Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi TS. Đỗ Thị Tuyên 8727 Hà Nội - 2010 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Chủ nhiệm đề tài TS. Đỗ Thị Tuyên PGS. TS. Quyền Đình Thi Cơ quan chủ trì đề tài Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà N ộ i - 2010 MỤC LỤC 1 TỔNG QUAN 1 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2 1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme 3 1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới 5 1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới 6 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật 8 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới 10 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme 11 1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới 12 1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua 12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp 15 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất 15 1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn 16 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 2.1 Chủng vi sinh vật 16 2.2 Nguyên liệu 17 2.3 Môi trường nuôi cấy 17 2.4 Vector biểu hiện 17 2.5 Hóa chất 18 2.6 Các bộ mồi 18 2.7 Xác định hoạt tính 19 2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase 19 2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase 20 2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin 21 2.7.4 Xác định ho ạt tính xylanase 21 2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme 21 2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase 21 2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase 22 2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin 22 2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme 23 2.9 Các phương pháp sinh học phân tử 23 2.9.1 Phản ứng PCR 23 2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học 23 2.9.3 Biến nạp xung điện 23 2.9.4 Tách chiết RNA 23 2.9.5 Đọc trình tự DNA 24 2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợ p trong E. coli BL21 24 2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus 24 2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris 24 2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp 24 2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris 24 2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi 25 2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn 26 2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 26 2.10 Phương pháp tách chiết protein 26 2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp 26 2.10.2 Điện di SDS-PAGE 26 2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp 27 2.11.1 Lên men sản xuất glucanase 27 2.11.2 Lên men sản xuất mannanase 27 2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin 27 2.11.4 Lên men sản xuất xylanase 27 2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô 27 2.12 Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm 28 2.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính và bán trường diễn 28 2.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme 29 2.12.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M 30 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nội dung 1. Đánh giá các chủng tự nhiên sinh tổng hợp các enzyme 35 3.1.1 Glucanase t ự nhiên 35 3.1.2 Manananase tự nhiên 40 3.1.3 Protease tự nhiên 48 3.1.4 Xylanase tự nhiên 50 3.2 Nội dung 2. Tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp 62 3.2.1 Glucanase tái tổ hợp 62 3.2.2 Mannanase tái tổ hợp 69 3.2.3 Subtilisin tái tổ hợp 74 3.2.4 Xylanase tái tổ hợp 80 3.3 Nội dung 3. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm enzyme 94 3.3.1 Tạo nguyên liệu đầu vào 95 3.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisin tái tổ hợp 96 3.3.