Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS TS Nơng Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen, Trưởng phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng, Viện Cơng nghệ sinh học- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn dìu dắt q trình hồn thành ḷn văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS TS Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển ứng dụng Công nghệ sinh học lĩnh vực Nông nghiệp phát triển nông thôn đến 2020”do Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tơi tham gia nghiên cứu, hồn thành luận văn theo hướng nghiên cứu đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể cán Phịng Cơng nghệ ADN Ứng dụng - Viện Cơng nghệ sinh học đặc biệt TS Lê Thị Thu Hiền KS Vũ Hải Chi đã giúp đỡ chỉ bảo tận tình suốt thời gian thực luận văn Cuối cùng, xin gửi tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập hoàn thành luận văn Học viên Nguyễn Thị Mai Hương AS NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ATP Acetosyringone bp Adenosine triphosphate DNA Base pair dNTP Deoxyribonucleic acid ddNTP Deoxynucleoside triphosphate EDTA Dideoxynucleoside triphosphate EtBr Ethylene diamine tetra acetic acid xylB Ethidium bromide Hph Xylanase B IM Hygromycin photpotransferase encoding gene kb Induction medium kDa Kilo base LB Kilo Dalton LC Luria – Bertani MES Luria – Complete PCR (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid RNase Polymerase Chain Reaction RNA Ribonuclease SDS Ribonucleic acid TAE Sodium Dodecyl Sulphate vir Tris – acetate – EDTA Virulence region MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương – TỔNG QUAN 1.1 Xylanase ứng dụng công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 1.1.1 Xylanase phân hủy sinh học xylan 1.1.2 Ứng dụng xylanase sản xuất thức ăn chăn nuôi 1.2 Nấm mốc ứng dụng công nghệ chuyển gen 10 1.2.1 Giới thiệu nấm mốc 10 1.2.2 Agrobacterium ứng dụng công nghệ chuyển gen thực vật nấm 12 1.2.3 Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A tumefaciens 17 1.2.3.1 Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A niger 17 Chương – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu .24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Hóa chất .24 2.1.3 Thiết bị 26 2.2 Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26 2.2.2 Biến nạp vào tế bào E coli A tumefaciens 30 2.2.3 Phương pháp điện di gel agarose 32 2.2.4 Nhân gen kỹ thuật PCR .33 2.2.5 Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ 34 2.2.6 Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn 36 2.2.7 Xác định trình tự gen xử lý số liệu phần mềm chuyên dụng .37 2.2.8 Phương pháp nuôi nhiễm A tumefaciens A niger 38 Chương – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1.1 Lắp ghép xylB vào vector trung gian 44 3.1.2 Lắp ghép cấu trúc biểu hph vào vector trung gian 50 3.1.3 Kiểm tra có mặt cấu trúc biểu xylB hph vector trung gian (pKS_xylB_hph) 56 3.2 Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu xylB hph 57 3.2.1 Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu xylB hph vector trung gian vào Ti plasmid .57 3.2.2 Kiểm tra có mặt xylB hph vector tái tổ hợp Ti plasmid .58 3.3 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu pCB_xylB_hph 62 3.3.1 Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A tumefaciens 62 3.3.2 Kiểm tra có mặt xylB hph Agrobacterium 62 3.4 Kết chuyển vector biểu xylB hph vào A niger thông qua A tumefaciens 64 3.4.1 Kết nuôi nhiễm 64 3.4.2 Chọn lọc thể nấm chuyển gen môi trường kháng sinh 67 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày tăng, đặc biệt enzyme xylanase Xylanase sử dụng nhiều ngành sản xuất công nghiệp toàn giới [18, 29] Một ứng dụng quan trọng xylanase dùng để bổ sung vào thức ăn chăn ni Sự có mặt xylanase thức ăn chăn ni có tác dụng thúc đẩy q trình tiêu hóa, từ cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột động vật [4, 13] Ngồi ra, xylanase cịn ứng dụng nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29] Trong tự nhiên, nhiều loại vi khuẩn nấm mốc tiết xylanase [22], xylanase nấm mốc tiết quan tâm chúng có hàm lượng cao ổn định Nấm mốc Aspergillus hay cịn gọi nấm sợi, nhóm nấm đa dạng phân bố rộng tự nhiên