tìm hiểu tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng probiotics trong chăn nuôi

Đối với con người là một sản phẩm có giá trị cao mang lại sức sống cho cơ thể, hồi phục và trẻ hóa,… Trong vai trò là thức ăn chăn nuôi, probiotic góp phần vào việc giảm lượng tồn dư khá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ

MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



TÌM HIỂU TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG PROBIOTIC TRONG

THỨC ĂN CHĂN NUÔI

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: C 73

GVHD: TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG

SVTH: NGUYỄN THỊ THÚY HIỀN

TP HCM, THÁNG 7 NĂM 2010

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

Ban giám hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM

Qúy thầy, cô giảng dạy tại khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học.cùng tất cả các thầy, cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu trong nhữngnăm học vừa qua, giúp em có những kiến thức như ngày hôm nay để em cóthể áp dụng những kiến thức vào quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp nàycũng như vào thực tiễn cuộc sống sau này

Đặc biệt em xin chân thành gửi lời cảm ơn tới cô Nguyễn Hoài Hương

Đã định hướng , tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em suốt thời gian làm khóa luậnnày

Bên cạnh đó em xin cảm ơn những người bạn, anh, chị đã nhiệt tìnhgiúp đỡ em trong những ngày tháng vừa qua

Cảm ơn tập thể 07CSH đa giúp đỡ tôi vượt qua những ngày tháng khókhăn trong những năm học vừa qua và cho tôi những năm tháng học tập Cùngcác bạn rất vui

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả các bạn

Kính chúc thầy, cô, các anh, chị và các bạn dồi dào sức khỏe và luônluôn có được niềm vui trong cuộc sống

LỜI NÓI ĐẦU

Cùng với sự phát triển của nền kinh tế thế giới, các quan hệ buôn bán trao đổi, dịch vụ từng bước phát triển về cả số lượng và chất lượng đặc biệt là những dịch vụ trong lĩnh vực khoa học đem lại lợi ích cho con người Thêm vào

đó thế kỷ XX là thế kỷ mà khoa học công nghệ phát triển nhằm đáp ứng lại những nhu cầu ngày càng cao của con người, trong đó công nghệ sinh học cao là lĩnh vực mà con người đang hướng tới ngày nay, tìm ra những sản phẩm mang lại lợi ích phục vụ cho con người.

Một trong những nghiên cứu khoa học đem lại lợi ích kinh tế cao trong ngành chăn nuôi chính là việc bổ sung những vi khuẩn có lợi vào thức ăn chăn nuôi hay được gọi là probiotic.

Probiotic xuất hiện là sự kết hợp của khoa học kỹ thuật với sự tìm tòi nghiên cứu Probiotic có những đặc điểm mà có thể nói nó là sự sống.

Đối với con người là một sản phẩm có giá trị cao mang lại sức sống cho cơ thể, hồi phục và trẻ hóa,…

Trong vai trò là thức ăn chăn nuôi, probiotic góp phần vào việc giảm lượng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thịt, bù đắp lượng vi sinh vật cho đường ruột do việc điều trị kháng sinh trong thời gian dài, kích thích tiêu hóa, tăng trưởng và hạn chế bệnh tiêu chảy cho vật nuôi,…

Chính nhờ những ưu điểm trên mà probiotic đã trở thành sản phẩm hữu ích trong lĩnh vực chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam.

Ở Việt Nam, nền kinh tế ngày một phát triển, đời sống người dân ngày càng cao, thêm vào đó là xu thế hội nhập phát triển với nền kinh tế thế giới việc xuất hiện của sản phẩm có chất lượng cao trong chăn nuôi là rất cần thiết Vì giải quyết được sản phẩm thịt của nước ta luôn tồn dư lượng kháng sinh, sản phẩm thịt không đủ tiêu chuẩn để xuất khẩu qua các nước khác.

Nắm bắt được nhu cầu này các nhà khoa học trong nước đã bắt tay vào nghiên cứu và tìm ra những vi sinh vật có lợi, sản xuất chế phẩm vi sinh cao đưa vào ứng dụng trong chăn nuôi ở Việt Nam.

Sau hàng loạt các nghiên cứu, một số sản phẩm đã có mặt trên thị trường và cũng đạt được những thành công nhất định

Nhưng bên cạnh đó vẫn không ít khó khăn, hạn chế để những chế phẩm

vi sinh là probiotic trở nên phổ biến trong lĩnh vực chăn nuôi và phát triển mạnh mẽ ở Việt nam.

Vì vậy em đã chọn đề tài “TÌM HIỂU TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG PROBIOTIC TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI” Làm

đề tài cho khóa luận tốt nghiệp của mình.

Đề tài chia làm 4 chương

Chương I: Mở đầu

Chương II: Tổng quan về probiotic

Chương III: Thực nghiệm

Chương IV: Kết luận và đề nghị

ĐHQGHN: Đại học quốc gia hà nội

ĐHKHTN: Đại học khoa học tự nhiên

ĐHKTCN: Đại học kỹ thuật công nghệ

KHKT: Khoa học kỹ thuật

LAB: Lactic acid bacteria

LGG: Lactobacillus GG

MT I: Môi trường Một

MT II: Môi trường hai

MT III: Môi trường ba

NDOs: Non-degestible oligosaccharides

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh

Vk: vi khuẩn

VSV: vi sinh vật

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

LỜI NÓI ĐẦU

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

1.4 Ứng dụng đề tài 3

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 4

2.1 Lịch sử nguồn gốc 4

2.2 Định nghĩa 6

2.3 Tiêu chuẩn an toàn sinh học 8

2.4 Hoạt tính sinh học 8

2.5 Đặc tính kỹ thuật 9

2.6 Cơ chế hoạt động của probiotic 9

2.6.1 Tác dụng trên biểu mô ruột 10

2.6.1.1 Cơ chế kháng khuẩn 11

2.6.1.2 Cơ chế tăng cường miễn dịch v cc hoạt tính khc 12

2.7 Những vi sinh vật đóng vai trò là probiotic 14

2.7.1 Vi khuẩn Lactic 14

2.7.1.1 Hình thái, sinh lý vi khuẩn lactic 14

2.7.1.2 Giới thiệu một số vi khuẩn lactic được sử dụng là probiotic 22

2.7.1.3 Một số cơ chế chuyển hóa trong vi khuẩn probiotic LAB 24

2.7.2 Vi khuẩn Bacillus 24

2.7.2.1 Hình thái, sinh ly 24

2.7.2.2 Một số loài bacillus sử dụng làm probiotic 25

2.7.2.3 Một số sản phẩm probiotic thương mại chứa bào tử Bacillus.ssp.27 2.7.3 Giới thiệu về nấm men saccharomyces 29

2.7.3.1 Một số loài nấm men là probiotic 29

2.7.3.2 Mô hình cơ chế hoạt động của S booulardie chống vibrio cholerae,

clostridium difficile và Escherichia coli gây bệnh 29

2.8 Probiotic trong chăn nuôi 31

2.9 Tìm hiểu một số đề tài nghiên cứu về probiotic trong thức ăn chăn nuôi 32

2.9.1 Một số đề tài nghiên cứu trên thế giới 32

2.9.2 Nghiên cứu trong nước 33

2.9.2.1 Đề tài nghiên cứu phân lập đặc điểm vi khuẩn lactic ứng dụng làm chế phẩm vi sinh Khoa sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên ĐHQGHN 33 2.9.2.2 Đề tài nghiên cứu phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic Trường ĐH Kỹ thuật Công nghệ Tp.HCM 34

2.9.2.3 Đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic sử dụng trong thức ăn chăn nuôi Viện KHKT Nông Nghiệp Miền Nam 34

2.9.3 Một số công trình nghiên cứu đã công bố 36

2.10 Những mặt tích cực và hạn chế của những sản phẩm nghiên cứu trong nước 37

2.11 Một số sản phẩm men vi sinh probiotic trong thức ăn chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam sản xuất 37

