Kháng thể đơn dòng, phương thức sản xuất và ứng dụng

Kháng thể đơn dòng GVHD: PGS.TS Trương Quốc Phong Kháng thể ??? • Là phân tử tế bào lympho B tương bào tiết ra, để nhận biết vơ hiệu hóa tác nhân lạ • Chức năng: - Liên kết với kháng nguyên - Hoạt hóa bổ thể - Hoạt hóa tế bào miễn dịch Kháng thể đơn dịng • Là kháng thể đáp ứng với loại kháng nguyên chuyên biệt • Chỉ nhận biết epitope kháng ngun cho sẵn • Các kháng thể đơn dịng dịng giống hệt sản xuất dòng tương bào Kháng thể đơn dòng Kháng thể đa dòng Tách từ huyết (serum) Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng Sản xuất kháng thể từ tế bào lympho B điều kiện in vitro Kỹ thuật dung hợp tế bào ( kháng thể đơn dòng, hybridoma method) Kỹ thuật bộc lộc thực thể khuẩn (phage display) Sản xuất kháng thể đơn dòng động vật chuyển gene Sản xuất kháng thể đơn dòng kỹ thuật dung hợp tế bào Các bước tạo kháng thể đơn dòng Dung hợp, tạo tế bào lai hybridoma Gây đáp ứng miễn dịch Chọn động vật gây nhiễm, chọn kháng nguyên Sàng lọc, dòng hoá tăng sinh hybridoma Thu nhận, tinh chế kiểm tra mAb Bước 1.Chọn động vật gây nhiễm chọn kháng nguyên • Chọn động vật gây nhiễm: - Động vật thường sử dụng chuột nhắt, chuột cái, thỏ • Chọn kháng nguyên: Kháng nguyên nhận diện mAb mục tiêu Có tính gây đáp ứng miễn dịch mạnh BALB/c C57BL/6 Có cấu trúc giống với kháng nguyên tự nhiên tốt Hiện Ag thường tạo kỹ thuật protein tái tổ hợp Có thể vi khuẩn gây bệnh, virus gây bệnh, hapten phối hợp với protein, vaccine thương phẩm hay phân tử protein Bước Gây đáp ứng miễn dịch Các vị trí tiêm kháng nguyên • i.p ( Intraperitoneal ) : tiêm khoang bụng • i.d ( Intradermo) : tiêm vào da • i.m ( Intramuscular) : tiêm • i.v ( Intravenous ) : tiêm tĩnh mạch • s.c ( Subcutaneous): tiêm da Thể tích tiêm vị trí Bước 3.Dung hợp, tạo tế bào lai hybridoma • Tạo tế bào lai tế bào u tuỷ lympho bào B hoạt hố • Các phương pháp tạo tế bào lai nay:  Kết dính tự nhiên  Các yếu tố vật lý  Virus (Sendai)  Vi tiêm Bước Sàng lọc, dịng hố tăng sinh hybridoma • Tạo dịng lai pha lỗng dần để tách ni riêng tế bào lai • Mỗi tế bào lai nuôi riêng, chúng phân chia phát triển thành clon tế bào tiết kháng thể chống lại định kháng nguyên định Thu kháng thể đơn dòng Bước Thu nhận • Một số kỹ thuật thu nhận thường sử dụng: o Ngưng tụ ammonium sulfat nồng độ 50% o Sắc ký trao đổi ion o Sắc ký trao đổi gel o Sắc ký lực Ưu điểm • Kháng thể thu tinh khiết, có tính đặc hiệu cao yếu tố định kháng nguyên • Khả nhanh, nhạy cảm chẩn đốn bệnh • Cho phép phát nhiều kháng nguyên chưa biết bề mặt tế bào • Giảm tượng dương tính giả phản ứng miễn dịch ELISA Nhược điểm • Giá thành đắt • Hệ thống miễn dịch người nhận diện kháng thể đơn dòng (được sản xuất từ tế bào B chuột) protein lạ nên tạo kháng thể chống lại Cách khắc phục hạn chế • • Đưa tế bào lympho B người vào thể chuột, tế bào B tạo Kháng thể đơn dòng mà hệ thống miễn dịch người chấp nhận Các nghiên cứu cịn dùng cơng nghệ gen thay chuột vi khuẩn để tạo Kháng thể đơn dòng nhỏ hơn, gắn chặt chất mang thâm nhập khối u dễ dàng Ứng dụng Xét nghiệm chẩn đoán: Bệnh tim mạch, thử thai, chẩn đoán bệnh AIDS Chất làm bề mặt mẫu vật hóa phân tích: Sử dụng phân tích hố học Chống đào thải tạng ghép: Ngăn ngừa tượng thải ghép Chữa bệnh ung thư máu bằng kháng thể đơn dòng Alemtuzumab • Alemtuzumab kháng thể đơn dịng tái tổ hợp dạng IgG1 “người hóa” • Là kháng thể người với phần CDR(vùng xác định bổ trợ)có nguồn gốc từ chuột định khả kháng thể liên kết với kháng nguyên • Có 95% từ người 5% từ chuột nên giảm bớt đáp ứng miễn dịch người • Kháng thể đưa vào thể tìm liên kết đặc hiệu với CD52 • Alemtuzumab liên kết với CD52,gây phản ứng đáp ứng miễn dịch thể người bệnh tiêu diệt tế bào ung thư có bềề̀ mặt Tác dụng phụ của Alemtuzumab • Sơt, mơ hôi,mất cảm giác ngon miệng them ăn,tiêu chảy,đau đầu,thở gấp • Có thể làm giảm sơ lượng tế bào máu, làm tăng nguy măc bệnh truyền nhiêm.gây mệt moi tnh trạng chảy máu hay máu khó đơng • Có thể gây viêm phởi,các đau tim,các vấn đề gan thận vấn đề tiêu hóa Danh mục tài liệu tham khảo • National Research Council (US) Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies.  Recommendation 1: Executive Summary: Monoclonal Antibody Production Washington (DC): National Academies Press (US); 1999  • “Cơng nghệ sinh học người động vật”, (2010), Phan Kim Ngọc, NXB Giáo dục • Giáo trình “Miễn dịch học”,(2011), Lương Thị Hồng Vân, NXB Hà Nội ... dòng Kháng thể đa dòng Tách từ huyết (serum) Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng Sản xuất kháng thể từ tế bào lympho B điều kiện in vitro Kỹ thuật dung hợp tế bào ( kháng thể đơn dòng,. .. Kháng thể đơn dịng • Là kháng thể đáp ứng với loại kháng nguyên chuyên biệt • Chỉ nhận biết epitope kháng nguyên cho sẵn • Các kháng thể đơn dịng dịng giống hệt sản xuất dòng tương bào Kháng thể đơn. .. thuật bộc lộc thực thể khuẩn (phage display) Sản xuất kháng thể đơn dòng động vật chuyển gene Sản xuất kháng thể đơn dòng kỹ thuật dung hợp tế bào Các bước tạo kháng thể đơn dòng Dung hợp, tạo