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái tổ hợp 99 3.3.4 Quy trình công nghệ sản xuất mannanase tái tổ hợp 102 3.3.5 Quy trình công nghệ sả n xuất xylanase tái tổ hợp 105 3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm đa enzyme (Vietzyme M) 109 3.4 Nội dung 4. Đánh giá chế phẩm đơn và đa enzyme 111 3.4.1 Đánh giá độ an toàn, độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm 111 3.4.2 Hiệu quả của chế phẩm enzyme đơn trên gà Lương Phượng 113 3.4.3 Hiệu quả của chế phẩm đơn enzyme xylanase trên lợn con sau cai sữa 114 3.4.4 Hiệu quả của chế phẩm Vietzyme M trên gà Lương Phượng 115 3.4.5 Thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm đa enzyme lên sự sinh trưởng của lợn ở các lứa tuổi 8-50kg 117 KẾT LUẬN 120 LỜI CÁM ƠN 121 KIẾN NGHỊ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 121 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP 1 TỔNG QUAN Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng nền chăn nuôi an toàn sinh học, bền vững được đề ra trong bối cảnh ngành còn đối mặt với nhiều khó khăn. Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập trong khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu cho chế biến thức ăn là “rào cản” khiến mục tiêu trên khó thành hiện thực. Những n ăm qua, ngành chăn nuôi luôn giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng 8,5%/năm. Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005. Tuy nhiên, năm 2007 chỉ đạt 4,6%, tỷ trọng của ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006). Việt Nam là nước nông nghiệp nên các nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu của ngành công nghiệp chế biến nông sản rất lớn, nếu sử dụng được nguồn nguyên liệu này để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và lợi thế hơn nhiều so với các nguyên liệu khác. Một trong những hạn chế lớn nhất của sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp để sản xuất thức ăn chăn nuôi là những nguyên liệu này có tỷ lệ xơ cao, chính vì nhiều xơ nên chúng có tỷ l ệ tiêu hóa và giá trị năng lượng thấp. Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết. Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất. Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột. Ở Việt Nam nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt là enzyme từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm. Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme t ự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài này là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; và cuối cùng là xây dự ng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc. Enzyme thức ăn thường được gọi là enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế: 1. Kết hợp với enzyme nội sinh, phân giải các hợ p chất thành những chất có kích thước đủ nhỏ để động vật dễ hấp thu. Như vậy, việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là rất cần thiết; 2. Enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa cản trở sự hấp thu thứ c ăn. Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột. Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non- starch polysaccharide, NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật non, đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa. Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng nh ững chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng -glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, để phân giải được protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả cellulase và pentosanase. Ngoài ra, phải đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác giữa enzyme với các nguyên liệu khác nhau trong khẩu phầ n. 2 Trong dinh dưỡng động vật dạ dày đơn, việc bổ sung các chế phẩm enzyme trong khẩu phần được ứng dụng khá rộng rãi. Tác dụng chính của chúng là cải thiện khả năng tiêu hóa, ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường. Từ đó sẽ góp phần cải thiện năng xuất vậ t nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993; Thacker and Baas, 1996). Trong các khẩu phần cho động vật dạ dày đơn, ngũ cốc thường chiếm