Enzyme amylase phương pháp sản xuất và ứng dụng

Enzyme amylase phương pháp sản xuất và ứng dụng

TÓM TẮT

Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu Để thực hiện quá trình thuỷ phân tinh bột trong thực tế sản xuất người

ta thường sử dụng enzyme amylase Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV Ngoài ra, sử dụng amylase để thủy phân tinh bột cần năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta Nhờ những ưu điểm trên mà enzyme amylase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp: chế biến thực phẩm, dệt, y dược …

Do đó, việc nắm rõ phương pháp sản xuất enzyme amylase để ứng dụng vào thực tế sản xuất là nhu cầu cần thiết

I GIỚI THIỆU:

1 Enzyme Amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: endoamylase (enzyme nội bào) và

exoamylase (enzyme ngoại bào) (1)

• Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase, khử gián tiếp là Transglucosylase và maylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

• Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

2 Môi Trường Sản Xuất Enzyme Amylase

2.1 Môi trường lỏng

Ở môi trường lỏng, VSV sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, tạo thành khuẩn lạc ngăn cách pha lỏng (môi trường) và pha khí (không khí) Ở đây, VSV sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, O2 từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme Enzyme ngoại bào sẽ được tách ra từ sinh khối và hòa tan vào dung dịch môi trường Enzyme nội bào sẽ nằm trong sinh khối VSV

Hình 1: Lên men trong môi trường lỏng ở quy mô phòng thí nghiệm (5 L)

(www.khoahoc.com.vn)

2.2 Môi trường bán rắn

Phần lớn các nhà máy sản xuất enzyme, khi nuôi cấy VSV thu nhận enzyme, người

ta thường sử dụng môi trường đặc Để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường, người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn ( môi trường ) và pha khí ( không khí ) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường Môi trường nuôi cấy vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp Nếu độ ẩm quá cao sẽ làm bết môi trường lại, không khí không thể xâm nhập vào trong lòng môi trường, nếu có

độ ẩm thấp quá sẽ không thuận lợi cho VSV phát triển Thông thường người ta thường tạo độ ẩm khoảng 55-65% W là hợp lý Nếu sử dụng cám làm nguyên liệu chính để nuôi cấu VSV thu nhận enzyme, người ta phải cho thêm 20-25% trấu để làm xốp môi trường, tạo điều kiện thuận lợi không khí dễ xâm nhập vào lòng môi trường Phương pháp nuôi cấy bề mặt bán rắn (môi trường đặc) này rất thích hợp

cho len men ở nấm mốc Asp.oryzae (2)

3 Nguyên Liệu Sản Xuất Enzyme Amylase

3.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy.

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác.Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn

cả Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu

Hình 2: Lên men trên môi trường rắn A: lên men kỵ khí

trong nồi bằng đất nung, B: lên men hiếu khí

Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn lỏng): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như glucose, fructose, sacarose,

pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%.(3)

3.2 Chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase.

• Chủng nấm mốc Asp Oryzae, Asp.niger…

o Enzyme chiết xuất từ nấm mốc: dễ dàng loại bỏ các khuẩn ty của nấm trong môi trường sản xuất enzyme

o Enzyme amylase thô nằm trong dung dịch lọc

• Các chủng vi khuẩn là Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus …

o Enzyme chiết xuất từ vi khuẩn: cần tốc độ cao, làm lạnh bằng máy li tâm cho việc này

o Đổ môi trường nuôi cấy vi khuẩn vào ống máy li tâm, và quay trong 20 phút ở 5.000 vòng/phút Phần gạn nổi trên mặt, là chiết xuất enzyme thô

Bảng 1: Tính chất của amylase thu nhận từ các nguồn khác nhau

(Nguyễn Tiến Thắng, Gíao trình công nghệ enzyme 2008)

Nguồn thu nhận Giới hạn pH

(pH tối ưu)

Khối luợng phân

tử (Dalton)

Nhiệt độ tối

ưu ( o C)

B.stearothermophilus 4,0 – 5,2(3,0) 96.000 80

II PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME AMYLASE

1 Theo Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Mặt :

1.1 Qui trình công nghệ :

Vi sinh vật

Etanol

Hấp thanh trùng: dưới áp suất hơi 1-1,5 atm trong thời gian 45-60 phút

Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống hoặc rắc bào tử vào môi trường đã thanh trùng, ủ thành đống vài giờ Khi cấy vào môi trường dinh dưỡng, bào tử sẽ phát triển thành tế bào nấm mốc và tạo ra các loại enzyme mà ta mong muốn

Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2-3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy ở 28-32oC, không cần điều chỉnh

pH Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

• Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy

o Nhiệt độ tăng rất chậm

o Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

o Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

o Khối môi trường còn rời rạc

o Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành

• Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ

o Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm có màu trắng xám

o Môi trường được kết lại khá chặt

o Độ ẩm môi trường giảm dần

Môi trường cám mì

Trích ly bằng nước

Thấm tích dịch trích

Kết tủa Amylase

Li tâm Sấy kết tủa Chế phẩm Amylase Nghiền, bảo quản

o Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC.

o Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi

o Enzyme amylase được tổng hợp mạnh

o Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần

• Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ

o Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại

o Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ

1.2 Thu nhận sản phẩm

Để sản xuất enzym tinh khiết người ta phả tiến hành như sau:

• Toàn bộ khối lượng enzym thô amylase được đem đi nghiền nhỏ để phá vỡ thành tế bào và làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô

• Sử dụng những chất trợ nghiền (cát thạch anh và bột thủy tinh) khi nghiền Trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô

ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzym α-amylase Cứ một phần chế phẩm enzym thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn).Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzym thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Dùng cồn và sunfat amon để kết tủa enzyme.Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzym thô và cả những tác nhân kết tủa

để tránh làm mất hoạt tính enzyme

• Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ 4-70C Theo thời gian, các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc

thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm > 70%W) (4)

1.3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm :

• Nuôi cấy bề mặt rất dễ thực hiện Quy trình công nghệ thường không phức tạp

• Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều

so với nuôi cấy chìm

• Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) Sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản

• Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp.

• Trong trường hợp bị nhiễm các vi sinh vật lạ, ta rất dễ dàng xử lý Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn

Nhược điểm : Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy Trong phương

pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng hoặc môi

trường bán rắn) nên rất cần nhiều diện tích (5)

2 Theo Phương Pháp Nuôi Cấy Bề Sâu:

2.1 Qui trình công nghệ :

Hấp khử trùng ở nhiệt độ 118 – 125 0C, thời gian 40 – 60 phút, để nguội dến nhiệt

độ bình thường và tiếp giống vi sinh vật vào môi trường, tỷ lệ giống đưa vào là 2 – 2,5 % Sau đó quá trình nuôi cấy được thực hiện theo 2 phương pháp: nuôi cấy theo chu kỳ hay nuôi cấy liên tục

• Nuôi cấy theo chu kỳ là phương pháp nuôi cấy trong 1 thiết bị lên men Sau

1 chu kỳ nuôi từ 2 – 4 ngày ở 28 – 320C người ta thu nhận toàn bộ dịch nuôi cấy như là 1 loại chế phẩm enzyme thô Phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật cao nhưng năng suất thấp

• Nuôi cấy liên tục là để khắc phục tình trạng trên Quá trình nuôi cấy liên tục

có thể nuôi cấy trong 1 thiết bị, cũng có thể thực hiện trong nhiều thiết bị

Vi Sinh Vật

Phương pháp này có lợi là nếu chất lượng sản phẩm ra cuối cùng ra ta thu nhận đuợc chưa đạt yêu cầu đặt ra ta có thể khắc phục bằng hai cách

o Cách thứ nhất: làm cho thời gian lưu của dung dịch và tế bào vi sinh vật trong thiết bị lâu hơn

o Cách thứ hai là: ta tiến hành hoàn lưu dịch lên men hòa chung với dòng môi trường để tái lên men

2.2 Thu nhận sản phẩm

Dung dịch sau khi nuôi cấy theo phương pháp bề sâu được tách khỏi sinh khối và các thành phần không hòa tan bằng phương pháp ly tâm Dịch thu thường chứa 2 – 3% chất khô hòa tan Hàm lượng chất này rất nhỏ, do đó ta cần phải cô đặc chúng cho đến khi khối lượng dịch giảm đi 5 – 10 lần ở điều kiện chân không

2.3 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm:

• Phương pháp nuôi cấy hiện đại dễ cơ khí hoá, tự động hoá, năng suất cao

• Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo vô trùng

Nhược điểm:

• Đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy

Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn và thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao (5)

3 Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Chất Lượng Enzyme

3.1 Ảnh hưởng các nguồn Nitơ dinh dưỡng

Bảng 2: Ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sinh tổng hợp các enzyme amylase ( Sách Công nghệ enzyme của Nguyễn Đức Lượng chủ biên, 2004)

Nguồn Nitơ Liều lượng muối,

% theo N Hoạt động enzyme sau 6 ngày nuôi đối với 100ml

α-amylase Glucomylase

3.2 Ảnh Hưởng Của Nguồn Khoáng Dinh Dưỡng

- Mg2+ có ảnh hưởng tới độ bền nhiệt của enzym

- Phospho ảnh hưởng trực tiếp tới sinh sản của nấm sợi, do vậy mà tăng cường tổng hợp enzyme