2.11.1 Sản phẩm trên thế giới 37

2.11.2 sản phẩm sản xuất tại Việt Nam 39

2.12 Mức tiêu thụ của những chế phẩm probiotics có mặt trên thị trường43 2.13 Kết quả thử nghiệm một số sản phẩm probiotics trên heo và gia cầm 44 2.14 Kết quả sử dụng probiotic ở một số trang trại chăn nuôi 46

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM 48

3.1 Mục đích thực nghiệm 48

3.2 Nơi thực hiện 48

3.3 Vật liệu 48

3.4 Môi trường lên men 48

3.5 Phương pháp thực nghiệm 49

3.5.1 Thử nghiệm lên men tìm thời gian lên men thích hợp 49

3.5.2 Khảo sát các phương pháp sấy, xác định tỉ lệ sống sót của vsv 50

3.5.2.1 Phương pháp sấy phun sương 50

3.5 2.2 Phương pháp sấy đông khô 50

3.5.2.3 Sấy bằng nhiệt 50

3.5.2.4 Phơi ngoài không khí 51

3.5.3 Khảo sát tìm chất mang phối trộn thích hợp 51

3.5.4 Các chế độ bảo quản sản phẩm 51

3.5.5 Khảo sát khả năng sinh enzym cellulase thuộc chủng Asperiglus Niger, Asp Oryza 52

3.5.5.1 Môi trường lên men cho chủng Asperiglus Niger, Asp Oryza 52

3.5.5.2 Bố trí thí nghiệm 52

3.5.5.3 Cch tiến hnh 52

3.5.6 Lên men thu chế phẩm enzyme cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic 54

3.5.6.2 Quy trình nhân giống 54

3.5.6.3 Quy trình lên men thu chế phẩm enzyme cellulase 55

3.5.6.4 Thuyết minh quy trình 55

3.6 Kết quả v thảo luận 57

3.6.1 Sản xuất thử chế phẩm probiotic vi sinh 57

3.6.2 Sản xuất thử enzyme cellulase hỗ trợ tiêu hóa 60

3.6.3 Hoàn thành quy trình sản xuất chế phẩm 61

3.6.4 Chế phẩm probiotic dạng lỏng và dạng bột 66

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

4.1 Kết luận 67

4.2 Đề nghị 67

CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề :

Trong quá trình cải biến di truyền, năng suất chăn nuôi gia súc gia cầm tănglên đáng kể Việc tăng mật độ nuôi thách thức bệnh tật gia tăng do bị nhiễm các mầm

bệnh khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn đường ruột như E.coli, Salmonella ssp., Clostridium perfringens và Campylobacter ssp

Bệnh đường ruột có ảnh hưởng rất lớn đến ngành chăn nuôi Chúng làm giảmnăng suất, tăng tỷ lệ chết và cũng là nguồn nhiễm tiềm năng cho các sản phẩm thịt,giảm an toàn thực phẩm cho con người Sản phẩm thịt của chúng ta bị hạn chế xuấtkhẩu do không đủ chất lượng hay tồn dư kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng(người chăn nuôi trộn vào thức ăn để kích thích sinh trưởng, ngăn ngừa bệnh tật,giảm tiêu tốn thức ăn) Với ý thức ngày càng tăng của con người về sự kháng thuốccủa vi khuẩn, nên việc sử dụng kháng sinh chữa bệnh, phòng bệnh cho gia cầm đãgiảm dần Từ lâu đã có những mối quan tâm đến việc tìm ra một loại chất thay thếkháng sinh trong chăn nuôi Vi sinh vật sống trong ống tiêu hóa của vật nuôi có ảnhhưởng sâu sắc đến một vài quá trình sinh lí của vật chủ Vì vậy, điều quan trong làphải hiểu cơ chế của hệ vi khuẩn đường ruột gia cầm, gia súc, tìm ra chất thay thếchất kháng sinh Trong trạng thái bình thường thì trong đường ruột có sự cân bằnggiữa vi khuẩn có lợi và gây bệnh Nó bị ảnh hưởng bởi các tương tác và quan hệcộng sinh và cạnh tranh Cộng đồng vi khuẩn đó không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa

mà còn tăng khả năng sản xuất trong động vật chủ

Probiotic là một sản phẩm được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụngvào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm thay thế chất kháng sinh, tăng cường miễn dịchcho vật nuôi Probiotic có khả năng hạn chế tiêu chảy ở heo con, kích thích sự tiêuhóa cũng như tăng trưởng của heo thịt đang là đòi hỏi cấp thiết của các nhà chănnuôi Việc sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng vi sinh vật cùng với enzyme bổsung vào thức ăn chăn nuôi sẽ góp phần nâng cao năng suất thông qua việc tăng sức

đề kháng cho gia súc, gia cầm, đặc biệt là gia súc non, tăng khả năng tiêu hóa, hấpthụ chất dinh dưỡng, từ đó tăng thu nhập cho nông hộ, giải quyết công ăn việc làm,thúc đẩy sản xuất phát triển

Để có được thịt sạch đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trong nước và xuất khẩu, ngànhchăn nuôi Việt Nam có thể tìm thấy lời giải trong việc thay thế việc sử dụng khángsinh, chất kích thích sinh trưởng bằng probiotics kết hợp với enzyme hỗ trợ tiu hĩa

Cụ thể probiotic là gì? Và việc bổ sung probiotic vào thức ăn cho vật nuôi thì

có lợi như thế nào? Để sản xuất chế phẩm probiotic đặc thù cho chăn nuôi cầnnghiên cứu triển khai những vấn đề gì? Để giải đáp những câu hỏi trên tôi chọn đềtài khóa luận tốt nghiệp nhan đề: “Tìm hiểu tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứngdụng probiotic trong chăn nuôi”

1.2 Mục đích đề tài:

Mục đích của đề tài nhằm tìm hiểu những nghiên cứu về phân lập, tuyển chọncác vi sinh vật làm chế phẩm probiotic trong chăn nuôi trên thế giới và ở Việt Nam

Tìm hiểu về quy trình sản xuất chế phẩm probiotic

Ứng dụng của chế phẩm trong chăn nuôi

1.3 Nội dung đề tài:

- Tổng quan về nghiên cứu sản xuất và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi, cụ

thể là vi khuẩn lên men lactic, Bacillus spp và nấm men cũng như các enzyme hỗ trợ

tiêu hóa nhằm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn

- Thực nghiệm quy trình sản xuất thử chế phẩm probiotic: khảo sát tìm cácmôi trường sản xuất và điều kiện bảo quản chế phẩm; khảo sát khả năng sinh enzym

cellulase từ chủng nấm mốc Aspergillus niger, Asperigillus oryzae; thu chế phẩm

enzym cellulase bổ sung vào chế phẩm probiotic

1.4 Ứng dụng đề tài:

Đề tài là cơ sở lý thuyết cho nghiên cứu thực nghiệm về phân lập tuyển chọnnhững chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic để sản xuất và phát triển chế phẩmprobiotic ứng dụng trong chăn nuôi tại Việt Nam

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC 2.1 Lịch sử nguồn gốc:

Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm, tăng cường sức khỏe cho con ngườikhông phải là mới Trên hàng nghìn năn về trước, rất lâu đời khi chưa tìm ra thuốckháng sinh, con người đã biết đến các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi cho sứckhỏe như: Sữa lên men, các sản phẩm lên men khác… khi điều tra dựa trên khoahọc, việc sử dụng các loại thực phẩm lên men trong nhiều nền văn hóa của thế giớixảy ra trước sự ra đời của điện lạnh Khái niệm áp dụng cải thiện sức khỏe bằng cách

bổ sung tự nhiên các vi sinh vật có ích cho đường ruột, bằng cách thêm vào đồ uống