tỷ lệ khá lớn, từ 50-65% mà trong thành phần của chúng chứa các nhóm non-starch polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) là những hợp chất cơ thể động vật không tiêu hóa được. Ngoài ra chúng còn làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu các chất dinh dưỡng khác do làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa (Campbell and Bedford, 1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995). Nhiều nghiên cứu đã ch ứng minh là bổ sung hỗn hợp các enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào trong khẩu phần ngũ cốc có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa năng lượng, protein và acid amin trong khẩu phần so với không bổ sung (Gdala et al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003). 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã tiến đượ c bước dài. Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã được nhiều công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất từ hai chục năm nay, đã được ứng dụng thường quy ở những nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Tây/Đông Âu, Nhật Bản và Trung Quốc. Tuy nhiên những nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn được tiếp tục theo một số h ướng chính sau đây như Marquardt (Dept. of Animal Science, University of Manitoba, Winnpeg, Manitoba R3T 2N2, Canada) và Brufau (IRTA, Department of Animal Nutrition, Centre de Mas Bove, Apartat 41 5 Reus, Spain) nhận định trong bài tổng quan “Future of feed enzymes: Orientation and perspectives” đăng trên “CIHEAM - Options Mediterraneennes”. Sử dụng enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đã có một tác động mạnh mẽ tới việc sử dụng các nguyên liệu thức ăn trong ngành chăn nuôi động vật, đặc biệt trong gia cầm và đặc biệt với thức ăn ngũ cốc như lúa mạch và lúa mỳ. Nghiên cứu và phát triển trong tương lai sẽ tiếp tục được ngành công nghiệp ủng hộ ở mức độ ngày càng tăng trong mộ t lĩnh vực mở rộng. Theo Marquardt và Brufau, một số lĩnh vực tương lai cần tiếp tục nghiên cứu sẽ là: 1. Cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme hiện có trên thị trường theo hướng quan tâm tới giá thành, độ bền nhiệt, chống chịu thủy phân và nâng cao hoạt tính trong các bộ phận đích của bộ máy tiêu hóa ruột – dạ dày. 2. Mở rộng sử dụng enzyme trong thức ă n cho gia cầm, thú nuôi bản địa bao gồm các loại gia cầm khác gà, lợn, cá và thú ngoại như cá sấu, rùa, baba, ếch. 3. Mở rộng ra các loại enzyme khác như lipase, protease, amylase, cũng như được sử dụng bằng công nghiệp công nghệ sinh học. 4. Chọn lọc và thiết kế các nguồn lựa chọn khác về enzyme cải biến di truyền cho cơ chất và động vật đặc thù. Bao gồm các enzyme được sản xuất trong vi sinh vật, hạ t thực vật và ngay bản thân trong động vật bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. 5. Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn có thể được xử lý bằng enzyme. 6. Phát triển và chuẩn hóa các qui trình để đánh giá các chế phẩm enzyme khác nhau. 7. Tiếp tục nghiên cứu cách thức sao cho enzyme tạo ra được những tác dụng có lợi. 8. Phát triển các mô hình để tiên đoán đáp ứng đối với các enzyme trong mọi lớp độ ng vật chăn nuôi và với mọi nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho các nghiên cứu về giá thành – lợi nhuận. 3 9. Nghiên cứu tác động của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi trường, phân chia dinh dưỡng và thay đổi đáp ứng nội tiết tố và tình trạng sức khỏe của động vật. Rõ ràng nghiên cứu và sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sẽ không ngừng phát đạt, tăng tốc và thu được nhiều lợi nhuận. Lĩnh vực hấp dẫn của nghiên cứu sẽ tập trung vào nghiên cứu và phát triển dinh dưỡng động vật trong tương lai. Các hướng nghiên cứu (1-3) là những hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác dụng của các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại hoặc các enzyme đang nghiên cứu trong phòng thí nghiệm