòng FOX, cDNA hoàn chỉnh Arabidopsis điều khiển promoter 35S chèn vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin Plasmid chuyển vào Arabidopsis phương pháp nhúng hoa 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành theo quy trình trình bày Hình 2.1 2.2.1 Phƣơng pháp tiếp cận tin sinh học 2.2.1.1 Phương pháp giải chức gen mã hóa MRP Danh sách gen mã hóa MRP cung cấp nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp Trình tự polypeptide gen mã hóa MRP với định dạng fasta đưa vào phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) phần mềm Blast2goBasic phiên 3.0 (https://www.blast2go.com) để tiến hành phân loại chức gen Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm đƣợc sử dụng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú MRP tế bào, tệp fasta chứa toàn trình tự MRP Arabidopsis thaliana sử dụng làm đầu vào để tìm kiếm sở liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/), pSORT (http://www.psort.org/), CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) 2.2.1.2 Đánh giá biểu gen mã hóa MRP Arabidopsis điều kiện bình thường điều kiện bất lợi Sử dụng liệu microarray nghiên cứu trước để đánh giá mức độ biểu MRP điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn Các thử nghiệm tiến hành theo quy trình sau: Xử lý hạn: kết phân tích thu thập từ GEO NCBI Số hiệu truy cập GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04 năm 2015, tảng Platforms GPL12621, mẫu phân tích Samples từ GSM 1037236-GSM 1037247 Xử lý mặn: liệu nghiên cứu truy cập theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích Samples từ GSM795503 - GSM795514 Tất liệu thu thập để phân tích tiến hành khai thác liệu Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với điều kiện bất lợi xác định theo trình tự nhận biết Trình tự 1-kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) gen AtMRP tìm kiếm yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 2.2.2 Phương pháp tiếp cận thực nghiệm 2.2.2.1 Đánh giá hình thái chuyển gen At3G55240 Hạt Arabidopsis chuyển gen đối chứng sau khử trùng gieo đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có kháng sinh hygromycin, điều kiện phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối 16:8 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 24±2oC Quan sát hình thái đĩa thạch ½ MS giai đoạn khác Chọn 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Quan sát thay đổi hình thái giá thể đất tuần tuổi khác 2.2.2.2 Đánh giá mức độ đáp ứng chuyển gen điều kiện bất lợi Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt chuyển gen đối chứng môi trường ½ MS có kháng sinh hygromycin Chuyển 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl nồng độ 175 mM Cây sống sót môi trường có bổ sung NaCl đếm từ ngày thứ đến ngày thứ Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt chuyển gen đối chứng môi trường ½ MS có kháng sinh hygromycin Chuyển 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride nồng độ 750 µM Cây sống sót môi trường có bổ sung CdCl2 đếm từ ngày thứ đến ngày thứ Thử nghiệm với paraquat Arabidopsis: Thí nghiệm tiến hành dựa nghiên cứu trước Yang cs (2007) có cải biến Gieo hạt chuyển gen đối chứng môi trường ½ MS đặc có kháng sinh Hygromycin Chọn 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) môi trường ½ MS chuyển sang giá thể đất Lá tuần tuổi cắt ngâm dung dịch paraquat nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM 2µM, giữ điều kiện tránh ánh sáng vòng 1-2h sau chuyển điều kiện ánh sáng liên tục 24 oC quan sát màu xanh sau 24 Chƣơng – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân tích tin sinh học cho gen mã hóa MRP 3.1.1 Tìm kiếm xác định gen mã hóa MRP Arabidopsis Tất gen mã hóa cho protein có kích thước lớn 95 gốc axit amin chứa hàm lượng Met từ % coi MRP Danh sách 121 gen AtMRP cung cấp nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp MAPMAN công cụ cho phép giải chức gen Kết phân tích cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ chưa xác định chức tế bào Số lại đóng vai trò quan trọng tế bào (Bảng 3.1) Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với AtMRP, chiếm %) nhóm chức quan tâm phân tích MRP Những phân tích MRP biết chức cho thấy vai trò thiết yếu protein giàu Met nói riêng tham gia vào tế bào thực vật MRP Bảng 3.1 Phân loại chức gen mã hóa MRP Arabidopsis theo Mapman Nhóm chức gen AtMRP Kiểm soát ion kim loại Phản ứng điều kiện bất lợi Xử lý RNA Điều hòa phiên mã RNA 20 Biến đổi protein 12 Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+) Chu trình tế bào Sự phát triển Vận chuyển (kim loại) Chưa biết chức 56 (Một số gen phân loại vào nhiều nhóm chức năng) 10 Sản phẩm gen AtMRP phân loại dựa vào phần mềm BLAST2GO phiên 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: trình sinh học (Hình 3.1), thành phần tế bào (Hình 3.2) chức phân tử (Hình 3.3) Kết phân loại chức gen nhờ phần mềm BLAST2GO cho thấy tầm quan trọng MRP, tham gia vào nhiều chức trình sinh học thực vật, giữ chức phân tử tham gia vào thành phần quan trọng tế bào Hình 3.1 Phân loại chức gen AtMRP theo trình sinh học (Các gen phân loại vào nhiều nhóm chức năng) Hình 3.2 Phân loại chức gen AtMRP theo thành phần tế bào (Các gen phân loại vào nhiều nhóm chức năng) 11 Hình 3.3 Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức phân tử (Các gen phân loại vào nhiều nhóm chức năng) Để nhận biết đích đến MRP tế bào, sử dụng công cụ bao gồm ChloroP, pSORT CELLO để dự đoán dựa trình tự polypeptide 121 MRP định dạng fasta Kết 21 MRP dự đoán có đích đến lục lạp ChloroP và/hoặc pSORT, có MRP dự đoán cư trú ty thể tế bào thực vật pSORT và/hoặc CELLO (Hình 3.4) Trong đó, có protein dự đoán nằm lục lạp ChloroP pSORT có protein dự đoán ty thể pSORT CELLO (Hình 3.4) ChloroP pSORT 10 CELLO pSORT 21 A Lục lạp B Ty thể Hình 3.4 Dự đoán vị trí MRP tế bào Arabidopsis thaliana phần mềm ChloroP, pSORT CELLO Như vậy, để làm rõ đích tác động trình oxi hóa khử Met thực vật, nghiên cứu số lượng lớn MRP tham gia vào trình quan trọng tế bào kiểm soát trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+ Sản phẩm gen dự đoán nằm bào quan giàu ROS lục lạp ty thể, góp phần làm sáng tỏ chức MRP tế bào 12 3.1.2 Đánh giá biểu gen mã hóa MRP Arabidopsis điều kiện thường điều kiện bất lợi Trong điều kiện chịu mặn, 11 17 gen có mức độ biểu phiên mã tăng giảm lần Trong khi, 23 16 gen có mức độ biểu tương ứng cao thấp điều kiện chịu hạn Trong đó, gen có đáp ứng tăng gấp lần gen giảm biểu lần hai điều kiện cực đoan thí nghiệm Gen At3G59900 có biểu tăng 10,7 lần điều kiện chịu hạn lại giảm biểu -2,6 lần điều kiện chịu mặn Tổng số 10 gen mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh điều kiện hạn hán mặn Bảng 3.2 Bảng 3.2 Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán độ mặn cao Số lần thay đổi mức độ biểu Met