đi từ thế kỷ thứ mười chín muộn Vào thời điểm đó, một số bác sĩ cho rằng do bệnhtật và lão hóa chính là quá trình để xây dựng các sản phẩm chất thải hoặc, sự thối rữa

trong ruột già (phần dưới của ruột già mà đổ vào trực tràng), và vật liệu độc hại bị rò

rỉ từ ruột kết vào dòng máu Quá trình rò rỉ-bây giờ gọi là ruột thấm hoặc hội chứngruột bị thủng, và dẫn đến ngộ độc từ nó, được gọi là sự tự thụ độc Lý thuyết chorằng sự tự thụ độc thay đổi chế độ ăn kiêng nhằm giảm phân hủy chất độc hại trongruột kết sẽ có lợi cho sức khỏe Một số nhà quan sát đã biết về việc sử dụng các vikhuẩn Acid lactic trong xúc xích, lên men thịt và bảo vệ nó khỏi hư hỏng, bởi vì các

vi khuẩn này vô hại đối với con người, họ đã nghĩ rằng bổ sung chúng vào chế độ ănuống bằng cách, ăn các loại thực phẩm lên men sẽ làm giảm lượng độc tố sản xuấttrong ruột kết Nhóm Lactobacilli của vi khuẩn, một số trong đó được tìm thấy trongsữa chua, đây là những người đầu tiên tìm hiểu, xác định probiotic

Trong thập niên 1920 và 1930, nhiều bác sĩ khuyến cáo Acidophillus có

trong sữa, trong đó có các loài vi khuẩn Lactobacillus acidophillus, để điều trị táo

bón và tiêu chảy Điều này đã được điều trị hiệu quả cho nhiều bệnh nhân

Giai đoạn tiếp theo trong sự phát triển của probiotic vào những năm 1950,

khi các nhà nghiên cứu y tế bắt đầu biết đến Lactobacillus acidophilus v Lactobacillus acidophilus là một câu trả lời cho một số các tác dụng phụ tiêu hóa khi

dùng thuốc kháng sinh Mọi người biết rằng thuốc kháng sinh phá vỡ cân bằng tự

nhiên của đường ruột bằng cách giết chết vi của các lợi ích cũng như các vi khuẩn

gây bệnh Các nhà nghiên cứu nghĩ rằng việc uống các chế phẩm cĩ bổ sung

Lactobacillus acidophilus, có thể bù đắp những tác dụng phụ của thuốc kháng sinh.

Một trong những khó khăn chính của chế phẩm probiotic là đảm bảo sự sống sót củanhững vi khuẩn khi ở trong dạ dày và các quá trình tiêu hóa của ruột non và thành

công với thực dân trong ruột kết Gần đây, probiotic với sự sống sót đặc biệt và

thành công với thực dân trong ruột kết được minh chứng trong các nghiên cứu, đãnổi lên trên thế giới Điều này cho thấy, probiotic đã được sàng lọc từ nhiều chủng

của lactobacilli

Goldin, Sherwood Gorbach và Barry đã nghiên cứu Lactobacillus GG (LGG) v chứng minh có hiệu quả chống viêm đại tràng

Clostridium difficile chống nhiễm trùng ruột kết là kết quả của Overkill,

kháng sinh của vi khuẩn hữu ích và chống dị ứng ở trẻ em do ruột thấm

Hippoocrates và nhều người khác đã chỉ định sữa lên men có tác dụng dinhdưỡng và nó có thể chữa trị rối loạn ruột và dạ dày ( oberman, 1985)

Từ thời đó thì các nhà khoa học đã nghiên cứu và rất nhiều người đã tìm ranhững vi sinh vật sống và lợi ích của chúng có ý nghĩa rất lớn đến cuộc sống của conngười

Với hai nhà khoa học Lourens Hattigh và Viljoen, 2001, những nghiên cứu từtrước các kiến thức về probiotic ngày càng được đẩy mạnh hơn nũa

Giai đoạn của thế kỷ ny là đề cập đến việc sử dụng sữa lên men để điều trịbệnh lây nhiễm đường ruột, các nghiên cứu gần đây tập trung vào lợi ích khác cuảcác vi khuẩn khi ở trong đường ruột và các loại thực phẩm để vận chuyển vào cơ thểcon người và vật nuôi

thuật ngữ probiotic là thuật ngữ PREBIOTIC : Là những non-digestibleoligosaccharides (NDOs), ảnh hưởng đến sự phát triển của khu hệ vi sinh vật (baogồm cả resistant starches) Sự kết hợp của probiotic và prebiotic gọi là synbiotictăng cường khả năng điều hòa khu hệ vi sinh vật ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa,chống bệnh đường tiêu hóa của vật chủ.

Từ “probiotics” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “Cho cuộc sống” Tuynhiên, định nghĩa về probiotics đã phát triển nhiều theo thời gian Lily và Stillwell(1965), đã mô tả trước tiên probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vậtnguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác Phạm vi của định nghĩanày được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm, dịch chiết

tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật

Probiotic là những vi sinh vật như: vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vàothực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể vi sinh vật đường ruột của sinh vật chủ( parrer, 1974)

Vì vậy, khái niệm “probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất màgóp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột” Định nghĩa chung này sau đó được làmcho chính xác hơn bởi Fuller (1989), ông định nghĩa probiotic như “một chất bổ trợthức ăn chứa vi sinh vật sống mà có ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiệncân bằng hệ vi sinh vật ruột của nó” Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn :

“vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khôhay bổ sung trong thực phẩm lên men), mà thể hiện có lợi đối với sức khỏe của vậtchủ sau khi được tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vậtchủ”( Havenaar và Huis in't Veld, 1992)

Theo Laurent Verschuere và CTV (2000) probiotic được định nghĩa như sau:

"Probiotics là sinh vật sống có ảnh hưởng tốt cho vật chủ nhờ vào sự biến đổi hệ sinhvật gắn với vật chủ hay xung quanh vật chủ, từ đó cải thiện khả năng sử dụng thức

ăn, nâng cao khả năng chống bệnh của vật chủ, và cải thiện môi trường

xung quanh”

Năm 2001 Schrezenmeir và Devrese định nghĩa Probiotic là "Lượng vi sinhvật sống xác định với số lượng thích hợp được chuẩn bị trong các sản phẩm, có tác

dụng biến đổi tích cực hệ vi sinh vật vùng ruột và có tác dụng tốt đến sức khỏe vậtchủ”

Theo định nghĩa của FAO/WHO 2002:" Probiotic, đó là những vi sinh vậtsống được kiểm soát chặt chẽ, với lượng thích hợp mang lại lợi ích cho vật chủ"

Tóm lại probiotic là:

- Tập hợp các vi sinh vật sống

- Được đưa vào cơ thể vật nuôi qua đường tiêu hóa (thức ăn hay thuốc)

- Đem lại hiệu quả thích cực cho sức khỏe của vật chủ

Để “tập hợp các vi sinh vật sống “thực sự” đem lại hiệu quả tích cực cho sức khỏevật chủ”, chúng phải được chọn lọc đáp ứng các tiêu chuẩn về

- An toàn sinh học

- Hoạt tính sinh học

- Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm của ngành lên men công nghiệp(Tuomola et al.,2001)

2.3 Tiêu chẩn an toàn sinh học

Các vi khuẩn Lactic hay vi khuẩn lên men Lactic acid bacteria (LAB), được

sử dụng làm probiotic nhiều nhất vì chúng được sử dụng trong thực phẩm lên mentruyền thống từ rất lâu Người ta xếp chúng vào vi sinh vật GRAS (Generelly.Recognized As safe ).lee y k và salminens., 2009)

2.5 Đặc tính kỹ thuật để trở thành sản phẩm của ngành lên men công nghiệp

- Khả năng lên men

- Khả năng tổ hợp

- Khả năng sinh axit lactic

- Khả năng kháng khuẩn

2.6 Cơ chế hoạt động của probiotic

Cách thức hoạt động của probiotics là loại trừ, cạnh tranh, nghĩa là cạnh tranhbám vào màng nhầy thành ruột, qua đó tạo nên một hàng rào vật lý bảo vệ sự tấncông của các khuẩn gây bệnh ( Fullar, 2005) Chúng cũng sản xuất ra hoạt chấtkháng khuẩn và men kích thích hệ thống miễn dịch

Ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra acidlactic, acid béo, peroxide và các kháng sinh In vitro, các vi khuẩn lactic ngăn cản sự

phát triển của Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella và các chủng E.coli gây bệnh.

