Thiết bị, tủ sấy trong phòng thí nghiệm, đựng chế phẩm lên những khay nhỏ 20cm
Nhiệt độ sấy từ: 35 – 400C Thời gian sấy: từ 2-3 ngày
Mỗi khay cho khoảng 500(g) chế phẩm
3.5.2.4. Phơi khô ngoài không khí
- Phơi trong những khay nhỏ 20 cm - Nhiệt độ phòng: 28-300C
- Thời gian phơi: 4-5 ngày - Một khay 500 (g) chế phẩm
3.5.3. Khảo sát tìm chất mang thích hợp
- CM I: Hỗn hợp cam gạo, trấu (tỉ lệ 1:1) - CM II: Bã khoai mỳ
- CM III: Khô đậu nành
- CM IV: Hỗn hợp cám gạo, trấu, bã khoai mỳ (1:1:1)
Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ vi sinh vật, họat lực các enzyme có trong sản phẩm ở những điều kiện sấy khác nhau, sau thời gian bảo quản, độ ẩm,...
3.5.4. Các chế độ bảo quản sản phẩm
Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện bảo quản tới chất lượng sản phẩm
thí nghiệm với bao bì sản phẩm (2 lọai: polyethelene, bao tráng nhôm); nhiệt độ bảo quản (2 mức độ: 40C; nhiệt độ phòng) và thời gian bảo quản (4 mức độ: 15; 30; 60; 90; ngày)
Các chỉ tiêu theo dõi: Mật độ vi sinh vật, họat lực các enzyme có trong sản phẩm ở những điều kiện sấy khác nhau. Mức độ vấy nhiễm các vi sinh vật có hại (E.
Coli; Salmonella), nấm mốc (aflatoxin) sau các thời gian bảo quản.
3.5.5. Khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase thuộc chủng nấm mốc
Asperigllus: (Asperigllus niger, Aspergillus oryzae) ở những điều kiện tốt nhất 3.5.5.1. Môi trường lên men cho Asperigllus niger, Aspergillus oryzae (thu chế
phẩm enzyme)
Môi trường bã khoai mỳ 41%
Cám gạo 30%
Trấu 20%
Bột bắp 8%
Khoáng 1%.
3.5.5.2. Bố trí thí nghiệm:
Bố trí thí nghiệm: Kiểu thí nghiệm: thí nghiệm 1 yếu tố Yếu tố : nồng độ CMC ( 0,5%, 1%, 1,5%)
Tổng đơn vị thí nghiệm: A x 3 x 3 = 9A (đĩa) (A: hai chủng nấm mốc thí nghiệm) - Thuốc thử: Glygol KI 2 g Iodine tinh thể 1 g Nước cất 300 ml 3.5.5.3. Cách tiến hành:
Tạo dịch huyền phù bào tử nấm mốc
Cho 10 ml nước cất vô trùng vào ống giống, dùng que cấy đã vô trùng để tách bào tử cho vào nước cất tạo dịch huyền phù. Sau đó đổ dịch huyền phù vào trong ống nghiệm vô trùng và pha loãng đến những mức xác định để có được lượng tế bào đồng nhất trước khi thí nghiệm.
Định lượng bào tử nấm mốc của dịch huyền phù
Xác định lượng tế bào đồng nhất bằng phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu. Số tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng công thức sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số tế bào/ ml = a × 4000 × 103 ×10n/ b Trong đó:
a: số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô con) b: số ô con trong 5 ô lớn (80 ô con)
103: là chuyển từ mm3 sang ml (1000 mm3 = 1ml) n: số lần pha loãng mẫu
Sau khi đã xác định được lượng bào tử đồng nhất ở mỗi chủng ta sẽ lắc đều dịch huyền phù nấm mốc, dùng pipet và đầu típ vô trùng hút 20µl dịch bào tử cho vào giữa đĩa petri có chứa môi trường Czapek cơ bản với các nồng độ CMC khác nhau. Làm lần lượt như vậy cho tất cả các chủng.( hình 3.1), sau đó sẽ cho vào tủ ấm, ủ ở 280C/ 3 ngày. Quan sát, đánh giá khả năng phân giải cellulose của từng chủng.