Chiều TT Tên gen Mô tả gen (%) dài (a.a) Xử lý Xử lý hạn mặn Protein chứa vùng LEA At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 nhóm I At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết Biểu mức dẫn At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9 đến “giả vàng úa ánh sáng” At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết Nhân tố phiên mã bHLH At3G62090 6,38 346 64,6 2,3 liên quan đến yếu tố MYC Gen giả mã hóa cho At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0 protein họ chuỗi truyền điện tử P450 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11 Nhân tố phiên mã liên At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 quan đến kéo dài 10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết Ichikawa cs (2006) báo cáo biểu mức gen gây tượng “giả vàng úa điều kiện ánh sáng” At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp) 13 Các trình tự tương đồng với gen tìm thấy họ đậu họ lúa không tìm thấy động vật có vú Điều cho thấy gen mã hóa cho protein đặc trưng biểu thực vật Tuy nhiên, chưa có công bố báo cáo liên hệ gen At3G55240 với chống chịu điều kiện bất lợi Chính vậy, chọn At3G55240 gen ứng viên cho nghiên cứu để làm rõ vai trò gen trồng điều kiện cực đoan 3.1.3 Dự đoán yếu tố điều hòa cis promoter gen mã hóa MRP đáp ứng điều kiện bất lợi Cả yếu tố cis tìm thấy gen AtMRP Trong đó, MYBR tìm thấy 21 gen AtMRP, ABRE có mặt 19 gen AtMRP, 16 gen AtMRP có chứa MYC, gen AtMRP có chứa ICEr2 RSRE có mặt gen AtMRP Khi phân tích có mặt số yếu tố cis nằm vùng promoter AtMRP, ABRE tìm thấy lặp lại lần gen At1G32560, mã hóa cho LEA nhóm I Kết phù hợp với nghiên cứu Hundertmark cs, 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết yếu tố ABRE vùng promoter Trong nghiên cứu này, phát có trung bình 0,61 yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi promoter gen AtMRP Ở Arabidopsis, gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán độ mặn cao có trung bình 0,83 yếu tố cis promoter gen Điều cho thấy tăng nhẹ tần số xuất yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi promoter MRP có mức độ phiên mã tăng lên điều kiện hạn hán chịu mặn 14 3.2 Phân tích thực nghiệm Arabidopsis tăng cƣờng biểu gen At3G55240 (dòng RBC1) 3.2.1 Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử dòng chuyển gen Hạt giống dòng chuyển gen tăng cường biểu gen At3G55420 (gọi tắt dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) tiến hành xác định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử Kết nảy mầm hạt RBC1 môi trường chứa không chứa kháng sinh hygromycin thể qua Hình 3.5 Như vậy, với tỷ lệ nảy mầm 100% môi trường không xuất bị chết trắng sau nảy mầm, hạt RBC1 đồng hợp tử, đủ điều kiện để tiến hành cho thí nghiệm Tuy nhiên, sức nảy mầm phát triển hạt có khác biệt định, nguyên nhân độ mẩy lép hạt thí nghiệm Hình 3.5 Dòng RBC1 đƣợc nảy mầm, A môi trƣờng ½ MS đặc chứa kháng sinh hygromycin 15mg/l, B môi trƣờng ½ MS đặc 3.2.2 Đánh giá hình thái dòng chuyển gen a Hình thái đĩa thạch Quan sát hình thái đĩa thạch giai đoạn 7, 10 14 ngày tuổi Kết so sánh hình thái dòng RBC1 đối chứng kiểu dại đĩa thạch trình bày Hình 3.6 15 Hình 3.6 Hình thái dòng RBC1 đối chứng kiểu dại đĩa thạch b Hình thái giá thể đất Chọn 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) môi trường ½MS chuyển sang giá thể đất Sự thay đổi hình thái giá thể đất ghi nhận giai đoạn 3, tuần tuổi