Tăng cường tiêu hóa thức ăn: Vi khuẩn lactic sản xuất vitamin nhóm B và cácenzyme phân giải protein, lipid và chuyển hóa đường latose trong sữa thành acidlactic, ngăn ngừa chứng tiêu chảy do không dung nạp đường lactose trong sữa (xảy

cholesterol có bổ sung các chủng vi khuẩn lactic được phân lập trên.

2.6.1 Tác dụng trên biểu mô ruột.

Vi sinh vật probiotic có khả năng bám dính tốt tế bào biểu môruột, cạnh tranhnơi cư trú với các vi sinh vật bệnh v cạnh tranh dinh dưỡng Do đó, chúng có khả

năng giảm kích thích bài tiết và những hậu quả do phản ứng viêm của sự lây nhiễm

vi khuẩn, cũng như đẩy mạnh sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

2.6.2.Tác dụng đến hệ vi sinh vật đường ruột

Probiotic điều chỉnh thành phần của vi khuẩn đường ruột Sự sống sót củaprobiotic được tiêu hóa ở những phần khác nhau của bộ phận tiêu hóa thì khác nhaugiữa các giống Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của

hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầutiêu thụ thực phẩm có probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của giống vikhuẩn Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn định cư một cáchtạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽgiảm xuống Điều này thì đúng cho tất cả các loại probiotic Vi khuẩn probiotic điềuhòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Probiotic có thể làm giảm pHcủa bộ phận tiêu hóa và có thể theo cách đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết raenzyme của sinh vật đường ruột

Probiotic định cư ở ruột với những vi khuẩn có lợi và loại trừ bệnh gây ra bởi

các sinh vật như E.coli, Salmonella và Clostridium ở những vị trí lông nhung của

ruột non, nơi mà vi khuẩn có hại sẽ phá hủy lông nhung Probiotic gia tăng sự khángbệnh bằng cách tăng độ cao của lông nhung và tăng độ sâu của các khe nằm giữalông nhung, theo cách đó sẽ gia tăng được diện tích bề mặt hấp thu chất dinh dưỡng

Vì vậy, vật sẽ gia tăng hiệu quả hấp thụ thức ăn

Những nhà khoa học từ Viện nghiên cứu thực phẩm ở Norwich, nước Anhbáo cáo là những probiotic đặc biệt có thể tiêu diệt mầm bệnh vi khuẩn sống ở ruộtgia cầm, do đó giúp loại bỏ mối đe dọa sự ngộ độc thực phẩm vi khuẩn từ chuỗi thứcăn

2.6.2.1.Cơ chế kháng khuẩn của vi sinh vật probiotic:

Vi sinh vật probiotic làm giảm số lượng vi khuẩn gây bệnh để ngăn chặn cácmầm bệnh bằng cch tiết ra các chất kháng khuẩn ức chế cả vi khuẩn Gram dương vàGram âm Đó là các acid hữu cơ như: Acid lactic, acid acetic…và đặc biệt làBacteriocin - nhóm peptide hay protein được tổng hợp nhờ ribosome có hoạt tính

Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh vật mang mầmbệnh mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố.Điều này được thực hiện bằng cách giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra cácacid beo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, và butyrate, nhất làacid lactic

Hình 2.1: Cơ chế kháng vi sinh vật của Bacteriocin.(Cotter et al.,2005).

Bacteriocin class I ( đại diện: nisin của Lactococcus lactis), gắn vào lớp lipid II, ngăncản sự vận chuyển các tiểu đơn vị peptiddoglycan từ tế bào chất đến vách tế bào, do

đó ngăn cản tổng hợp vách tế bào hoặc bám vào lớp lipid II, các phân tử nisin tạo lỗxuyên màng tế bào dẫn đến tiêu bào; bacteriocin class II (đại diện sakacin củaLactobacillus sake) là các peptide lưỡng tính có khả năng xuyên màng tế bào tạokênh, lỗ trên màng Lớp III (còn gọi là bacteriolysin như lysostaphin), protein khôngbền nhiệt, tác động trực tiếp lên vách tế bào đích

2.6.2.2 Cơ chế tăng cường miễn dịch v cc hoạt tính khc

Probiotic như là phương tiện để phân phát các phân tử kháng viêm cho đườngruột Đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm Tạo đáp ứngmiễn dịch để làm giảm dị ứng Vi khuẩn probiotics có khả năng huy động các tế bàomiễn dịch, hoạt hóa các đáp ứng miễn dịch thích hợp nhờ một cơ chế phức tạp bắtđầu bằng sự tương tác giữa tế bào probiotic và tế bào của hệ miễn dịch

Một nhóm các nhà khoa học vừa công bố tác dụng của vi sinh vật probioticảnh hưởng như thế nào đến hoạt động của các gene của các tế bào trong ruột Đây là

kết quả đầu tiên về cơ chế thay đổi các phản ứng miễn dịch của probiotics Nghiêncứu được thực hiện bởi một nhóm các nhà khoa học của Viện Dinh dưỡng và thựcphẩm (TIFN) thuộc trường Đại học Maastricht và trường Đại học Radboud (Hà Lan)

và trung tâm nghiên cứu Hà Lan NIZO (hình 2.2.)

Hình 2.2 Cơ chế miễn dịch Lactobacillus plantarum-tạp chí Proceedings

of the National Academy of Sciences (PNAS Early Edition) Trong nhóm các tình

nguyện viên, một số được tiếp thu probiotic sống Lactobacillus plantarum, một số

khác tiếp thu các tế bào vô hoạt của chủng probiotic này, và số còn lại tiếp nhậnplacebo Các phân tích biểu hiện gene các tế bào của tá tràng đã được tiến hành vàcho thấy rõ ràng hiệu quả của probiotic sống đối với các hoạt động tế bào Các hoạtđộng này kích hoạt hệ miễn dịch và cho phép nó giữ vai trò bảo vệ (phản ứng miễndịch)

Giáo sư Michiel Kleerebezem giải thích rằng các cơ chế phân tử liên quan đếnhoạt động của probiotics hiện vẫn còn ít được biết đến Các phương pháp tiếp cận đachiều của TIFN, nơi tập trung các nhà khoa học về thực phẩm, về ngành ruột và cácnhà vi sinh vật học, đã cho phép nghiên cứu các cơ chế phân tử các hoạt động củaprobiotic Các phân tích biểu hiện gene cho phép các nhà khoa học chứng minh hiệuquả trực tiếp của probiotics đối với màng nhầy ruột Nhờ sự giúp đỡ của cơ sở dữliệu và các chuyên gia tin sinh học, họ đã xác định gene của các tế bào biểu mô gây

ra cơ chế của các phản ứng miễn dịch Kết quả nghiên cứu đầu tiên về cơ chế ảnh

hưởng của probiotic đến hệ miễn dịch này đã được xuất bản trong tạp chíProceedings of the National Academy of Sciences (PNAS Early Edition).

