Kháng thể đa dòng, phương pháp sản xuất và ứng dụng

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm MIỄN DỊCH HỌC Đề tài: Kháng thể đa dòng, phương pháp sản xuất ứng dụng Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trương Quốc Phong Nội dung thảo luận 01 Khái niệm kháng thể đa dòng 02 Sản xuất kháng thể đa dòng 03 Ứng dụng kháng thể đa dòng Khái niệm kháng thể đa dòng Khái niệm kháng thể đa dòng Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies: pAbs): kháng thể sản sinh từ tế bào B khác thể Chúng tập hợp immunoglobulin:Ig phản ứng chống lại kháng nguyên cụ thể Mỗi loại liên kết với epitope kháng nguyên Khái niệm kháng thể đa dòng Trong đáp ứng miễn dịch, thể sản sinh nhiều loại kháng thể, loại lại tương thích với B cell nhiều epitope kháng nguyên Sự đáp ứng miễn dịch gọi đáp ứng miễn dịch đa dòng B ce ll Với vật chủ, loại kháng nguyên hai lần đáp ứng miễn dịch khác kháng thể sản sinh khơng hồn tồn giống hai lần B ce ll B ce ll B cell Kháng thể đa dịng gây tượng phản ứng chéo (cross-reactivity) hay crossimmunity, crossprotective immunity Theo miễn dịch học phản ứng giữ kháng thể kháng nguyên khác B cell Khái niệm kháng thể đa dòng Sản xuất kháng thể đa dòng Sản xuất kháng thể đa dịng QUY TRÌNH SẢN XUẤT Chuẩn bị kháng nguyên Lựa chọn chuẩn bị tá dược Lựa chọn vật Quá trình tiêm đáp ứng miễn dịch vật Chiết xuất huyết 1 Chuẩn bị kháng nguyên Để sản xuất kháng thể đa dịng địi hỏi việc phải chuẩn bị kháng nguyên Chuẩn bị kháng nguyên gồm: + Nghiền phá hủy mô + Tách chiết phân tử kết tủa muối - Ngồi phương pháp cịn phụ thuộc vào kháng ngun có hịa tan hay khơng hịa tan, chất kháng nguyên protein, carbonhydrate hay acid nucleic Đối với kháng nguyên có chất protein acid nucleic ta cịn tách chiết theo khối lượng cách chạy điện di Mục đích: để sản xuất kháng thể đa dịng có độ chuẩn cao, huyết miễn dịch (antiserum) có lực cao với kháng ngun để sử dụng thí nghiệm xét nghiệm 2 Lựa chọn chuẩn bị tá dược + Để có đáp ứng miễn dịch mong muốn kháng nguyên phải đủ mạnh Vì vậy, số loại kháng nguyên “yếu” ta cần dùng chất bổ trợ hay tá dược Một số tá dược lại sử dụng với mục đích nhân đạo với lồi vật dùng để sản xuất kháng thể + Tới có 100 loại tá dược công bố đánh giá, thẩm định Tuy nhiên, có vài loại tá dược sử dụng phổ biến + Các tá dược phổ biến thường dùng là: • • • • • FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant Aluminum salts (Al(OH)3, AlPO4, ) TiterMax TM RIBI TM Lựa chọn vật Tiêu chí để chọn vật làm mẫu để lấy kháng thể đa dòng Lượng pAb cần Dễ dàng lấy mẫu Mối quan hệ kháng nguyên lồi gần gũi Mục đích sử dụng Q trình tiêm đáp ứng miễn dịch Chiết xuất huyết - Tinh chế kháng thể Pp1 sử dụng sắc kí trao đổi ion Pp2.tinh chế nhờ cột lực protein G(hoặc protein A) Nguyên tắc: sử dụng khả liên kết đặc hiệu protein G (có chất immunoglobulin) Với Fc kháng thể IgG Các kháng thể IgG cần tách qua cột liên kết với protein G theo kiểu kháng thể- protein G Sử dụng đệm để rửa protein không đặc hiệu qua cột Sau rửa, kháng thể đc tách đệm tách khỏi cột   Pp3 Kết tủa (NH4)2SO4 - Kiểm tra độ tinh Pp chạy điện di gel Ứng dụng kháng thể đa dòng Các ứng dụng Kháng thể đa dịng có nhiều ứng dụng kể tới hai ứng dụng lớn kháng thể đa dòng phương pháp ngưng kết sinh học (Agglutination method) phương pháp kết tủa miễn dịch (Immunoprecipitation based method) Agglutination reaction Precipitation reaction Ngưng kết sinh học kháng thể cho tiếp xúc Kết tủa miễn dịch kháng thể cho tiếp xúc với với kháng nguyên Kháng nguyên thường kháng kháng nguyên hòa tan tạo phức hợp kháng nguyên - ngun đính chủ tế bào kháng thể Thơng thường khơng giống