Tạo kháng thể đa dòng kháng duch(drosophila ubiquitin carboxyl terminal hydrolase) và bước đầu ứng dụng trong nghiên cứu vai trò của protein uch đối với bệnh parkinson

H    TO KHÁNG TH Drosophila UBIQUITIN CARBOXYL-TERMINAL HYDROLASE) U NG DNG TRONG NGHIÊN CU VAI TRÒ CA PROTEIN I VI BNH PARKINSON      - 2011 t nghip Li c LỜI CÁM ƠN Trong suốt thời gian dài học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp, em luôn nhận được sự chia sẽ, giúp đỡ của rất nhiều Thầy Cô, bạn bè, người thân. Bằng tất cả lòng biết ơn em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người! Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn tất cả Quý Thầy Cô trường trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã truyền đạt cho em những kiến thức nền tảng và sâu rộng, giúp em có được lượng kiến thức vững chắc, tự tin trong ngành nghề chuyên môn của mình. Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy GS.TS. Trần Linh Thước đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho biết bao thế hệ sinh viên một cách tận tâm, nghiêm túc. Cám ơn Thầy đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận trong Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Phân Tử và Môi Trường, trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên. Đặc biệt, em xin gửi lời cám ơn đến Cô TS. Đặng Thị Phương Thảo, người trực tiếp hướng dẫn và tạo nhiều điều kiện để em thực hiện tốt khóa luận này. Cô hay nói em rất may mắn. Em nhận thấy may mắn lớn nhất của em khi được là học trò của Cô. Cô là người Thầy tận tâm chỉ dẫn về mặt kiến thức chuyên môn cũng như truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong quá trình làm thí nghiệm, là người chị gần gũi chia sẽ những khó khăn cùng em, giúp em tự tin hơn về bản thân mình. Em xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Thu Trang, Trang luôn là người bạn giúp đỡ chia sẽ với em trong mọi việc, là người truyền đạt cho em những kiến thức quý báu một cách nhiệt tình và tận tâm. Em xin cảm ơn Ths. Trần Thanh Hòa, chị Hà Minh Nguyệt, em Phan Nguyễn Thụy An, em Nguyễn Thị Tường Vy, nhóc Đặng Ngọc Ánh Sương sẵn sàng hỗ trợ em hết mình. Em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người trong Lab A đã tạo điều kiện thuận lợi về mọi mặt đặc biệt là tinh thần để em luôn cảm thấy thật vui và thật may mắn được gặp mọi người. Em xin chân thành cám ơn các đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành tốt mọi việc như thời gian qua. Mọi người như những người bạn thật sự luôn chia sẽ, động viên khi em gặp khó khăn. t nghip Li c Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba má. Với niềm tự hào là con của ba má giúp con luôn vững bước, cố gắng trong đường đời. Em xin cảm ơn các anh chị em đã luôn thương yêu, quan tâm. Gia đình luôn là nơi chốn yên lành để mỗi người cảm thấy được yêu thương nhất! Em xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08/2011 Nguyễn Thị Quỳnh Trâm tt nghip Li m u Trang 1 LI M U Parkinsonmt trong các i, là v       liu ch  mc tm thn hu qu ca bnh ch không th cha khi hoàn toàn.   ch phát sunh bnh Parkinson vn    Parkinson vn còn . Ðiu mà y khoa hc bit rõ v bnh Parkinson là t bào vùng cht xám ca não b i bnh b hy hoi và không sn xuc cht dopamine. Nguyên nhân gây ra s hy hoi các t bào ca vùng cht xám v  c bit rõ. Tuy nhiên, nhiu công b khoa hc cho thy s suy thoái t bào thn kinh gây ra bi s ri lon cha h thng ubiquitin-i vi bnh Parkinson, có nhiu nghi ng v vai trò ca protein UCH-L1 (Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase L1), mt protein có vai trò trung tâm trong h thng ubiquitin-proteasome, trong tin trình phát sinh bnh. Trong nhiu mô hình nghiên cu bc s dng rng rãi, mô hình rui gim chuyn gen cho thy nhim ni trVòng i ngn, th h con khá nhiu, b máy di truyn nh gc bit rõ v c m di truyn, tng vi gen gây bnh  i, có th thc hin thao tác trên các dòng rui khác nhau mà không b gii hn bnh v o c sinh hc   ca chúng tôi tp trung vào nghiên cu trên protein UCH-L1, Drosophila melanogaster.  -   tt nghip Li m u Trang 2 -               -  mt cha gen thông qua táng ca k thut knock-out hoc knock-down.    t ra nhm mc tiêu:  UCH-L1 ca rui gim và   . Vi m  tài thc hin mt s  1. To dòng t bào E. coli mang gen duch 2. Biu hin gen duch và thu nhn, tinh sch protein dUCH 3. S d ng min dch to kháng th kháng dUCH 4. Kim tra kháng th 5. ng dng kháng th trong các nghiên cu vai trò dUCH trên mô hình rui gim chuyn gen. a. Biu hit mc protein dUCH ti nhng mô chuyên bit: mô mt và mô não rui. b. Kho sát ng trên kiu hình ca rui gim chuyn gen biu hit mc dUCH ti mô mt và não. t nghip Mc lc  DANH MC CÁC CH VIT TT i  ii DANH MC HÌNH iii Li m u 1  1.1. -- 3 1.1.1. -proteasome 3 1.1.2. - 5 a.  5 b. - 8 1.2.  12 1.2.1.  12 1.2.2.          Drosophila melanogaster 13 1.2.3.  GAL4 15 1.2.4.     Drosophila Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L1) 18 1.3.  19 1.3.1.  thng min dch 19 1.3.2. S to máu 20 1.3.3.  ng min dch to kháng th 23 a.  23 b.  30 1.4.  40 1.4.1.  41 1.4.2.  42 - 2.1. VT LIU 44 t nghip Mc lc 2.1.1. Dng c và thit b 44 2.1.2. ng 52 2.1.3. Nguyên vt liu 53 2.2.  55 2.2.1. To dòng E.coli  hp pET28a/duch 55 2.2.2. Cm ng biu hi t mc protein tái t hp 6xHis-dUCH trong E. coli BL21 62 2.2.3. Tinh ch và thu nhn protein tái t hp 6xHis  dUCH 68 2.2.4. ng min dch trên th 69 2.2.5. X lý huyt thanh th c 70 2.2.6. Kim tra kh n ng ca kháng huyt thanh b ELISA 70 2.2.7. ng dng trong nghiên cu bnh Parkinson trên mô hình rui gim chuyn gen 72 - 3.1. To dòng E.coli mang gen biu hin protein dUCH 80 3.1.1. Thu nhn gen mã hóa cho protein dUCH 81 3.1.2. Thu nhn plasmid pET28a 81 3.1.3. To dòng t bào E. coli  hp pET28a/duch 82 3.2. Sàng lc và kim tra vector tái t hp mang gen mc tiêu 83 3.2.1. Sàng lc th bin np mang cDNA ca gen duch b pháp PCR khun lc 83 3.2.2. Kim tra vector tái t hp 85 3.3. Cm ng biu hin protein tái t hp 6xHis-dUCH trong E.coli 87 3.3.1. Bin np pET28a/duch vào chng biu hin E. coli BL21(DE3) 87 3.3.2.               PAGE 88 3.3.3. Chng minh s biu hin ca protein tái t hp 6xHis-dUCH bng  90 t nghip Mc lc 3.4. Tinh ch thu nhn protein tái t hp 6xHis-dUCH 91 3.5.  ng c 93 3.6.  96 3.6.1.  E.coli 96 3.6.2.  97 3.7.                98 3.7.1.  GAL4 98 3.7.2.  GAL4 102 -  106  ngh: 107 TÀI LIU THAM KHO 109 [...]... 1.2.4 ệ dUCH (Drosophila Ubiquitin carboxyl- terminal hydrolase) , ố ệ , , ơ ế ủ ử ụ ế protein dUCH, ự ả m ệ ệ, ử ụ ệ m ế protein dUCH ạ ố ự m t ch - m ệ m - - ủ ộng của kỹ thu t knock-out ho c knock-down ế m m ả ử ụ W m , mm ộ ờ mễ ệ m ụ dUCH , ụ ủ m ỉ , -L1 (Human Ubiquitin carboxyl- terminal hydrolase L1 , ơ dUCH , ộ ệ ỹ , , ờ - dUCH ơ ệ ử ụ ế m Drosophila 1: Giá tham khảo kháng thể kháng h C -L của một... tử của bệnh vẫ c biết rõ [13],[34] : Mối liên hệ giữa một số gen và bệnh Parkinson 18] SNCA: SNCA của ệ m alpha-synuclein Trong các tế bào não nhân bệnh Parkinson, ột biến Lewy gen SNCA ố yt ph p c tìm th y trong c gọi là ờ ủ bệnh Parkinson ờng): PARK2 PARK2 (bệnh Parkinson l n, Parkin ột biến của gen PARK2 chủ yếu thành niên m c bệnh Parkinson Parkin c tìm th y m nh ời ờng giúp các tế bào phân hủy và. .. ọ % - 2%) - ọ ọ enzyme có vai trò trong việc hình thành liên kết ệ uC của protein trong quy trình g n ubiquitin của nh ng protein g p cuộn sai, protein Trang 