- Canxi(Ca) cần cho tổng hợp và ổn định α-amylase hoạt động vì nó là cấu tử không thể thiếu được của enzym này Canxi còn có tác dụng bảo vệ amylase khỏi tác động của protease ( Hsiu et amiloza, 1964)

- Lưu huỳnh(S) kích thích sự tạo amylase

Ngoài những nguyên tố đa lượng này cần chú ý thêm với những nguyên tố vi lượng Chẳng hạn như: Co, kẽm,…và các nguyên tố gây ức chế sự tổng hợp enzym amylase như: đồng, thủy ngân, …

4 Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Lên Men

- Độ ẩm môi trường:

Bảng 3: Ảnh hưởng của giữ ẩm trong quá trình sinh trưởng tới sự tạo α-amylase

của Asp.oryzae nuôi bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt ( http://gbb.eldoc.ub.rug.nl/root/2002/JBiotechnolvdMaarel/)

Phương án

thí nghiệm

Độ ẩm

%

Hoạt độ amylase đối với canh I trường khô

Độ ẩm

%

Hoạt độ amylase đ/v canh trường khô

Độ ẩm

%

Hoạt độ amylase đối với canh I trường khô

- Độ ẩm tương đối của không khí: Độ ẩm cho phép từ 80% trở lên đến mức bão hoà tức là 100% W đều thích hợp cho VSV phát triển

- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển và hình thành enzyme là 28-320C

- Ảnh hưởng của pH: pH thích hợp cho VSV phát triển là môi trường acid yếu

khoảng 5,5-6.5 (6)

III ỨNG DỤNG CỦA ENZYME AMYLASE:

1 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Chế Biến Thực Phẩm Gia Súc:

Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao Để tăng hiệu suất sử dụng năng

lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào Enzyme amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột tạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn

2 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Dược Phẩm.

Nguồn cung cấp enzyme amylase là vi khuẩn Bacillus subtilis với ưu điểm là bền

hơn trong môi trường acid của dạ dày so với diastase (amylase) lấy từ động vật và

vi nấm Amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, cytocrom C, ATP, carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh Mặt khác amylase phối hợp với enzyme thủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme đường tiêu hóa Trong

cơ thể, amylase là hormon tuyến tụy ngoại tiết, có tác dụng chống phù nề sau chấn thương hoặc sau mổ Điều trị triệu chứng phản ứng viêm kèm nhiễm khuẩn đường

hô hấp trên hoặc dưới

α-amylase dùng trong Neopeptine viên nang được lấy từ nguồn vi khuẩn Bacillus subtilis

Sản phẩm chữa men tiêu hóa dành cho trẻ sơ sinh và trẻ em, kích thích tiêu hóa, chống suy dinh dưỡng và các sản phẩm cùng loại :

3 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Công Nghiệp Dệt

Trong công nghiệp dệt, người ta thường sử dụng enzym amylase của vi khuẩn để tẩy tinh bột và làm cho vải mềm.Người ta thường sử dụng lượng chế phẩm amylase khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 90oC

4 Ứng Dụng Của Enzyme Amylase Trong Việc Tẩy Màu Giấy.

Enzyme α-amylase có khả năng thúc đẩy quy trình khử mực tốt.Chúng bẻ gãy các mạch tinh bột trên mặt giấy, kéo theo sự làm long các phân tử mang màu bám trên

đó, tạo thuận lợi cho quá trình tuyển nổi khử mực (7)

Nguyên liệu: giấy photocopy, giấy văn phòng loại, giấy in bằng mực laser một mặt

có gia keo tinh bột

Quy trình xử lý: bao gồm các bước ngâm và xử lý giấy loại bằng enzyme α-amylase tại nhiệt độ thường, xử lý cơ hóa nhiệt: đánh tơi có pha trộn hóa chất và gia nhiệt, ủ tại điều kiện nhiệt độ, pha loãng và tuyển nổi, rửa và cô đặc, thành phẩm

Hóa chất sử dụng: enzyme α-amylase, NaOH công nghiệp, Na2SiO3, H2O2,

chất hoạt tính bề măt, chất tạo bọt, dầu béo

Hiệu quả so với mẫu đối chứng không sử dụng enzyme α-amylase: thời gian ủ giảm 30%, mức dùng các loại hóa chất giảm 10 - 35% tùy theo từng loại, giảm nhiều nhất

là mức dùng NaOH (giảm 35%), độ trắng của bột sau khử mực tăng 2,7 - 3,0% ISO,