ngưng kết, kết tủa hồng cầu, tế bào vi khuẩn, virus, Từ gây tượng miễn dịch cần thêm chất giúp cho phức hơp kháng đông tụ lại nguyên – kháng thể lắng xuống Các ứng dụng Agglutination reaction Active Agglutination - Các epitopes kháng ngun đích tìm thấy Passive Agglutination - hạt mang - Các hạt mang RBCs, tế bào nấm, tế bào vi khuẩn, Và kháng nguyên gắn sẵn chúng Các epitopes kháng ngun đích khơng hình thành tự nhiên hạt mang - Epitope kháng nguyên hòa tan gắn lên hạt mang phương pháp hóa học Các ứng dụng Các ứng dụng Precipitation reaction Individual protein immunoprecipitation (IP): Dùng để phát protein đặc hiệu mơi trường có chứa nhiều protein khác Protein complex immunoprecipitation (Co-IP): Dùng để phát phức hệ protein từ kết hợp protein biết phức hệ với kháng thể tương ứng Chromatin immunoprecipitation (ChIP): Xác định vị trí loại protein cụ thể gắn lên DNA gene Thường yếu tố phiên mã histone Ứng dụng kĩ thuật SANDWICH ELISA Kỹ thuật Elisa : Phát diện kháng thể kháng nguyên mẫu Nguyên lí: 1.Phủ kháng nguyên 2.Bắt giữ đặc hiệu KN-KT(được liên kết với enzyme) 3.Rửa trôi phân tử không bắt giữ 4.Thêm chất phản ứng với enzyme, phát tín hiệu, đọc tín hiệu Kĩ thuật Elisa sandwich Định lượng kháng nguyên hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture phát hiệndetection) Một kháng thể đa dòng thường sử dụng kháng thể bắt giữ nhiều kháng nguyên tốt Ứng dụng kĩ thuật SANDWICH ELISA Phát chẩn đoán bênh vi khuẩn    • • • • Ứng dụng phát helicobacter pylori mẫu huyết nước bọt gây bệnh viêm dày Tạo kháng thể đa dòng kháng kháng nguyên đặc hiệu vỏ bào tử B anthracis(gây bệnh than) Ứng dụng phát virus viêm gan C:(dùng công cụ Elisa) Lấy mẫu máu bệnh nhân nghi mắc viêm gan C Sử dụng kháng thể liên kết với kháng nguyên virus viêm gan C Bị nhiễm virus viêm gan C, kháng thể liên kết với kháng ngun- xét nghiệm dương tính Khơng bị nhiễm vi rút C gan, kháng thể nói chung khơng liên kết với điều gì- âm tính Ứng dụng kĩ thuật SANDWICH ELISA kết dương tính giả,    Một xét nghiệm xác nhận diện kháng nguyên thực tế khơng có Xảy phản ứng chéo, xảy epitope từ mầm bệnh khác tương tự tìm thấy mầm bệnh thử nghiệm xét nghiệm dựa kháng thể đa dòng thường sử dụng làm xét nghiệm sàng lọc, cần phải có thí nghiệm khác để chứng minh kết âm tính giả, xảy xét nghiệm không phát kháng thể thực tế  Nguyên nhân: Do lượng kháng nguyên mức phát Ưu nhược điểm kháng nguyên đa dòng Những ưu điểm nhược điểm kháng thể đa dòng chủ yếu xác định tính đặc hiệu đa epitope chúng Ưu điểm: - Thời gian sản xuất ngắn với chi phí thấp Độ ổn định cao chịu thay đổi pH đệm Ái lực cao nhiều kháng thể liên kết với kháng nguyên Chúng khuếch đại tín hiệu kháng nguyên với mức độ biểu thấp - Chịu thay đổi nhỏ epitope kháng ngun Kháng thể đa dịng nhạy cảm với thay đổi kháng nguyên (biến tính nhẹ, thể đa hình, ) so với kháng thể đơn dịng Nhược điểm: - Với diện nhiều kháng thể nên dễ xảy phản ứng chéo Các kháng thể đa dịng lơ khác khơng hoàn toàn giống Cảm ơn thầy toàn thể bạn lắng nghe! ... niệm kháng thể đa dòng 02 Sản xuất kháng thể đa dòng 03 Ứng dụng kháng thể đa dòng Khái niệm kháng thể đa dòng Khái niệm kháng thể đa dòng Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies: pAbs): kháng thể. .. miễn dịch học phản ứng giữ kháng thể kháng nguyên khác B cell Khái niệm kháng thể đa dòng Sản xuất kháng thể đa dòng Sản xuất kháng thể đa dịng QUY TRÌNH SẢN XUẤT Chuẩn bị kháng nguyên Lựa chọn... rửa, kháng thể đc tách đệm tách khỏi cột   Pp3 Kết tủa (NH4)2SO4 - Kiểm tra độ tinh Pp chạy điện di gel Ứng dụng kháng thể đa dòng Các ứng dụng Kháng thể đa dịng có nhiều ứng dụng kể tới hai ứng