Nhiều nghiên cứu gần đây còn cho rằng probiotic có tác dụng kháng đột biến

và kháng ung thư nhờ sự tương tác của các tế bào này với các tác nhân gây đột biến

và ung thư nhưng còn gây nhiều bàn cãi

2.7 Những vi sinh vật đóng vai trị l probiotic

2.7.1 Vi khuẩn Lactic

2.7.1.1 Hình thái, sinh lý vi khuẩn lactic

Nhìn chung, vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, không tạo bào tử, kị khítùy ý, hầu hết không di động Chúng không có khả năng sản xuất những hợp chất cầnthiết để chúng tồn tại và phát triển Môi trường sống của vi khuẩn lactic phải hiệndiện hầu hết các chất dinh dưỡng Chúng được tìm thấy trong nhiều loại thực phẩmlên men như sữa chua, kim chi, dưa muối chua, nem chua….Vi khuẩn lactic tồn tạikhá hạn chế trong một số môi trường do nhu cầu dinh dưỡng cao của nó

* Phân loại Theo khoá phân loại Bergey(2001), vi khuẩn lactic được xếp Vào 4 họ: Lactobacillaceae, Enterococcaceae, Leuconoscaceae, stretococcaceae

* Sự sắp xếp của các chi Lactobacillus

Lactobacillus delbruckii Lactobacillus curvatus Lactobacillus buchneri

Lactobacillus helveticus Lactobacillus plantarum Lactobacillus fermentum Lactobacillus

salivarius Lactobacillus sakei Lactobacillus reuteri

(a): Khi lên men, (b): Cảm ứng bởi pentoses

Nguồn chuyển thể từ Sharpe [117] and Kandler and Weiss [113

Về mặt hình thái các nhóm vi khuẩn lactic tồn tại chủ yếu ở hai dạng: hìnhque hoặc hình cầu

- Hình cầu: Diplococcus (hình cầu kết đôi), Tetracoccus (4 tế bào kết lại),Streptococcus (hình cầu chuỗi)

- Hình que: que ngắn hoặc que dài, có thể tồn tại dạng tế bào đơn, kết đôi,hoặc kết chuỗi

Về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất: Thu nhận năng lượng nhờ phângiải carbonhydrate và tiết ra acid lactic Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinhacid lactic, các vi khuẩn lactic là vi khuẩn lên men bắt buộc, chúng không cócytochrome và enzyme catalase Tuy nhiên chúng vẫn có thể sinh trưởng được khi cómặt oxi do có enzyme peroxidase

Không một đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên môi trường

muối khoáng thuần khiết chứa glucose và NH4+ Vì có nhu cầu về các chất dinhdưỡng phức tạp nên đa số chúng cần một môi trường chứa hàng loạt các vitamin(lactoflavin, tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các acid

amin Do đó, người ta thường nuôi cấy các chủng vi khuẩn này trên môi trường chứamột số lượng tương đối cao nấm men, dịch cà chua và thậm chí là máu

* Đặc điểm chi tiết của từng giống theo khoá phân loại Bergey

Lactobacillus:

Tế bào hình que và thường có kích thước (0,5–1,2) ×(1,0–10,0)ìm, kết thànhchuỗi ngắn nhưng thỉnh thoảng có dạng gần giống hình cầu Đây là các vi khuẩnGram dương, không tạo bào tử, hiếm khi di động bằng lông roi Kị khí không bắt

buộc nhưng phát triển tốt hơn trong điều kiện không có khí oxy Nhìn chung, các loài

trong giống này sẽ phát triển tốt hơn trong điều kiện có 5% CO2 Khuẩn lạc trên môi

trường agar có kích thước 2 - 5mm, dạng lồi, mờ đục và không nhuộm màu Những

tế bào này hóa dưỡng hữu cơ đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp và giàu chất dinhdưỡng; có khả năng lên men và phân huỷ saccharose; ít nhất một nửa sản phẩm lênmen từ nguồn carbon là lactate Không khử được nitrate, không làm tan gelatin,không có catalase cũng như cytochrome Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 30 –

40oC Lactobacilii phân bố rộng rãi trong môi trường, đặc biệt là trên những thực

phẩm có nguồn gốc thực vật và động vật; chúng thường sống trong ruột của chim vàđộng vật hữu nhũ

Một số chủng điển hình: Lactobacill s acidophilus, Lactobacillus brevis , Lactobacillu bulgaricus , Lactobacillus casei , Lactobacillus Lactobacillus,

Lactobacillus helveticus,LactobacillusplantarumLactobacillus reuteri …

a) Lactobacillus bulgaricus b) Lactobacillus casei

Hình 2.3 : Tế bào vi khuẩn lactic giống Lactobacillus phóng đại 2000 lần

Pediococcus:

Tế bào hình cầu, không bao giờ kéo dài, đường kính 0,5 – 1,2ìm Sự phân chialuân phiên về góc bên phải tạo thành dạng tứ cầu khuẩn dưới điều kiện thích hợp

Đôi khi tế bào vi khuẩn này cũng tồn tại ở dạng kết đôi Rất hiếm gặp tế bào đơn vàkhông bao giờ chúng ở dạng chuỗi Không di động, không tạo bào tử Là loại

vi khuẩn hiếu khí tuỳ ý nhưng đôi khi sự tăng trưởng bị ức chế khi ủ trong khôngkhí Hoá dưỡng hữu cơ, tế bào đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng và có thể lên mencarbonhydrate (chủ yếu là mono- và disaccharide) Lên men glucose sinh acid nhưngkhông sinh gas; sản phẩm chính là DL và L(+)-lactate Catalase âm, không cócytochrome Không khử được nitrate Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 25 –

40oC Thường xuất hiện trên rau quả và các loại thực phẩm khác; không gây bệnh

cho thực vật và động vật

Hình 2.4: Tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Pediococcus.

Các chủng thường gặp: Pediococcus acidilactici , Pediococcus cellicola , Pediococcus claussenii, Pediococcus damnosus, Pediococcus dextrinicus , Pediococcus inopinatus , Pediococcus parvulus, Pediococcus pentosaceus ,

Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Enterococcus

Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,6–2,0) × (0,6–2,5)ìm, thườngxuất hiện ở dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng Không tạo nội bào tử,Gram dương Thỉnh thoảng di động bằng lông roi Không có bao nang Hiếu khí tuỳ

ý, hóa dưỡng hữu cơ bằng cách lên men nhiều loại đường khác nhau tạo sản phẩmchính là L(+)-acid lactic nhưng không sinh gas và pH đạt được tối đa là 4,2 – 4,6.Môi trường dinh dưỡng phức tạp Catalase âm Có thể phát triển ở 10 – 45oC (tốithích 37oC), pH 9,6; 6,5% muối NaCl, và 40% muối mật Rất hiếm khi khử đượcnitrate Thường lên men lactose Hiện diện rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt trongphân động vật có xương sống, thỉnh thoảng gây bệnh

Một số chủng thông thường: Enterococcu durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium …

Leuconostoc:

Hình 2.6: tế bào vi khuẩn lactic thuộc giống Leuconostoc

Tế bào có dạng hình cầu, đôi khi kéo dài khi ở dạng kết cặp hoặc kết chuỗi,kích thước (0,5 - 0,7) × (0,7 - 1,2) ìm Khi kết thành chuỗi dài, tế bào có dạng quengắn và những tế bào ở cuối có dạng hơi tròn Gram dương, không di động, khôngtạo bào tử Phát triển khá chậm, khuẩn lạc nhỏ và dẹt trên môi trường có chứasucrose Hiếu khí tuỳ ý, hóa dưỡng hữu cơ bằng con đường lên men carbonhydratebắt buộc, đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là

20 – 30oC Lên men glucose tạo thành acid và sinh gas; sản phẩm chính là ethanol vàD(-)-lactate Chỉ lên men được mono- và disaccharide Catalase âm, không phân giải