lên năng suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng, gà tây hoặc lên năng suất thu trứng và vắt sữa và mở rộng sang tất cả các động v ật chăn nuôi còn lại như cừu, dê, ngựa, cá, rùa và tất cả các loại động vật chăn nuôi khác. Các nghiên cứu này nhằm đánh giá từng enzyme đơn lẻ một hoặc đánh giá hiệu quả chăn nuôi khi bổ sung cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau. Các nguồn lựa chọn khác về enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm những các nguồn vi sinh vật mới tổng hợp ra các enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh sạch và đánh giá tính chất hóa lý. Hai hướng nghiên c ứu tuy có vẻ cổ điển, nhưng họ sử dụng nhiều phương pháp hiện đại hơn để đánh giá chính xác hơn như sử dụng phương pháp phân tử 16S, 18S, 26S hoặc 28S rRNA để phân loại vi sinh vật, sử dụng các loại kít có cột sắc ký hoặc kích thước lỗ để tinh sạch enzyme sử dụng vào việc đánh giá tính chất hóa lý. (4.2): Tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp từ các enzyme đã biết nhằm mục đích nâng cao năng suất hoặc tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cải biến từ những enzyme đã có nhằm nâng cao hoạt tính thủy phân đặc hiệu. (4.3): Nhắm tới một tương lai xa hơn là chuyển gene mã hóa các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi này vào những cây trồng để tạo ra nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này đã có sẵn các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi, mà không cần phải bổ sung nữa. Đây là một hướng rất mới trong vòng dăm năm lại đây. Các hướng nghiên cứu liên quan tới enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi khác như (5) Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn; (6) Chuẩn hóa các qui trình đánh giá enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (7) Tìm các ưu điểm khác của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi; (8) Phát triển mô hình để đáp ứng đối vớ i enzyme bổ sung cũng như (9) Các nghiên cứu về giảm ô nhiễm môi trường sẽ không được đề cập trong phần tổng quan này do chúng ít liên quan hơn tới nội dung thực hiện đề tài. Ngoài ra cũng liên quan tới đề tài là tổng quan tình hình sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi của các công ty trên thế giới. Thông thường khi các nghiên cứu ở các hướng trên đã hoàn thiện, các nhà nghiên cứu đăng k ý patent và các công ty sản xuất enzyme thức ăn chăn nuôi h ọ săn lùng, mua bản quyền, sản xuất, tiếp thị và thương mại hóa sản phẩm. Để có thể cạnh tranh tốt hơn, chính bản thân các công ty còn sẵn sàng đầu tư trực tiếp vào các nghiên cứu định hướng ứng dụng trong các trường đại học, các viện nghiên cứu để đón đầu các patent, hoặc họ cũng lập ra các viện nghiên cứu riêng độc lập. Có hàng nghìn công bố trên thế giới về các hướng nghiên c ứu này. Tuy nhiên để phân tích, đánh giá tình hình nghiên cứu trên thế giới, chúng tôi chỉ đưa ra những công trình tiêu biểu và cập nhật nhất để thấy rằng các hướng nghiên cứu này vẫn tiếp tục tồn tại song song với nhau. 1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme Trong một nghiên cứu của Barrera et al. (2003) về khả năng tiêu hóa amino acid và chăn nuôi lợn bằng thức ăn bổ sung xylanase đã rút ra kết luậ n sự bổ sung xylanase vào thức ăn chăn nuôi trong đó lúa mỳ là nguồn cung cấp protein và năng lượng duy nhất đã cải thiện được các chỉ số AID (khả năng tiêu hóa rõ ràng ở ruột hồi, apparent ileal destibility) của 4 amino acid, ADG, và tỷ lệ thức ăn : tăng trọng; tuy nhiên, sự cải thiện này ít hơn khi bổ sung amino acid tổng hợp (Barrera et al., 2003). Omogbenigun et al. (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu quả sử dụng dinh dưỡng và tốc độ sinh trưởng của lợn cai sữa. Đây là công thức thân thiện môi trường và hiệu quả kinh tế cao đối với thức ăn cho lợn con (Omogbenigun et al., 2004). Cowieson và Adeola (2005) đã đánh giá các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi carbohydrase, protease, và phytase. Họ thấy rằng các enzyme này có một tác dụng hỗn hợp trong thức ăn chăn nuôi gà giò khi đồng thời cho bổ sung cùng các enzyme với nhau. Họ kết luận sử dụng phytase và XAP (xylanase, amylase, phytase) đồng thời trong thức ăn cho gà giò sẽ có hiệu quả kinh tế và có thể thu lợi nhuận khi chăn nuôi gia cầm (Cowieson and Adeola, 2005). Sieo et al. (2005) đã đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chủng Lactobacillus tái tổ hợp sinh tổng hợp -glucanase lên các tính chất của hệ tiêu hóa và sự di chuyển thức ăn ở gà giò. Sự bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn chăn nuôi đã cải thiện được các tính chất của hệ tiêu hóa đồng thời nâng cao tốc độ di chuyển thức ăn trong ruột của gà giò (Sieo et al., 2005). Slominski et al. (2006) đã s ử dụng công nghệ enzyme để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ các hạt có dầu cho gia cầm. Họ đã đánh giá các công thức bổ sung enzyme riêng lẻ khác nhau và tổ hợp từ các enzyme cellulose, xylanase, glucanase, pectinase, mannanase. Bổ sung carbohydrase đa hoạt tính có thể được sử dụng làm công thức để cải thiện tình trạng sử dụng năng lượng từ hạt lanh nhiều dầu, do đó nâng cao được giá trị dinh dưỡng cho gia c ầm (Slominski et al., 2006). Trong một nghiên cứu tương tự trước đó (Meng et al. 2006) nhưng đối với hạt cải dầu, họ kết luận mặc dù tác dụng enzyme lên tiêu hóa mỡ ở hệ tiêu hóa ruột mề ở mức độ rất đáng kể, các chỉ số khác cũng cho thấy cải thiện đáng kể chỉ khi tỷ lệ thể vùi enzyme cao được sử dụng. Số liệu này củng cố s ự cần thiết bổ sung enzyme carbohydrase cho thức ăn gia cầm có hạt cải có nhiều dầu. Olukosi et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng liên quan tới thời gian chăn nuôi của dịch chiết xylanase, amylase, và protease hoặc phytase đơn lẻ hoặc kết hợp với nhau trong chăn nuôi gà giò. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự kết hợp XAP (xylanase, amylase, và protease) và phytase đã cải thiện tình hình chăn nuôi. Cả XAP lẫn phytase đều có hiệu quả trong việc cải thiệ n tiêu hóa phosphorus và duy trì gà giò hấp thụ dinh dưỡng bột ngô – đậu nành. Số liệu này cũng cho thấy gà giò hấp thụ tốt hơn từ bổ sung enzyme ở độ tuổi non hơn và sự đóng góp của enzyme vào việc lưu giữ dinh dưỡng giảm theo độ tuổi của gà giò (Olukosi et al., 2007). Nsereko et al. (2002) đã nghiên cứu chế phẩm enzyme thủy phân xơ (xylanase và glucanase) trong khẩu phần ăn của bò sữa cho thấy bổ sung enzyme thủy phân xơ tă ng số lượng vi khuẩn dạ cỏ sử dụng các hemicellulose và sản phẩm thứ cấp của dịch thủy phân cellulose (Nsereko et al., 2002). Balci et al. (2007) đã nghiên cứu tác động của các enzyme phân hủy chất xơ ngoại sinh lên quá trình tích mỡ của bò đực. Các kết quả thu nhận được từ nghiên cứu này cho thấy bò đực được cho ăn thức ăn bổ sung enzyme tăng trọng hàng ngày, tăng trọng tổng thể và tỷ lệ chuyển hóa thức ăn cao hơn (Balci et al., 2007). Mục đích nghiên cứu của Wu et al., 2005 là đánh giá tác dụng của -mannanase lên gà Leghorns thương mại cho ăn thức ăn hạt đậu tương. Sự chuyển hóa thức ăn trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp bổ sung -mannanase tương tự như gà mái cho ăn thức ăn năng lượng cao, và cả hai đều thấp hơn đáng kể so với gà mái cho ăn thức ăn năng lượng thấp không có -mannanase. Bổ sung -mannanase tăng đáng kể sản xuất trứng và trọng lượng trứng trung bình của gà mái được cho ăn thức ăn năng lượng thấp. Bổ sung - 5 mannanase đã cải thiện sử dụng năng lượng của thức ăn đậu tương ngô bắp và có khả năng giảm giá thành thức ăn cho gà đẻ chứa -mannan (Wu et al., 2005). Trong một nghiên cứu, Ciftci et al. (2005) đã đánh giá tác dụng của phytase vi khuẩn bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lên khối lượng thức ăn lấy vào, số lượng trứng đẻ và hiệu quả thức ăn trong gà mái đẻ trứng. Tuy nhiên, trọng lượng gà trước và sau khi cho ăn rất giống nhau ở mọi lô thí nghiệm. Nhưng