Kết so sánh hình thái dòng RBC1 đối chứng kiểu dại môi trường giá thể đất minh họa Hình 3.7 Hình 3.7 Hình thái dòng RBC1 đối chứng giá thể đất A Cây tuần tuổi, B Cây tuần tuổi, C Cây tuần tuổi 16 Qua phân tích hình thái đĩa thạch giá thể đất giai đoạn phát triển khác nhau, dòng RBC1 thể kiểu hình có màu xanh nhạt khác biệt so với dòng đối chứng Kiểu hình tương tự vàng úa điều kiện ánh sáng yếu hay gọi “sự giả vàng úa ánh sáng” gọi tắt PEL (Pseudo-Etiolation in Light) Tuy nhiên, kiểu hình PEL lại không ảnh hưởng đến khả quang hợp dòng RBC1 Lục lạp có cấu trúc tương đối bình thường ngoại trừ khả tổng hợp tinh bột thấp so với dòng đối chứng Các dòng tăng cường biểu gen At3G55240 ngân hàng dòng FOX RIKEN có mức độ phiên mã gen tăng lên 1x103 1x108 lần so với kiểu dại Khi mức độ biểu At3G55240 tăng số lượng lục lạp giảm Như vậy, mức độ biểu At3G55240 tỷ lệ nghịch với hàm lượng lục lạp 3.2.3 Đánh giá đáp ứng dòng chuyển gen với điều kiện bất lợi Để kiểm tra việc giảm biểu At3G55240 có liên quan đến tín hiệu phòng vệ, gen At3G55240 biểu mức mô hình A thaliana thử nghiệm phản ứng số điều kiện bất lợi thường gặp Gieo dòng hạt chuyển gen RBC1 hạt đối chứng kiểu dại môi trường ½ MS tương ứng có kháng sinh hygromycin 15mg/l Chọn có kích thước tương đương giai đoạn 12 ngày tuổi chuyển sang loại môi trường: (i) Môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl nồng độ 175 mM: đĩa thử nghiệm NaCl, lặp lại lần (ii) Môi trường ½ MS, có bổ sung CdCl2 nồng độ 750 µM: đĩa thử nghiệm CdCl2, lặp lại lần (iii) Môi trường ½ MS: đĩa đối chứng Đếm sống sót môi trường NaCl CdCl2 ngày thứ đến ngày thứ Kết thử nghiệm kháng mặn nồng độ NaCl 175 mM biểu Hình 3.8 Hình 3.9 17 Hình 3.8 Đĩa thạch mang RBC1 kiểu dại môi trƣờng ½ MS Hình 3.9 Thử nghiệm chịu mặn dòng đối chứng dòng RBC1 Cây 12 ngày tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 175 mM NaCl 18 Hình 3.10 Thử nghiệm cadmium dòng đối chứng dòng RBC1 Cây 12 ngày tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 750 µM CdCl2 Kết cho thấy dòng đối chứng (kiểu dại) dòng chuyển gen RBC-1 có biểu đáp ứng nhạy cảm điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất bị trắng sau ngày chuyển đĩa) Như vậy, việc biểu mức At3G55240 mô hình A thaliana nhiều khả làm gia tăng mức độ nhạy cảm tế bào nồng độ NaCl cao Sau ngày kể từ ngày chuyển sang môi trường ½ MS có chứa CdCl2 750µM, dòng RBC-1 bắt đầu có tượng vàng úa Như vậy, RBC-1 xuất triệu chứng bị gây độc Cd sớm so với giống kiểu dại (Hình 3.8 Hình 3.10) Do vậy, dễ dàng nhận thấy việc biểu mức At3G55240 mô hình A thaliana làm gia tăng mức độ nhạy cảm tế bào với CdCl2 nồng độ cao Cuối cùng, dòng RBC1 so sánh với dòng đối chứng thí nghiệm nhạy cảm với thuốc diệt cỏ paraquat Paraquat hợp chất có hoạt tính khử, nguyên nhân sinh anion superoxide tế bào ghi nhận Arabidopsis Nicotiana benthamian Do đó, paraquat gây nên phá hủy giết chết tế bào Hình 3.11 Thử nghiệm paraquat dòng đối chứng dòng RBC1 Kết thí nghiệm cho thấy tăng cường mức độ phiên mã gen At3G55240 dòng RBC1 làm tăng tính nhạy cảm tế bào với paraquat (Hình 3.11) Lá dòng RBC1 xử lý với paraquat bị diệp lục trở nên trắng hoàn toàn sau 24 xử lý Điều nhận thấy tất nồng độ sử dụng thí nghiệm 0,5, µM Ngược lại, dòng đối chứng bị diệp lục mức độ chậm so với RBC1 Tóm lại, việc biểu mức At3G55240 mô hình A thaliana cho thấy gia tăng mức độ nhạy cảm tế bào điều kiện chịu mặn, bị gây