được arginine, không sinh indol, không làm tan máu, không khử nitrate PH của môi

trường lỏng khi kết thúc nuôi cấy là 4,4 – 5,0 Phân bố rộng rãi trên thực vật, các sản

phẩm sữa và các sản phẩm khác Không gây bệnh cho thực vật và động vật

Một số chủng ưa gặp: Leuconostoc carnosum , Leuconostoc citreum , Leuconostoc urionis , Leuconostoc fallax , Leuconostoc ficulneum , Leuconostoc

fructosum , Leuconostoc garlicum , Leuconostoc gasicomitatum , Leuconostoc

gelidum , Leuconostoc inhae , Leuconostoc kimchii , Leuconostoc lactis , Leuconostoc

mesenteroides , Leuconostoc pseudoficulneum , Leuconostoc pseudomesenteroides …

Streptococci

Cc vi khuẩn thuộc Streptococcus trước kia nay trong hệ thống phân loại Bergey bao gồm cả những vi sinh vật được xếp vào giống Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus Nói cách khác, chúng bao gồm enterococci, lactic

streptococcci và các streptococci hiếu khí và sinh mủ Tế bào hình cầu hoặc hình

trứng, đường kích 0,5 – 2,0 ìm, thường kết thành cặp hoặc thành chuỗi khi phát triểntrên môi trường lỏng; đôi khi chúng kéo dài theo trục của chuỗi tạo thành dạng nhưmũi mác Không di động, không tạo bào tử và Gram dương Một vài loài có thể tạobao nang, hiếu khí tuỳ ý, hóa dưỡng hữu cơ, đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng vàđôi khi cần duy trì lượng CO2 là 5% Lên men trao đổi chất, sản phẩm chính làlactate nhưng không sinh gas Catalase âm Nhiệt độ

phát triển là 25 – 45oC, tối thích là 37oC Kí sinh trên động vật có xương sống,

đặc biệt là vùng miệng và ruột, thỉnh thoảng gây bệnh cho người và động vật

Hình 2.7 : Tế bào vi khuẩn lactic giống Streptococcus phóng đại 2000 lần

Lactococcus:

Tế bào hình cầu hoặc hình trứng, kích thước (0,5 – 1,2) × (0,5 – 1,5) ìm,thường xuất hiện dạng cặp hoặc chuỗi ngắn trong môi trường lỏng Không tạo nội

bào tử Gram dương Không di động và không có bao nang Hiếu khí tuỳ ý Hóa

dưỡng hữu cơ bằng con đường lên men trao đổi chất; lên men nhiều loạicarbonhydrate với sản phẩm tạo thành chủ yếu là L(+)-lactic acid nhưng không sinhgas Môi trường dinh dưỡng phức tạp Catalase âm Phát triển được ở 10 – 45oC vàtối thích ở 30oC, không có muối NaCl Được tìm thấy phổ biến nhất trong các sảnphẩm sữa và trên thực vật

Một số chủng thông thường Lactococcus lactis cremoris, Lactococcus lactis hordniae, Lactococcus lactis lactis, Lactococcus lactis lactis bv Diacetylactis…

Hình 2.8 : Tế bào vi khuẩn Lactococcus lactis

2.7.1.2 Giới thiệu một số vi khuẩn lactic được sử dụng là probiotic

Fuller (1989) and Conway (1996) đã liệt kê những loài vi sinh vật được sử

dụng là probiotic: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactococcus lactis subsp cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium

adolescentis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve.

* Lactobacillus acidophilus

Đặc điểm chung của vi khuẩn này được tóm tắt như sau: Lactobacillus acidophilus thuộc trực khuẩn, có kích thước: rộng 0,6 – 0,9 µm, dài 1,5 – 6,0 µm.

Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, đôi khi chúng tạo thành những chuỗi ngắn.Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram (+) và có khả năng chuyển động, có khả năng lênmen một số loạt đường như: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose,saccharose để tạo ra acid lactic, hoàn toàn không có khả năng lên men xylose,arabinose, rahamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol, inositol.

Trong quá trình lên men chúng tạo ra cả hai dạng đồng phân quang học D vàL- lactic acid Trong đó L-lactic acid chiếm tỉ lệ gần 70%

Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C - 500C

Lactobacillus acidophilus là loại vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến nhất

trong các chế phẩm probiotic, chúng có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày

trong dịch mật tinh khiết, 8 ngày trong dịch tràng Lactobacillus acidophilus sản xuất

acid lactic và các chất diệt khuẩn như lactocidin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sựtăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn

đường ruột Lactobacillus acidophilus còn có thể tổng hợp các vitamin và đây là loài

vi khuẩn có khả năng bền vững với 40 loại kháng sinh

* Lactobacillus casei

Lactobacillus casei: Trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn Chúng có thể

tạo thành chuỗi, không chuyển động, Gram (+).Chúng có khả năng lên men được cácloại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin

Trong quá trình lên men chúng tạo thành L - acid lactic vơi nồng độ khoảng180g/l trong tổng số 210g/l acid lactic

Nhiệt độ phát triển tối ưu là 38 - 400C.

* Lactobacillus sporogenes :

Lactobacillus sporogenes l trực khuẩn, có kích thước 0,7 – 0,9 µm; 2,0 – 6,0

µm Trong thiên nhiên chúng có thể tồn tại riêng từng tế bào, cũng có thể tạo thànhchuỗi tế bào, chúng có khả năng lên men được glucose, fructose, galactose, mannose,maltose, lactose Loại vi khuẩn này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa

và biến dưỡng của con người :

Ổn định ở nhiệt độ phòng, tăng sinh rất nhanh trong ruột

Quá trình lên men tạo L (+) acid lactic, cung cấp phức hợp vitamin B và cácenzyme tiêu hóa như protase, lipase, amylase, lactase… Chúng cũng sản xuấtbacteriocin giúp kiểm soát sự tăng trưởng vượt mức của những nhóm vi sinh vật gâythối trong ruột, duy trì sự cân bằng pH acid.

* Streptococcus faecalis (tên mới Enterococcus faecalis)

Streptococcus faecalis, có khả năng phát triển trong môi trường chứa 6,5%

NaCl, pH 9,6 và trong sữa chứa 0,1% xanh Methylen

Khử cacboxyl tyrozin, không dịch hoá gelatin

Sản xuất chủ yếu L-acid lactic

Tốc độ sinh trưởng rất nhanh, do đó áp đảo nhanh vi khuẩn gây tiêu chảy, gâybệnh

Những chủng vi khuẩn trên đều có thể chịu được nhiệt độ cũng như các tácđộng trong quá trình sản xuất thuốc, không tương tác với các thành phần bổ sungthêm trong chế phẩm như vitamin, acid amin, acid béo, đường và đặc biệt làfructooligosaccharides, là một tá dược được dùng phổ biến trong hầu hết các chếphẩm probiotic

2.7.1.3 Một số cơ chế chuyển hóa trong vi khuẩn probiotics LAB

acidophilus Giảm sản xuất axitamin 55,117,118

Gà Lactobacillus sp. Tăng amylolytic

Heo Lactobacillus sp. Cải thiện B-glucan

thủy phân

121Heo Lactobacillus sp Tăng cường hoạt

động của enzym 123

Bacillus là một chi của gram dương hình que, thuộc ngnh Firmicutes, hiếu

khí bắt buộc hoặc kị khí không bắt buộc, catalase dương tính Bacillus có hình dạng

giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que này có bào tử trong hình oval cókhuynh hướng phình ra ở đầu Tập đoàn của giống vi sinh vật này rất lớn, có hình

dạng bất định Ngoài ra bacillus có thể sản xuất cấu trúc đa bào và màng sinh học

nên có thể bám dính vào màng nhày, kết dính tốt trong đường ruột, có khả năng sốngsót qua 36 ngày trong đường ruột vật chủ Vì vậy được coi là probiotic

Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ biến

trong đất, đặc biệt trong cỏ khô nên còn có tên gọi khác là trực khuẩn cỏ khô Lànhững vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3- 5) × 0.6µm, nhiều khi tế bào nốivới nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng riêng rẽ Khuẩn lạc khô,không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặtthạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trương thạch

Nhiệt độ thích hợp cho B subtilis sinh trưởng là 30- 50oC, thường nuôi cấy ở

370C Bào tử hình bầu dục, kích thước 0.6-0.9µm, phân bố lệch tâm, gần tâm nhưngkhông chính tâm Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm Đã có những chứng

cứ về việc duy trì sức sống của bào tử B.subtilis trong 200-300 năm.