8 ổ tốt nghiệp m già c i không mong muốn c n phân hủy b ỏ ạ ệ - ố m , m - ụ ệ ố ẫ ế m m , ệ , ơ ử ế ệ ế mộ mố rằng sự sai hỏng hệ thống ubiquitin- proteasome và sự tích tụ nh ng protein b biến ổ ến bệnh Parkinson [3] Protein ạ ộ ủ ằ ủ ệ m ố , mộ... bộ ph tạo ra hành ộng Trong bệnh Parkinson, tế bào của vùng ch t xám b hủy hoại và không sản ạn, khiế xu t ra dopamine Các tín hiệu xu t phát t não b không ki m c các cử ộ , èm của bệnh thoái hóa th thành các th Lewy ệu mộ ời bệnh ờ i sự tích tụ, t p h p protein và sự hình bệnh Parkinson [17], [22], [37] ả ế ệ m h Nguyên nhân gây ra sự hủy hoại các tế bào của vùng ch t xám vẫ c biế ng tiến bộ của di... khác nhau của bệnh [25], nhóm của Xun và cộng sự, nghiên c u sự bi u hiện củ α – synuclein m c d ch mã trên mô hình ru i gi m chuy n gen và so sánh v i nh ng công trình nghiên c u khác m c phiên mã ạn khác nhau của bệnh [30], hay nhóm Auluck [4], nhóm Feany và Bender [11 … 1.2.3 ợ đ Trong các mô hình ru i gi m Drosophila melanogaster, – GAL4 [6] ờ dụng công cụ di truy n P-element dòng hóa vào vector chuyên... di truy n học, kỹ Trang 6 ổ tốt nghiệp thu t y khoa tiên tiến và nh ng bằng ch ng thực nghiệm ệ u quy v một mối rằng sự sai hỏng hệ thống ubiquitin- proteasome và sự tích tụ nh ng protein b biế ổi ến bệnh Parkinson Một vài nghiên c u cho th y bệnh Parkinson có ến một số ột biế α – synucein (SNCA), ubiquitin carboxy- terminal hydrolase L1 (UCH- L1), parkin (PRKN), leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2 hay... tìm Parkinson PINK1 (PTEN-induced putative kinase 1): th y trong sự kh u s m bệnh Parkinson Ch ế do PINK1 Một số ế , chính xác của các protein ỏ có th bảo vệ nhiễm s c th khác và các gen GBA (glucosidase beta acid), SNCAIP (synuclein alpha interacting protein) , UCH- L1 (ubiquitin carboxylcó th liên quan ến bệnh Parkinson terminal esterase L1) ơ ế ệ ủ , ế ẫ gen b M ế C - 38],[39] [5], [7], [15], [24],... sử dụng cho quá trình sinh tổng h c khi vào proteasome, chu i ubiquitin s tách khỏ monomer ubiquitin b ệ ố m c tháo rời thành các ử D m ọ UBPs m (ubiquitin processing m m ử dụng cho quá trình ubiquitin hóa [22] 1.1.2 - a Bệ n [7], [12], [19], [20], [35] ờng gọi cho ch ng bệ ế ến là bệnh Liệt rung Bệnh Parkinson là bệnh rối loạn th n kinh phổ biến nh , ả Trang 5 ế ổ tốt nghiệp ả % ố 5 ổ, ỉ ng sau bệnh. .. khi có yêu c u tạo máu thì các tế bào gốc s th hiện khả mạnh m Trang 20 ổ tốt nghiệp ệ : Sự tạo máu [27] ạn s m của quá trình tạo máu một tế bào gố ệt hóa ờng, s làm xu t hiện tế bào ti n thân dòng lympho chung theo mộ ủ hay tế bào ti m ờ ủng loại và số ng các yếu tố ng c biệt ki m soát sự biệt hóa của tế bào gốc và tế bào ti n thân Trang 21 ổ tốt nghiệp m ờ n của các dòng lympho và dòng tủy, ế bào... ạt E3 - ubiquitin ligase - chuy ủ ả ệ ến g m m ệ ễ  Kh u là nhóm terminal carboxyl của ubiquitin c g n vào c u nối thioester v i một gốc cysteine trên Ubiquitin- Activating Enzyme (E1) c có tiêu tố ng ATP Ub-COOH + ATP + E1  Ub-CO-S-E1 + AMP + PPi  c chuy n cho một nhóm cystein nằm trên UbiquitinConjugating Enzyme (E2) Ub-CO-E1 + E2  Ub-CO-E2 + E1  Ubiquitin- Protein Ligase (E3) hủy nh protein mục . thng ubiquitin- i vi bnh Parkinson, có nhiu nghi ng v vai trò ca protein UCH- L1 (Ubiquitin Carboxyl-terminal Hydrolase L1), mt protein có vai trò trung tâm trong h thng ubiquitin- proteasome,.  TO KHÁNG TH Drosophila UBIQUITIN CARBOXYL-TERMINAL HYDROLASE) U NG DNG TRONG NGHIÊN CU VAI TRÒ CA PROTEIN I VI BNH PARKINSON . To dòng t bào E. coli mang gen duch 2. Biu hin gen duch và thu nhn, tinh sch protein dUCH 3. S d ng min dch to kháng th kháng dUCH 4. Kim tra kháng