độc 20 CdCl2 thuốc diệt cỏ paraquat Điều gợi ý gen At3G55240 đóng vai trò trình loại bỏ ROS Ở thực vật, ROS đóng vai trò tín hiệu quan trọng chất truyền tin thứ hai việc kích hoạt chế phòng thủ chống lại điều kiện bất lợi Khi nhận tín hiệu từ ROS điều kiện căng thẳng oxy hóa, thực vật thường phản ứng lại cách kích hoạt loạt chế phản ứng phức tạp để khử ROS, nhờ hoạt động chất loại bỏ ROS có chất enzyme Do đó, biểu mạnh mẽ protein có vai trò dọn dẹp ROS giai đoạn đầu điều kiện bất lợi làm giảm tín hiệu kích hoạt chế phòng thủ, giảm khả kháng lại thực vật Bên cạnh đó, ảnh hưởng MRP đến phản ứng trước số điều kiện bất lợi nghiên cứu Calmodulin protein tập trung nghiên cứu ảnh hưởng oxy hóa Met đến việc rối loạn làm chức protein Đột biến Arabidopsis cách chèn thêm đoạn T-DNA vào gen mã hóa cho calmodulin góp phần khẳng định vai trò đặc biệt gen đến trình chống chịu thực vật với điều kiện bất lợi gây paraquat H2O2; cụ thể, đột biến gen mã hóa calmodulin calmodulin cho thấy tăng tính nhạy cảm paraquat H2O2 trình nảy mầm sinh trưởng hạt Protein sốc nhiệt Hsp21 protein đích nghiên cứu nhiều trình oxy hóa Met ảnh hưởng trồng Dòng biểu mạnh Hsp21 bị ảnh hưởng trọng lượng tươi lớn dòng đối chứng Do vậy, protein giúp tăng cường sống sót cho tế bào thực vật điều kiện bất lợi oxy hóa Chính vậy, thông qua nghiên cứu này, gen At3G55240 dự đoán mã hóa cho protein đóng vai trò việc khử ROS Kết bước đầu cung cấp dẫn liệu cho nghiên cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trò gen mã hóa MRP liên quan đến tính chống chịu thực vật, đích tác động Msr bên cạnh số MRP công bố trước calmodulin hsp21 21 KẾT LUẬN Từ kết phân tích thu rút số kết luận sau: Hệ gen Arabidopsis thaliana có chứa 121 gen mã hóa MRP, khoảng 50% biết chức đóng vai trò quan trọng trình tế bào tham gia vào tín hiệu Ca2+, kiểm soát trình phiên mã RNA Trong số có 21 MRP có đích đến lục lạp MRP cư trú ty thể Trong tổng số gen mã hóa MRP Arabidopsis có 39 gen đáp ứng phiên mã điều kiện hạn hán, 28 gen đáp ứng phiên mã điều kiện mặn Trong đó, gen At3G55240 có biểu giảm mạnh điều kiện hạn hán mặn Dòng Arabidopsis chuyển gen RBC1 biểu mức gen At3G55240 sinh trưởng phát triển tốt, nhiên lại có đặc điểm hình thái đặc trưng giả vàng úa ánh sáng Dòng chuyển gen RBC1 mẫn cảm (nhạy cảm hơn) với điều kiện mặn, CdCl2 thuốc diệt cỏ paraquat KIẾN NGHỊ Để tiếp tục phát triển kết nghiên cứu phạm vi đề tài, có số kiến nghị sau: Sử dụng phương pháp thực nghiệm, ví dụ phương pháp phân tích hình thái phương pháp thử nghiệm số điều kiện bất lợi, để làm rõ vai trò số gen mã hóa MRP chưa biết chức mà có đáp ứng phiên mã mạnh với điều kiện bất lợi nghiên cứu này, ví dụ gen At4G34590 tăng cường biểu lên đến 337,5 lần điều kiện hạn hán Mở rộng nghiên cứu, trước mắt phạm vi lĩnh vực tin sinh học, MRP nông nghiệp quan trọng khác lúa gạo, ngô sắn 22 [...]... RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên môi trường giá thể đất được minh họa trong Hình 3.7 Hình 3.7 Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất A Cây 3 tuần tuổi, B Cây 4 tuần tuổi, C Cây 5 tuần tuổi 16 Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch và cây trên giá thể đất ở các giai đoạn phát triển khác nhau, dòng cây RBC1 thể hiện kiểu hình có lá màu xanh lá cây nhạt khác biệt so với dòng cây. .. hoạt động của các chất loại bỏ ROS có và không có bản chất enzyme Do đó, biểu hiện mạnh mẽ của protein có