Hình 3.1. Phương pháp lấy mẫu cho vào giếng thạch
- Chỉ tiêu và phương pháp theo dõi:
Sử dụng thuốc thử Iod để đánh giá vòng phân giải cellulose
Nhỏ thuốc thử Iod vào trong mỗi đĩa mẫu sau đó dùng thước để đo đường kính phân giải cellulose của mỗi mẫu và ghi nhận lại kết quả
Đường kính vòng phân giải cellulose (mm)
3.5.6. Lên men thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vo chế phẩm probiotic
3.5.6.1. Phương pháplên men:
Sử dụng phương pháp lên men bề mặt để sản xuất enzyme protease bổ sung vào chế phẩm probiotic.
3.5.6.2. Quy trình nhân giống:
* Quy trình nhân giống Aspergillus ssp.
Môi trường Czapek thạch nghiêng
Ống mốc cấy chuyển
Nuôi cấy 30-320C trong 5-6 ngày
Nước cất Giống trong ống thạch nghiêng
Trộn đều bào tử
Cho vào môi trường czapek lỏng trong bình tam giác
3.5.6.3. Quy trình lên men thu chế phẩm enzym cellulase
Nguyên liệu Xử lí nguyên liệu Hấp khử trùng Ủ trên khay Làm nguội
Bóp tơi Trộn giống vsv
Cho vào thau cho nước cất vào
Cồn hay sunlfat amon Lọc
Thu kết tủa enzyme Sấy
Enzyme bán tinh khiết
3.5.6.4. Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu: Nguồn tinh bột rẽ tiền như: cám gạo, ngô, bắp, bã khoai mỳ,...hàm lượng tinh bột phải đạt trên 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp chất không quá 0.05%. Nguyên liệu xốp giúp sợi nấm phát triển tốt đa để sinh hoạt lực enzyme cao nhất
Hấp thanh trùng: nguyên liệu có nhiều bào tử vsv khác nên phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vsv ngoại lai, thanh trùng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Trước khi thanh trùng dùng HCL hay H2SO4 để điền chỉnh pH môi trường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi thanh trùng làm nguội bắt đầu cấy giống. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống vào, trộn đều, tỉ lệ cấy giống thường là 0,5-20% so với khối lượng của môi trường.
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống xong, môi trường được trải đều ra các khay. Để trong phòng ủ có nhiệt độ và độ ẩm không khí thích hợp cho sợi nấm phát triển. Nhiệt độ thích hợp là 28-320C.
Thu chế phẩm enzyme: sau khi nuôi trong thời gian 5-6 ngày. Ta cho vào bì và cho nước cất vào, bóp cho tơi, tiếp theo lọc cho vào thau, cho cồn hay sunlfat amon vào để kết tủa enzyme. Sau đó sấy thu dịch enzyme thô
Trong khi tiến hành kết tủa, ta phải làm lạnh dịch enzym thô xuống 4-70C, để tránh làm mất hoạt tính của enzym. Khi đổ dung dich kết tủa thì phải đổ một cách từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
3.6. Kết quả và thảo luận
3.6.1. Sản xuất thử probiotic vi sinh
Tìm thời gian ln men thích hợp
Lên men các vi sinh vật Saccharomyces, Bacillus, Lactobacillus, lấy mẫu sau 24, 48, 56 và 72 h, đo sinh khối và vòng kháng vi sinh vật chỉ thị (Shigella spp.). Thử nghiệm hoạt tính kháng vsv trong môi trường lên men tìm thời gian lên men thích hợp.( kết quả trình by bảng 3.1)
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vsv trong môi trường lên men
Chủng Sốvsv(cfu/ml)và hoạtlượng tính sinh học
Thời gian lên men (giờ)
24 48 56 72 Saccharomyces Số lượng vsv 5.8× 10 7 8 ×108 7.8 ×108 7.6 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm) 4 10 9 8 Bacillus Số lượng vsv 4.9 ×108 7.8 ×109 9.9 ×108 8 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm 6 18 12 10 Lactobacillus Số lượng vsv 6.8 ×107 9.5 ×109 8× 108 7.5 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm 9 18 20 19
- Bảng 3.1. cho ta thấy nồng độ vsv giảm dần theo thời gian lên men và thời gian lên men trong 48 giờ là tốt nhất đối với các chủng vsv, tại bảng kết quả cho thấy với 56 giờ thì khả năng kháng shigella của chủng vk Lactobacillus là cao nhất . Thử nghiệm các phương pháp sấy, xác định tỉ lệ sống sót
Trong sấy phun giai đoan dầu là giai đoạn nước bay hơi, tiếp theo là rơi trong buồng sấy, các yếu tố như: nhiệt độ khí ra vào, thời gian lưu và đốc độ bơm thụ động là các yếu tố ảnh hưởng tới tỉ lệ sống sót của vi khuẩn probiotics. Nhiệt độ vi khuẩn khi vào buồng sấy được coi là thông số quyết định tỉ lệ sấy phun. Nhiệt độ < 640C, nhiệt độ này tổn thương màng tế bào, khi vượt quá 650C thì xảy ra biến tính protein và ribosome gây chết tế bào.