Vi khuẩn B.subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng chịu

đựng được điều kiện thời tiết khắc nhiệt, vì màng nhày có thể dự trữ thức ăn và bảo

vệ vi khuẩn tránh tổn thương khi khô hạn Màng nhày có thể quan sát được khi

nhuộm tiêu bản, qua kính hiển vi thấy màng nhày không mà, trong suốt còn tế bo vikhuẩn bắt màu nâu đỏ trn nền tiu bản xanh hoặc đen.

Hình 2.9 Tế bào Bacillus subtilis

B.subtilis có khả năng sinh một số enzym như amylase, protease kiềm có giá

trị cao, đặc biệt có khả năng sinh tổng hợp riboflavin (tiền vitamin B2) Vì vậy

B.subtillis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp

* Bacillus licheniformis

Bacillus licheniformis là một loại vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất,được tìm thấy trên lông chim, đặc biệt là ngực và lông, và hầu hết là các loài chim ởmặt đất và các loài như vịt Là một vi khuẩn gram dương, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu

là khoảng 500C, mặc dù có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn Nhiệt độ tối ưu tiết enzyme

là 370C Tồn tại ở dạng bào tử để chống lại sự khắc nghiệt xung quanh, ở trạng tháithực vật khi có điều kiện tốt

Hình 2.10 Tế bào Bacillus licheniformis

* Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens được phát hiện bởi nhà khoa học Nhật Bản tên là

Fukumoto Bacillus amyloliquefaciens sản xuất ra enzyme amylase và lipase Giữ thập niên 1940 và 1980 Bacteriologists tranh cải về việc B amyloliquefaciens là loài riêng biệt hay là một phân loài của B subtilis Đến năm 1987 một nhóm nhà khoa

học gồm Fergus G Priest của Heriot – Watt University thành lập nó như là một loài

Hình 2.11 Tế bào Bacillus amyloliquefaciens

*Bacillus megaterium

Bacillus megaterium là vi khuẩn gram dương, hình que là một trong những

eubacteria lớn nhất được tìm thấy trong đất Có thể tồn tại ở điều kiện khắc nghiệt dobào tử tạo ra

Bacillus megaterium dùng sản xuất penicillin, các enzyme sửa đổi

corticosteroid và một số acid amin dehydrogenas

2.7.2.3 Một số sản phẩm probiotic thương mại chứa bào tử Bacillus.ssp

Tên sản

AlCare Swine (Heo) Alpharma Inc.,

Melbourne, Australia

www.alpharma.com.au/a lcare.htm

phẩm còn có Lactobacillus, Saccharomyces.ssp

UK

http://www.provita.co.uk

Bacillus licheniformis:

1.6 ×109CFU/g và Bacillus subtilis: 1.6 ×109CFU/g

http://www.chbiosystems com

Hỗn hợp gồm

Bacillus licheniformis và Bacillus subtilis

1.6 ×109CFU/g

Esporafe

ed Plus Swine (Heo) Norel, S.A Madrid, Spain Bacillus cereu:1 ×109

Paciflor Calves, ntervet International B.V Bacillus cereus

CIP5832b(ATCC 14893)

http://www.asahi-Bacillus cereus var toyoi

and Advanced Microbial Systems, Shakopee,

MN, USA

Hỗn hợp: Bacillu megaterium, Bacillus licheniformis,

Paenibacillus polymyxa và

2 chủng Bacillus subtilis

2.7.3 Nấm men Saccharomyces:

Sự hiện diện của nấm men trong bia lần đầu tiên được đề xuất trong năm

1680, mặc dù các chi này được không có tên Saccharomyces cho đến năm 1837 năm

1876 Louis Pasteur chứng minh sự than gia của nấm men vào quá trình lên men, năm

1888, Hansen phân lập nấm men bia

Nấm men saccharomyces được tìm thấy trong cc sản phẩm ln men v trái cây lên men, saccharomyces sử dụng nguồn đường để lên men.

Quan sát trên kính hiển vi tế bào nấm men có hình cầu hay hình trứng, kíchthức 5-14 µm, sinh sản bằng cách nảy chồi hay bào tử

Họ: saccharomycetaceae

2.7.3.1 Một số lồi nấm men l probiotics

Saccharomyces boulardii, saccharomyces cerevisae, là những loài nấm men

này có khả năng sống tốt và tăng trưởng tốt ở pH 4-4.5 (pH trong đường ruột), pháttriển tối ưu ở 370C, được coi là thần dược trong việc đều trị bệnh tiêu chảy, nấm menkhi vào đường ruột được cư dân địa phương chấp nhận Đó là sự hiện diện của cácenzyme, muối mật, axit hữu cơ và các biến thể của Ph và nhiệt độ Nên được coi làứng cử viên của probiotic

Hình 2.12 Tế bào nấm men Saccharomyces boulardii v Saccharomyces cerevisae 2.7.3.2 Mô hình cơ chế hành động của Saccharomyces Boulardii chống Vibrio

cholerae, Clostridium difficile và Escherichia coli gây bệnh nhiễm trùng (2007,

Blackwell Publishing ltd.)

Hình a: Saccharomyces boulardii tạo ra một 120 kDa protein có tác động ảnh

hưởng đến niêm mạc ruột và ức chế độc tố bệnh tả (CT), kích thích adenylate cyclase

(AC) và tiết clorua Saccharomyces boulardii cũng liên kết với CT

Hình b: Saccharomyces boulardii hành vi về đường ruột niêm mạc và giảm

phosphoryl hóa của MLC liên quan đến sự kiểm soát của các mối nối chặt chẽ cũngnhư kích hoạt của MAPK và NF-JB liên quan đến sự tổng hợp của cytokineproinflammatory IL-8 và TNF-a

Hình c: Saccharomyces boulardie tiết ra một protease (> 50 kDa) có thể làm

tan Clostridium difficile độc tố A và B và protein (<10 kDa) là ức chế con đường tín

hiệu-cách liên quan trong tổng hợp-8 IL Saccharomyces boulardii kích thích sản

xuất thuốc kháng độc A IgA

Hình 2.13: Sự tiếp súc giữa Saccharomyces boulardii và Salmonella

typhimurium.(2007, Blackwell Publishing ltd.)

2.8 Đặc điểm của chế phẩm Probiotic trong chăn nuôi

Chế phẩm probiotic, tổng hợp các hợp chất hữu cơ như: acid lactid, acidacetic ,và đặc biệt là becteriocin kháng vi sinh vật gây bệnh, có khả năng sống sóttrong dạ dày, có khả năng kết dính cao trong đường ruột và chịu được acid mật

Là một sản phẩm thức ăn chăn nuôi có bổ sung các vi sinh vật có ích chođường tiêu hóa của vật nuôi, kích thích tiêu hóa, cải thiện hệ vi sinh vật làm cân bằnglượng vi sinh vật có ích trong đường do bị thiếu hụt sau một thời gian dùng khángsinh, giảm lượng kháng sinh tồn dư trong cơ thể vật nuôi, làm giảm bệnh tiêu chảy,giảm chi phí dùng thuốc kháng sinh, tăng hệ số chuyển hóa thức ăn, (bằng cch bổsung enzyme hỗ trợ tiu hĩa như enzyme cellulase, enzyme proteaza, enzymeamylaza )

Chính vì vậy trong chăn nuôi thường bổ sung thêm các vi sinh vật tốt chođường tiêu hóa vào chế phẩm probiotic để có được công thức thức ăn bổ sung hoànhảo hơn

2.9 Tìm hiểu một số đề tài nghiên cứu về probiotic trong chăn nuôi

2.9.1 Một số đề tài nghiên cứu trên thế giới:

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic bổ sung vào thức ăn chănnuôi đang được phát triển mạnh mẽ trên thế giới do những hiệu qủa to lớn của nótrong việc tăng năng xuất vật nuôi, nâng cao hiệu qủa sử dụng thức ăn, hạ giá thànhsản xuất và bảo đảm vệ sinh an toàn sản phẩm Những lòai vi khuẩn, nấm

men như: Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus platarum, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Treptococcus faecium, Saccharomyce boulardii, Sacchromyces serevisiae Đã được phân lập, nuôi cấy và bào chế dưới dạng chế phẩm vi sinh,

probiotic, prebiotic bổ sung vào thức ăn nhằm cải thiện khả năng năng tiêu hóa, hấpthu; nâng cao sức đề kháng và thay thế sử dụng kháng sinh, hóa dược trong thức ănchăn nuôi (Simon, 2001)