vai trò dọn dẹp ROS ở giai đoạn đầu của điều kiện bất lợi sẽ làm giảm tín hiệu kích hoạt cơ chế phòng thủ, giảm khả năng kháng lại của thực vật Bên cạnh đó, ảnh hưởng của MRP đến phản ứng của cây trước một số điều kiện bất lợi cũng được nghiên cứu Calmodulin là protein được tập trung nghiên cứu về... cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.6 15 Hình 3.6 Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch b Hình thái cây trên giá thể đất Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi trường ½MS chuyển sang giá thể đất Sự thay đổi hình thái cây trên giá thể đất được ghi nhận ở giai đoạn 3, 4 và 5 tuần tuổi Kết quả so sánh hình thái dòng cây. .. mầm và sinh trưởng của hạt Protein sốc nhiệt Hsp21 cũng là protein đích được nghiên cứu nhiều quá trình oxy hóa Met và ảnh hưởng của nó đối với cây trồng Dòng cây biểu hiện mạnh Hsp21 ít bị ảnh hưởng và trọng lượng tươi vẫn lớn hơn dòng cây đối chứng Do vậy, protein này giúp tăng cường sự sống sót cho tế bào thực vật trong những điều kiện bất lợi oxy hóa Chính vì vậy, thông qua nghiên cứu này, gen At3G55240... cho protein đóng vai trò trong việc khử ROS Kết quả này bước đầu sẽ cung cấp những dẫn liệu cho nghiên cứu thực nghiệm nhằm phân tích vai trò của gen mã hóa MRP liên quan đến tính chống chịu ở thực vật, về đích tác động của Msr bên cạnh một số MRP được công bố trước đây như calmodulin và hsp21 21 KẾT LUẬN Từ kết quả phân tích thu được chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: 1 Hệ gen của cây Arabidopsis. .. promoter của AtMRP, ABRE được tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA nhóm I Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra rằng 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng promoter Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP Ở Arabidopsis, ... 0,83 yếu tố cis này trên promoter của mỗi gen Điều này cho thấy sự tăng nhẹ về tần số xuất hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP có mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn 14 3.2 Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cƣờng biểu hiện gen At3G55240 (dòng RBC1) 3.2.1 Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen Hạt... phương pháp thử nghiệm trên một số điều kiện bất lợi, để làm rõ hơn vai trò của một số gen mã hóa MRP chưa biết chức năng mà có đáp ứng phiên mã mạnh với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra trong nghiên cứu này, ví dụ gen At4G34590 được tăng cường biểu hiện lên đến 337,5 lần trong điều kiện hạn hán 2 Mở rộng nghiên cứu, trước mắt trong phạm vi lĩnh vực tin sinh học, đối với MRP trên các cây nông nghiệp quan... nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1 Cây 12 ngày tuổi đƣợc chuyển sang môi trƣờng ½ MS có chứa 750 µM CdCl2 Kết quả này cho thấy cả dòng cây đối chứng (kiểu dại) và dòng cây chuyển gen RBC-1 đều có biểu hiện đáp ứng nhạy cảm trong điều kiện nồng độ NaCl cao (sự xuất hiện các cây bị trắng lá sau 4 ngày chuyển đĩa) Như vậy, việc biểu hiện quá mức At3G55240 trên cây mô hình A thaliana nhiều... bào Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Bảng 3.1) Trong đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein (12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+ (tương ứng với 6 AtMRP, chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP Những phân tích trên MRP đã biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng