Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi trong chăn nuôi
MỤC LỤC
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Phương pháp nghiên cứu
Để chuẩn bị nguyên liệu cho các phản ứng ghép nối gen với vector, ngoài các vector có sẵn trong các bộ Kit tách dòng như pJET1.2, pBluescript II KS(-), trong nội dung nghiên cứu này vector biểu hiện, vector tách dòng trung gian, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel 0,8 % agarose, sau đó cắt phần gel có băng DNA mong muốn và thu lại DNA bằng Kit tinh sạch Wizard®SV. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của.
Các enzyme hạn chế thường được sử dụng để cắt DNA: (i) Tạo đầu bằng, như Sma I, Eco RV cắt hai sợi DNA tại cùng một điểm tạo hai đầu bằng không có khả năng tự bắt cặp trở lại; (ii) Tạo đầu dính, như Hind III, Bam HI cắt theo vị trí lệch nhau trên hai sợi tạo các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để xác định trình tự như dNTP, ddNTPs, DNA polymerase …Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Thiết kế vector trung gian (pKS_xylB_hph) mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph
Trên điện di đồ (Hình 3.3), hầu hết DNA plasmid tái tổ hợp đều cao hơn so với DNA plasmid đối chứng. 4 plasmid có thứ tự từ giếng 1 – 4 tương ứng với các dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1; pAN_xylB2, pAN_xylB3 và pAN_xylB4 được tinh sạch và dùng làm khuôn cho PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho xylB: XylB – F và XylB – R kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector pAN – GluA. 4: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong vector tái tổ hợp pAN_xyB bằng PCR. Do đó, chúng tôi khẳng định đã nối ghép thành công xylB vào vector pAN7.1 – GluA. PCR được sử dụng để kiểm tra chiều gắn của đoạn xylB trên vector pAN - GluA. Tuy nhiên, PCR bằng cặp mồi đặc hiệu của xylB không thể phân biệt được chiều gắn của xylB vì chúng chỉ nhân lên đúng trình tự của xylB. Kỹ thuật cắt enzyme giới hạn cũng không thể áp dụng được bởi không lựa chọn được enzyme phù hợp. Chính vì thế chúng tôi đã thiết kế mồi SeqXylB – F kết hợp với mồi XylB – R để kiểm tra chiều gắn của xylB bằng kỹ thuật PCR. Mồi SeqXylB – F sẽ bắt cặp với trình tự trên đoạn khởi đầu GpdA của xylB, mồi XylB – R sẽ bắt cặp trên trình tự xylB. Nếu xylB lắp ghép đúng chiều vào giữa đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc thì kích thước sản phẩm PCR sẽ khoảng 1,2 kb; ngược lại nếu lắp không đúng chiều PCR sẽ không có sản phẩm. Điện di đồ kiểm tra chiều gắn của xylB trong vector. 5) tương ứng với dòng khuẩn lạc có kí hiệu pAN_xylB1 và pAN_xylB3 xuất hiện băng đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb. Sau khi lựa chọn một số dòng cao hơn đối chứng âm (vector pAN7.1 – GluA). DNA plasmid của các dòng khuẩn lạc này được tinh sạch và kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trong vector tái tổ hợp pKS_xylB bằng PCR sử dụng cặp mồi SeqXylB – F và XylB – R. 6: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB trên vector trung gian bằng PCR. 6), sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 1,2 kb, sáng và rất đặc hiệu phù hợp với tính toán lý thuyết. Trên vector pKS– cũng có điểm cắt của Kpn I, tuy nhiên nếu chuyển trực tiếp cấu trúc biểu hiện hph từ vector tái tổ hợp pKS_hph sang vector trung gian sẽ làm mất điểm cắt của Kpn I, hoặc vẫn chỉ có một điểm cắt của Kpn I và vector trung gian được tạo thành sẽ rất khó để tinh chế và nối ghép với Ti plasmid vector vì không có enzyme nào thích hợp cho cả hai vector trên.
Sản phẩm PCR nhận được là cấu trúc gồm (đoạn khởi đầu GluA + hph + đoạn kết thúc TrypC) và sản phẩm PCR được dùng làm đoạn chèn vào vector pJET1.2. * Lắp ghép hph trong vector tái tổ hợp pKS_hph vào vector pJET1.2. Theo lý thuyết, sản phẩm PCR khi sử dụng cặp mồi M13 với khuôn là DNA plasmid pKS_hph có kích thước khoảng 2,5 kb. 9: Điện di đồ kiểm tra sản phẩm PCR bằng mồi M13 của các plasmid tái tổ hợp pKS_hph. 9) thu được một băng đặc hiệu có kích thước khoảng 0,6 kb. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph). Theo lý thuyết, khi xử lý vector trung gian đã mang cả hai xylB và hph bằng Kpn I, sản phẩm cắt thu được là hai đoạn có kích thước 6,4 kb và 3 kb, trong đó 6,4 kb là kích thước tương ứng với hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph và 3 kb là kích thước của vector pKS-. Phản ứng cắt enzyme được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 37°C trong 1,5 giờ. 12: Điện di sản đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp pKS_xylB_hph bằng enzyme Kpn I. DNA plasmid pKS_xylB_hph M: Marker 1 kb. Vì kích thước của sản phẩm cắt enzyme lớn, DNA plasmid được điện di cùng để làm đối chứng. Nhờ vậy dễ dàng phân biệt được sản phẩm cắt enzyme trong những trường hợp xử lý enzyme không hoàn toàn hoặc enzyme không hoạt động. 12), sản phẩm cắt enzyme của 2 dòng plasmid trên giếng số 2 và giếng số 3 gồm hai băng rất rừ nột.
Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph
Đoạn DNA chèn và vector nhận sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn Kpn I và thu lại nhờ tinh chế sản phẩm trên gel agarose sẽ được nối ghép với nhau bằng phản ứng lai dưới sự hỗ trợ của enzyme T4 DNA ligase. Một số khuẩn lạc được nhặt nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/ml) ở 37°C qua đêm, sau đó kiểm tra DNA plasmid để lựa chọn các dòng cao hơn trên hình ảnh điện ảnh di để tiến hành kiểm tra sự có mặt của xylB trong Ti plasmid tái tổ hợp. Enzyme giới hạn Kpn I để dùng để cắt vector trung gian pKS_xylB_hph với mục đích tinh chế đọan gen cần nối ghép với vector pCB1300 và vector nhận pCB1300 cũng được cắt mở vòng bằng Kpn I nên điểm cắt của Kpn I không bị mất.
Vì vậy, khi xử lý DNA plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph bằng enzyme giới hạn Kpn I, kết quả thu được là hai đoạn gen có kích thước là 9 kb và 6,4 kb tương ứng với kích thước của pCB1300 và đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph. Tiến hành khảo sát thêm một số điểm cắt của enzyme giới hạn trên vector tái tổ hợp pCB1300_xylB_hph, enzyme Bgl II và Nco I được dùng để cắt điểm cắt nội trên đoạn gen mang hai cấu trúc (GpdA promoter + xylB gene +trypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator).
Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A
Theo nghiên Michielse và cs (2008), AS ảnh hưởng và cần thiết trong giai đoạn cùng nuôi, bởi nó cảm ứng gen vir chuyển T – DNA vào tế bào chủ, mặc dù AS không thật sự cần thiết trong giai đoạn chuẩn bị nguyên liệu nuôi nhiễm [9, 11]. Trên đĩa được sử dụng màng cellulose, nấm phát triển tốt hơn và mọc đều hơn trên khắp bề mặt giấy, trên đĩa được sử dụng màng nitrocellulose, nấm phát triển yếu hơn và thành từng cụm với màu đen sẫm so với đĩa nuôi nhiễm dùng màng cellulose. Nguyên nhân của sự khác nhau trờn đến nay vẫn chưa được biết rừ, song cú thể thành phần húa học của màng lọc ảnh hưởng đến sự phân bố và phát triển của Agrobacterium và bào tử nấm cũng như ức chế sự tương tác để vận chuyển T – DNA dẫn đến làm giảm hiệu suất chuyển gen [16].
Để sống sót trên môi trường có hygromycin, khuẩn lạc này chắc chắn phải mang gen kháng hygromycin, hơn nữa phải kháng lại cả cefotaxim vì cefotaxim là chất kháng sinh ức chế sự phát triển của Agrobacterium [11]. Nhiều nghiên cứu chứng minh, chuyển gen vào nấm thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn so với các chủng khác, chẳng hạn như chuyển gen vào Criphonectria paratosis thông qua Agrobacterium A281 có hiệu suất cao hơn Agrobacterium LBA4404 [12].
KIẾN NGHỊ