bổ sung phytase vi khuẩn đã cải thiện được tỷ lệ đẻ trứng rõ ràng (Ciftci et al., 2005). Rengasayee et al. (2005) đã tối ưu các thông số vận hành để sản xuất xylanase sử dụng chủng tự nhiên Aspergillus bằng lên men mẻ chìm sử dụng thiết bị bán tự động. Đây là thí nghiệm đầu tiên sử dụ ng chủng nấm sợi để sản xuất enzyme ở Công ty Spic Biotech Ltd. (nhà sản xuất chính các enzyme công nghiệp ở Ấn Độ), mà cho tới nay chỉ được sử dụng nuôi cấy vi khuẩn. Sau khi lên men một số mẻ 200 lít để thu được các thông số về tốc độ khuấy, sục khí, pH, độ nhớt, thể tích, hoạt tính enzyme, nhiệt độ, họ đã nâng lên quy mô lên men 1500 lít rồi 9000 lít để sản xuất enzyme (Rengasayee et al., 2005). 1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới M ặc dù trên thế giới đã có hàng trăm công ty sản xuất các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi và bán trên thị trường, nhưng các phòng thí nghiệm trên thế giới vẫn không ngừng nghiên cứu, tìm tòi các enzyme cùng loại nhưng từ những chủng chưa ai nghiên cứu tới để tìm ra các ưu thế vượt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vướng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty. Boyce và Walsh (2007) đã sản xu ất, tinh sạch và đánh giá định hướng ứng dụng - glucanase từ Rhizomucor miehei DSM 1330. Họ sử dụng môi trường cám lúa mỳ cho sinh trưởng và cảm ứng sinh tổng hợp -glucanase ngoại bào từ R. miehei. Enzyme được tinh sạch đồng nhất. Tính đặc hiệu cơ chất và độ tương đồng protein cho thấy đây là một endo-1,3(4)- -glucanase (EC 3.2.1.6). Enzyme này có tiềm năng ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi gia cầm. Nó có hoạt tính đáng k ể ở dãy pH pH 2,6-6,5 đặc trưng của bộ máy tiêu hóa loài chim. Enzyme cũng bền nhiệt hơn các loại -glucanase thương mại đang có, đặc biệt khi hâm nóng ở nồng độ enzyme cao, và giữ được hoạt tính còn lại gấp hai lần so với những enzyme thương mại khi cho tiếp xúc ở các điều kiện của bộ máy tiêu hóa loài chim mô phỏng. Trước đây, chưa có thông báo nào về sản xuất, tinh sạch và đánh giá -glucanase từ Rhizomucor, và các tính chất hóa lý định hướng ứng dụng tạo cho enzyme này thích hợp để sử dụng trong thức ăn chăn nuôi (Boyce and Walsh, 2007). Singh và Satyanarayana (2006) đã nghiên cứu sinh tổng hợp phytase bởi chủng nấm mốc ưa nhiệt Sporotrichum thermophile trong lên men trạng thái rắn và ứng dụng của nó trong việc khử phytine của bánh dầu vừng. Họ đã tìm ra chủng mốc S. thermophile TLR50 có khả năng sản xuất phytase trong mọi thành phần thức ăn chăn nuôi s ử dụng thông thường được khảo sát ở mức độ khác nhau khi ủ men pha rắn. Sản xuất enzyme tăng từ 180 U/g dư lượng mốc khô (dry moldy residue, DMR) trong bánh dầu vừng trong 120 giờ ở 45C với tỷ lệ cơ chất – độ ẩm ban đầu 1:2,5. Bổ sung glucose và tiếp theo ammonium sulfate vào bánh dầu vừng làm cho phytase tiết ra cao hơn (282 IU/g DMR). Sinh tổng hợp phytase tăng lên 76% khi tối ưu. Mốc tiết ra acid phosphatase, amylase, xylanase, và lipase cùng với phytase. Nhờ hoạt tính của phytase, phosphate vô cơ được giải phóng có hiệu quả, dẫn tới khử phytate bánh dầu vừng (Singh and Satyanarayana, 2006). Li et al. (2006) đã tinh sạch và đánh giá tính chất -mannanase từ Bacillus subtilis B36. pH và nhiệt độ tối ưu cho MANB36 là 6,4 và 50C. MANB36 tương đối bền nhiệt ở 60C và hoạt tính riêng là 928 IU/mg. Các cation kim loại (trừ Hg 2+ và Ag + ), EDTA và 2- mercaptoethanol (2-ME) không có tác dụng đối với hoạt tính enzyme. Enzyme này có tính đặc hiệu cao với locust bean gum (LBG) thay thế galactomannan (Li et al., 2006). 