Nghiên cứu của Luc Shiming (1980) cho thấy chế phẩm Lactobacillus được

phân lập từ gà con khỏe mạnh có tác dụng phòng và trị bệnh pullorum (tiêu chảy cấptính và ác tính hàng loạt ở gà)

Reverdin (1996) cho rằng Saccharomyces cerevisiae có tác dụng làm nâng

cao chất béo trong sữa dê Nghiên cứu khác cho thấy sử dụng chế phẩm probiotictrên gà đẻ làm tăng sản lượng trứng 5% (Mohal et al., 1995)

Cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển biến thức ăn, trọng lượng trứng vàchất lượng lòng đỏ (Tortuero và Fernandez, 1995)

Nghiên cứu của Tortuero (1989) cho thấy bổ sung hỗn hợp L.acidophilus và

S faecium cho gà thịt giai đọan 5-8 tuần đã cải thiện 2% tăng trọng và hiệu quả sử

dụng thức ăn

Nghiên cứu của Kyriakis (1999) sử dụng Bacillus licheniformis với liều 107bào tử/g, có tác dụng làm giảm tỷ lệ tiêu chảy, cải thiện tăng trọng và tiêu tốn thức ăncho heo

Nghiên cứu Lema (2001) sử dụng các loài Lactobacillus acidophilus; Streptocccus faecium ; phối hợp giữa Lactobacillus acidophilus với Streptocccus faecium, Lactobacillus casei, L fermentum và L plantarum trộn trong thức ăn cho

cừu trong thời gian 7 tuần với liều 6x106 CFU/kg (CFU: Colony forming unit) thức

Kết quả cho thấy hỗn hợp Lactobacillus cidophilus với Streptocccus faecium, Lactobacillus casei, L.fermentum và L plantarum đã làm giảm sự bài thải E.coli

trong phân

2.9.2 Tìm hiểu một số đề tài nghiên cứu trong nước

2.9.2.1.Đề tài nghiên cứu phân lập đặc điểm vi khuẩn lactic ứng dụng làm chế phẩm vi sinh Khoa sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên ĐHQGHN

Đề tài phân lập những vi khuẩn lactic trong nem chua tại Hà Nội

- Sử dụng các phương pháp nghiên cứu vsv thông dụng trong việc phân lập vàxác định các đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic

- Đặc điểm, hình dạng của 10 chủng vk lactic tuyển chọn ( trình bày tại bảng

1, phụ lục)

Tuyển chọn vsv có tiềm năng probiotics theo các tiêu chuẩn

- Định lượng axit lactic (theo phương pháp đo độ 0T, trình bày tại bảng 2,hình 1, phụ lục)

- Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật probiotic (bằng phươngpháp khuếch tn trn giếng thạch, trình by tại bảng 3, hình 2 trong phụ lục)

- Hoạt tính enzyme phân giải protein (bằng phương pháp khuếch tn trn giếngthạch, kết quả trình by tại bảng 4, hình 3, phụ lục)

2.9.2.2 Đề tài phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ.tpHCM

Đề tài phân lập, tuyển chọn những vi khuẩn lên men lactic từ: sữa chua, dưa

cà muối và các chế phẩm probiotic thương mại

- Phân lập, định danh vi khuẩn lactic (theo phương pháp cổ điển Bergey,sManual, 1957) Sơ đồ phân lập, định danh (trình bày hình 7 trong phụ lục)

- Một số hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi ×100 và ×1000 đề tài đã phânlập được (Trình bày tại bảng 5, phụ lục)

Tuyển chọn vsv có tiềm năng probiotic theo tiu chuẩn

- Kháng vsv chỉ thị E coli, Salmonella spp., Pseudomonas spp (phương pháp

khuếch tán trên bề mặt thạch, qua giếng thạch và khả năng đối kháng bằng phươngpháp Tubidimetric assay (đo độ đục)) Trình bày tại hình 4, hình 5, phụ lục

- Khng acid v muối mật

Quy trình Sản xuất chế phẩm probiotic, (hình 6, phụ lục)

2.9.2.3 Đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probiotic sử dụng trong thức ăn chăn nuôi Viện KHKT Nông Nghiệp Miền Nam 121 Nguyễn Bỉnh Khieâm, Q1,TPHCM

Đề tài phân lập, tuyển chọn các giống Bacillus, Lactobacillus,Saccharomyces, có tiềm năng probiotic từ 2 nguồn:

- Phân lập từ các chế phẩm probiotic thương mại của các công ty trong vàngoài nước

Phân lập từ các thực phẩm lên men như: sữa chua, dưa cà muối, men chua

- Phân lập theo các phương pháp nghiên cứu vsv thông dụng trong việc phânlập và xác định các đặc điểm sinh học của vsv

 Tuyển chọn các vi sinh vật tiềm năng probiotics trong chăn nuôi theo cáctiêu chí như:

- Khả năng sinh axit lactic

- Khả năng kháng vsv chỉ thị

- Khả năng sinh enzyme phân giải, (hỗ trợ tiêu hóa)

- khả năng sống sót trong dịch dạ dày và muối mật

- Khả năng lên men

Quy trình Sản xuất chế phẩm probiotic, (trình by tại hình 3.8)

Phối chế sản phẩm probiotic

Đã sản xuất được 20 lít chế phẩm dạng lỏng, 5 kg sản phẩm dạng bột

Thành phần sản phẩm:

Dạng lỏng:

Lactobacillus Plantarum, L Brevis : 109CFU/ml

Bacillus Amyloliquefaciens, B Megaterium :108CFU/ml

Saccharomyces cerevisae, S boulardii : 109CFU/ml

Enzyme Amylase : 9 UI/ml

Enzyme Protease : 9,7 UI/ml

Dạng bột:

Lactobacillus Plantarum, L brevis : 8.5 x 108cfu/g

Bacillus amyloliquefaciens, B megaterium :8.2 x 107CFU/g

Ứng dụng chế phẩm: Dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, tăng hiệu quảchuyển hóa thức ăn, giảm lượng kháng sinh tồn dư, chống lại các bệnh về đường ruộtcho vật nuôi

2.9.3 Một số đề tài nghiên cứu trong nước đã được công bố

1 Lê thị Châu Vi khuẩn lactics củ xanh thức

ăn cho bò sữa

Tạp chí khoa học

và công nghệ 4.1992

2 Lê thị Châu Sacharomyces ssp. Thức ăn cho bị Tạp chí khoa học

số 5 1993

3 Lê Thị Phượng Bổ sung paciflor

and pacicoli Ngừa tiêu chảyở heo nái LVTNCNTY,ĐHNL.khoa

TPHCM

chống tiu chảycho heo

ĐH Nông Ngiệp

1 Hà Nội

5 Nguyễn Duy Hoan,

Trần Thị Kim Oanh Sacharomyces ssp Aspergillus ssp

Lactobacillu ssp.

Chế phẩm EMtrong chănnuôi gà thảvườn

Tạp chí khoa học

kỹ thuật thú yViệt Nam 9 trang58-62

7 Phan Ngọc kính Sacharomyces spp

Aspergillus spp

Lactobacillus spp.

Chế phẩm EMtrong chănnuôi lợn

Chế phẩm sinhhọc phòng trịbệnh tiêu chảycho lợn

Tạp chí khoa họcthú y 9 trang 54-56

9 Khắc hiếu, Trương

Quang, Văn Kỳ Saccharomyces cerevisae,

Lactobacillus acidophilus và Streptococcus faecium

Chế phẩmEM1 Tácdụng khángkhuẩn

Tạp chí khoa học

kỹ thuật thú y 9trang 50-53