Với tiềm vô phong phú, Aspergillus quan tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất enzyme ngành nghiên cứu chế sinh lý sinh hóa chế di truyền vi sinh vật từ nhiều năm giới [9, 11] Do nhu cầu sử dụng xylanase nhiều lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày tăng Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen thu hút quan tâm nhiều nhà nghiên cứu [22, 31] Chuyển gen vào nấm dựa tảng công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu người sản phẩm protein enzyme để sản xuất qui mô công nghiệp Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ đặc tính enzyme tái tổ hợp cải thiện [22] Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sử dụng phổ biến giới để chuyển gen vào thực vật Bởi hệ thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định đơn giản Agrobacterium nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9] Xuất phát từ vấn đề trên, tiến hành thực đề tài: “Thiết kế vector biểu gen mã hóa xylanase nấm mốc” Đề tài thực Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen Phịng Cơng nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học Mục tiêu nội dung nghiên cứu đề tài Mục tiêu Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase gen kháng hygromycin B Trên cở sở tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ cơng tác chuyển gen mã hóa xylanase gen kháng hygromycin B vào A niger Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu gen mã hóa xylanase gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator) - Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu biểu gen mã hóa xylanase gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator - Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector biểu pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc - Chuyển vector biểu pCB_xylB_hph vào nấm mốc A niger thông qua vi khuẩn A tumefaciens Chương – TỔNG QUAN 1.1 Xylanase ứng dụng công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 1.1.1 Xylanase phân hủy sinh học xylan Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C 3.2.1.8)) enzyme quan trọng tham gia thủy phân xylan [13, 29] Xylanase thủy phân xylan cách cắt đứt liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành xylo – oligo [30] Tuy nhiên, cấu trúc xylan phức tạp nên để phân cắt hồn tồn cần lượng lớn enzyme xylanase [19] Xylanase tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…[22] Hình 1: Cấu trúc hóa học xylan Xylan thành phần cấu tạo nên hemicellulose thành tế bào thực vật số hợp chất polysaccharide quan trọng tự nhiên [12, 28] Xylan chủ yếu tìm thấy cấu trúc thứ cấp thành tế bào thực vật tạo thành pha giữa lignin hợp chất polysaccharide khác [29] Xylan polysaccharid phổ biển lồi thực vật thơng thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô sinh khối thực vật nhiệt đới Với gỗ mềm vùng ôn đới, xylan phổ biến chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô [29] Như vậy, vơ tình xylan trở thành thành phần có thức ăn chăn ni [28] Xylan đa dạng cấu trúc khối lượng phân tử Xylan polymer không đồng nhất, mạch thẳng, gồm đơn phân d – xylose liên kết với liên kết ß – 1,4 – glycoside Trong tự nhiên, chúng thay phần acetyl – – methyl – d – glucuronosyl arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng Tác động xylan mặt cấu trúc chưa rõ ràng khó khăn việc tách chiết xylan từ nguyên liệu tự nhiên mà không bị biến đổi hay số cấu trúc ban đầu xylan liên kết với thành phần khác [18, 23, 29] Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt vi sinh vật tiết enzyme xylanase Ứng dụng xylanase Hoppe - Seyler báo cáo từ trăm năm qua [18] Sự phân hủy sinh học khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D – xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid nối với xylose ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme thủy phân xylobiose xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động enzyme endo – xylanase Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng hạn α – glucuronidase α – L – arabinifuranosidase esterase chẳng hạn acetylxylan esterases ferulyl p – coumaroyl esterase loại bỏ mạch nhánh acetyl mạch nhánh phenol [29] Ở gỗ rắn, xylan có cơng thức O – acetyl – – O – methylglucuron – oxylan Arabino – – O – methylglucuroxylan tìm thấy gỗ mềm arabinoxylan điển hình cỏ thực vật bình thường khác [13] Sự đa dạng xylan dẫn đến đa dạng enzyme xylanase [13] Xylanase tiết từ vi sinh vật chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 họ 11 dựa trình tự tương đồng amino acid [28] Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng phức tạp (có thể thủy phân cellulose xylan), xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ (khoảng 20 kDa) đặc hiệu xylan [13, 29] Xylanase có nhiều loài sinh vật tự nhiên, sinh vật nhân sơ sinh vật nhân chuẩn tìm thấy vi khuẩn nước, nấm, tảo biển, côn trùng Cho đến nay, hầu hết xylanase chiết xuất từ vi khuẩn nấm [13, 29] Trong đó, nấm sợi nguồn vi sinh vật tiềm để chiết xuất xylanase với hàm lượng cao [13, 29] Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase tách chiết từ nấm gây bệnh ngũ cốc nói riêng vi sinh vật gây bệnh thực vật nói chung [29] Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan phân hủy cellulose tương đồng liên kết (1,4 – ß – glucosid) hai enzyme celllulase xylanase Một số loài Bacillus tiết xylanase, nhiều loài nấm sợi lại tiết lượng lớn protein ngoại bào tạo thành xylanase thường kèm theo enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn số loài thuộc Trichoderma, Penicillium Aspergillus [29] Do đó, để ứng dụng xylanase đạt hiệu cao cần phải loại bỏ ảnh hưởng cellulase, hoạt động bền vững với nhiệt độ Ngày nay, xylanase trọng nghiên cứu rộng rãi toàn giới, từ Châu Âu, đến Châu Á áp dụng nhiều ngành công nghiệp [13, 30] 1.1.2 Ứng dụng xylanase sản xuất thức ăn chăn nuôi Xylanase ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Xylanase hỗ trợ q trình tẩy trắng cơng nghiệp sản xuất giấy thay phải sử dụng hóa chất độc hại; xylanase tham gia trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; công nghiệp sản xuất bánh, xylanase dùng để làm tăng độ phồng giảm độ dính bánh; xylanase dùng cơng nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu [20, 29] Một ứng dụng quan trọng xylanase dùng để bổ sung vào thức ăn chăn ni Sự có mặt xylanase thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải khô [4, 5, 13, 27] Ngoài xylanase, số enzyme khác dùng để bổ sung vào thức ăn chăn ni, bao gồm: mananase, ß – glucanase cellulase, α – amylase, protease phytase Các loại enzyme sử dụng rộng rãi nhiều năm qua toàn giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ Châu Á [5, 13, 27] Do tiềm ứng dụng nhiều lĩnh vực mà xylanase thu hút mạnh mẽ quan tâm nhà nghiên cứu Xylanase tách chiết từ Aspergillus tách dịng biểu thành cơng Đặc tính enzyme phân tích [13] Những thành tựu sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho ngành sản xuất công nghiệp 1.2 Nấm mốc ứng dụng công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A tumefaciens 1.2.1 Giới thiệu nấm mốc Nấm mốc hay gọi nấm sợi vi sinh vật đa dạng tự nhiên Ước tính có khoảng 1,5 triệu lồi nấm, chiếm số lượng lớn lồi thuộc chi Aspergillus Chúng vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử sống hoại sinh nhờ khả sinh enzyme để phân hủy hợp chất hữu [8, 22] Aspergillus chi thuộc ngành Eumycota gồm nhiều lồi phổ biến, ví dụ: A niger, A oryzae Giống loài khác chi Aspergillus, A niger sinh bảo tử có màu đen, chúng cịn gọi mốc đen [33] A niger gây ảnh hưởng đến sản phẩm nông sản sau thu hoạch chúng gây bệnh cho người so với số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn A flavus, A fumigatus A niger sử dụng từ lâu sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33] Nhờ khả tiết enzyme với hàm lượng cao, A niger sử dụng phổ biến sản xuất thực phẩm coi loài vi sinh vật quan trọng sản 10 ... sử dụng xylanase nhiều lĩnh vực đặc biệt lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày tăng Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ vi sinh vật tái tổ hợp. .. niger sử dụng từ lâu sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33] Nhờ khả tiết enzyme với hàm lượng cao, A niger sử dụng phổ biến sản xuất thực phẩm coi loài vi sinh vật. .. nhóm nấm đa dạng phân bố rộng tự nhiên Với tiềm vô phong phú, Aspergillus quan tâm nghiên cứu ứng dụng sản xuất enzyme ngành nghiên cứu chế sinh lý sinh hóa chế di truyền vi sinh vật từ nhiều