6 1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới Hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp có ba mục tiêu chính là nâng cao năng suất tổng hợp, hoạt tính riêng và chuyển enzyme sinh tổng hợp từ tế bào chủ gây độc sang tế bào chủ không độc hại đối với động vật chăn nuôi hoặc từ tế bào chủ khó lên men, môi trường đắt tiền sang tế bào chủ dễ lên men, tận dụng được các phế thải nông công nghiệp. Các công trình về nhân dòng và biểu hiện các enzyme cùng loại với các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi trên thế giới thì nhiều vô kể, nhưng các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng được nhiều nhóm nghiên cứu nhân dòng, biểu hiện năng suất cao và đăng ký bản quyền. Sau đây là những ví dụ thật tiêu biểu. Onderci et al. (2006) đã đánh giá hiệu quả củ a E. coli sinh tổng hợp -amylase từ Bacillus stearothermophilus sự phát triển, sử dụng thức ăn và hình thái của ruột non của gà giò cho ăn ngô. Gà được uống nước E. coli tái tổ hợp tăng trọng hằng ngày và cải thiện sự chuyển hóa thức ăn. Cuối thí nghiệm, gà được uống nước chứa E. coli ăn nhiều hơn, lớn nhanh hơn và chuyển hóa thức ăn tốt hơn gà đố i chứng không cho uống. Sự hiện diện của vi khuẩn cũng cải thiện sự tiêu hóa các hợp chất hữu cơ. Tuy nhiên, không có tác dụng đối với dầu mỡ. Bổ sung E. coli làm giảm trọng lượng tụy tương đối, nhưng không ảnh hưởng trọng lượng gan và độ dài của hệ thống ruột – mề. Độ dài lông nhung và chân lông thì tăng lên đối với bổ sung vi khuẩn. Sự có mặt của gene hemoglobin vi khu ẩn không gây sự khác biệt nào đáng kể mà quan sát thấy. Số liệu này cho thấy bổ sung E. coli có khả năng sinh tổng hợp - amylase đã cải thiện khả năng tiêu hóa thức ăn và tốc độ sinh trưởng của gà giò cho ăn ngô (Onderci et al., 2006). Sieo et al. (2005) đã đánh giá sự ảnh hưởng của các chủng tái tổ hợp Lactobacillus sinh -glucanase lên các tính chất hệ thống tiêu hóa và tốc độ đưa thức ăn ở gà giò. Bổ sung các chủng Lactobacillus biến nạp vào thức ăn gà giò làm giảm đáng kể độ keo nhớt dịch ruột 21- 46% so với gà cho ăn thức ăn không được bổ sung hoặc bổ sung các chủng Lactobacillus tự nhiên. Trọng lượng tương đối của tụy, gan, hệ thống ruột mề, ruột kết giảm 6-27%, và độ dài tương đối của hệ thống ruột mề giảm 8-15%. Kiể m tra mô học của các mô tiêu hóa ruột mề cho thấy rằng chiều cao lông nhung ruột của gà được cho ăn với các chủng Lactobacillus cao hơn đáng kể so với gà cho ăn kiểu khác. Các chủng Lactobacillus biến nạp giảm thời gian thức ăn đi 2,2 giờ. Bổ sung các chủng Lactobacillus tái tổ hợp vào thức ăn đã cải thiện các tính chất hệ thống tiêu hóa và thời gian đi của thức ăn trong gà giò (Sieo et al., 2005). Liu et al. (2006) đã biểu hiện thành công peptide trưởng thành của xylanase A chủng Aspergillus niger (AnxA) trong Pichia pastoris với năng suất cao dưới sự kiểm soát của AOX1 promoter. AnxA tái tổ hợp (reAnxA) được tiết vào môi trường nuôi cấy. Sau 96 giờ cảm ứng 0,25% methanol, hoạt tính reAnxA trong dịch nuôi cấy đạt đỉnh cao, 175 IU/mg, gấp 1,9 lần so với protein tự nhiên AnxA (92 IU/mg). Nhiệt độ và pH tối ưu của reAnxA lần lượt là 50C và 5. reAnxA bền ở dãy pH rộng 3-8. Sau khi ủ ở pH 3-8, 25C trong 1 giờ, hoạt tính còn lại của reAnxA đều trên 80%. Các giá trị K m và k cat đối với reAnxA lần lượt là 4,8 mg/ml và 123,2/s. Phân tích HPLC cho thấy rằng xylotriose là sản phẩm thủy phân chủ yếu của xylan bạch dương và từ cám không tan bởi reAnxA (Liu et al., 2006). Chantasingh et al. (2006) đã nhân dòng và đọc trình tự gene xylanase đầy đủ, mã hóa 326 amino acid thuộc họ glycosyl hydrolase nấm số 10, từ Aspergillus terreus BCC129. 25 amino acid đầu tiên của enzyme này là một peptide tín hiệu. Gene xylanase trưởng thành 906 bp được nhân dòng vào vector pPICZA biểu hiện ở P. pastoris. Băng 33 kDa xuất hiện trên SDS-PAGE gel sau một ngày cảm ứng methanol. Enzyme biểu hi ện được tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Xylanase tái tổ hợp tinh sạch cho hoạt tính tối ưu ở 60C, pH 5 và K m 4,80,07 mg/ml và V max 75714,54 mol/phút mg, sử dụng xylan bạch dương làm cơ chất. Ngoài ra, enzyme tinh sạch có độ bền pH rộng 4-10 khi ủ ở 40C trong 4 giờ (Chantasingh et al., [...]... 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme Sau hơn hai mươi năm sản xuất và ứng dụng enzyme thức ăn chăn nuôi trong chăn nuôi gia súc và gia cầm, người ta đã nghiên cứu, sản xuất và đánh giá hiệu quả của các chế phẩm đa enzyme cao hơn so với các chế phẩm đơn enzyme Omogbenigun et al (2004) đã bổ sung các chế phẩm đa enzyme vào thức ăn của lợn con và thấy rằng các chế phẩm multienzyme đã cải thiện hiệu. .. để sinh tổng hợp các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi cũng thường không được chú trọng phát triển tiếp Các hướng tạo ra các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi tái tổ hợp hoặc cải biến di truyền, hoặc tạo ra các nguyên liệu làm thức ăn có sẵn các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở Vi t Nam đang ở thời kỳ manh nha Hiện nay đã có một số nhóm nghiên cứu ở Vi t Nam đã và đang tạo ra các enzyme tái tổ hợp sử. .. (sắn) Ở Vi t Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên vi c áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng. .. lý của enzyme tái tổ hợp, chứ không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Do vậy vấn đề an toàn của các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi ở đề tài này hoàn toàn tuân thủ theo các quy định chung của quốc tế lẫn Vi t Nam 2 2.1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật dùng để khảo sát hoạt tính enzyme do phòng CNSH Enzyme (Vi n CNSH)... chủng vi sinh vật tự nhiên có khả năng tổng hợp các các enzyme như lactase, xylanase, glucanase, phytase, subtilisin, lipase và amylase), kế đến là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; bước kế đến là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức. .. pastoris, mang tính nghiên cứu nhiều hơn Hơn nữa E coli không thể sử dụng cho lợn ăn được 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất Hiện nay trên thị trường Vi t Nam đã bán các sản phẩm enzyme sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cho các đối tượng bò, lợn, gà, vịt Những sản phẩm này đều được sản xuất ở nước ngoài Nếu các cơ sở sản xuất trong nước có khả năng sản xuất được các chế phẩm enzyme tương... trúc và chức năng của enzyme TB 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật Có thể nói ý tưởng chuyển gene mã hóa enzyme bổ sung trực tiếp vào thực vật, nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi sau này là một ý tưởng hay, đón đầu tương lai Trong một tương lai gần, ngay bản thân nguồn sản xuất thức ăn chăn nuôi đã chứa rất nhiều enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi rồi, thì người ta không còn phải sản xuất enzyme. .. thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme Do đó các chế phẩm này chưa cạnh tranh được với các chế phẩm ngoại nhập là các chế phẩm đa enzyme và đã có cải biến về di truyền, sử dụng các chủng vi sinh vật tái tổ hợp Chính vì vậy, mục... khả năng tiêu hóa thức ăn, tăng sản lượng thịt, sữa, đạt hiệu quả kinh tế cao với chi phí thấp Năm 2002, Võ Thị Hạnh (Vi n Sinh học Nhiệt đới) chủ nhiệm đề tài "Nghiên cứu để sản xuất chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật sống và enzyme dùng trong chăn nuôi (heo) và thủy sản (tôm)" Năm 2004 ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số đề tài liên quan tới vi c sản xuất các enzyme bổ sung cho thức ăn gia súc cũng đã được... học và Công nghệ, Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM) Đinh Văn Cải (1999, Vi n Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam) đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ men vi sinh trong khẩu phần của bò sữa và bê" Cũng trong năm, Vi n Sinh học Nhiệt đới thông báo đã sản xuất được các chế phẩm enzyme bằng phương pháp vi sinh vật: α-Amylase từ Aspergillus oryzae và Bacillus . CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn. CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn. E. coli tái tổ hợp được sử dụng để nghiên cứu các tính chất hóa lý của enzyme tái tổ hợp, chứ không được sử dụng trực tiếp để sản xuất enzyme tái tổ hợp dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Do