Trong sấy đông khô tổn thương tế bào lại do sự đông đá. Sấy đông khô là quá trình làm mất nước đã được làm lạnh đông. Trong quá trình làm lạnh đông làm tăng nồng độ chất hòa tan ngoại bào, vì vậy nước di chuyển từ trong tế bào ra ngoài. Tốc độ lạnh đông ( 0C/phút) là yếu tố quyết định thu hồi sản phẩm. nếu tốc độ thấp thì nước bên trong nội bào không đủ thời gian thoát ra bên ngoài, làm lạnh quá nhanh mng phospholipid co thắt hạn chế nước thoát ra, nồng độ môi trường tăng cao, áp xuất thẩm thấu cũng tăng gây stress cho tế bào và gây tổn thương cho ribosomes.
Bảng 3.2 trình by tỉ lệ sống sĩt của vi sinh vật probiotic sau 2 qu trình sấy phun và đông khô. Tỉ lệ sống sĩt của hỗn hợp vi sinh vật là 75% đối với sấy phun và 80% đối với đông khô.
Bảng 3.2. Tỉ lệ sống sĩt của vsv qua 2 qu trình sấy
Quá trình sấy Sấy phun Đông khô
Thông số sấy
Nhiệt độ đầu vào, ra 1450C và 55 0C
Kích thước hạt: 0.1 – 0.5µm Hệ số thu hồi chất rắn: 60% Năng xuất 2 lít/giờ
Tốc độ đông khô đá: 0.8 0C/ phút
Nhiệt độ đông: - 400C Bơm chân không 1,95×10- 3mbar
Năng xuất 2 lít/giờ Thành phần chất bảo
vệ (%) Sữa gầy 20% + lactose 2% +cao nấm men 0.05% + NaCl 0.01%
Sữa gầy 20% + lactose 10% + sucrose 10% + gelatin 1%
Nồng độ tế bào trước
khi sấy cfu/ml 6×10
9 6×109 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ tế bào sau
khi sấy cfu/ml 4.5×10
9 4.8×109
Tỉ lệ sống sót % 75% 80%
Sấy bằng nhiệt thì cũng gây tổn thương cho tế bào nhưng tỷ lệ tổn thương có thể ít hơn, nhiệt độ sấy từ 35 – 400C. Dùng phương pháp này thì không tốn chi phí về thiế bị như hai phương pháp trên. Nhưng sẽ dễ bị tạp nhiễm bởi môi trường xung quanh.
Chế độ phơi ngoài nhiệt độ bình thường thì không bị ảnh hưởng do nhiệt độ là phương pháp rẽ tiền, không tốn trang thiết bị …Nhưng khả năng bị tạp nhiễm cc vsv khc bởi môi trường xung quanh rất dễ dng.
Dù sấy bằng phương pháp nào thì tế bào vẫn bị tỗn thương do mất nước và hay đổi cấu trúc không gian protein màng.
Tìm chất mang, chế độ phối trộn v khảo st thời gian bảo quản
Sau khi sấy, hỗn hợp vi sinh probiotic được trộn với cc thnh phần chất mang khc nhau. Tỉ lệ sống sĩt sau 15, 30, 60, 90 ngy bảo quản được theo di (bảng 3.3).
Bảng 3.3. kết quả khảo sát chất mang phối trộn và thời gian bảo quản sau khi sấy
Chất mang Nồng độ tế bào ban đầu
Thời gian bảo quản sau khi sấy đông khô (ngày)
15 30 60 90
CM I 6 ×109 4.5 ×109 4.0 ×109 8.2×108 7.8 ×108
CM II 6 ×109 5.0 ×109 4.5 ×109 2.3 ×109 2.0 ×109
CM III 6 ×109 4.5 ×109 3.2 ×109 2.0 ×109 1.0 ×109
CM IV 6 ×109 4.8 ×109 4.0 ×109 7.5 ×108 6.5 ×108
Nhìn vào kết quả ta thấy sau thời gian bảo quản lượng sinh khối của vsv giảm dần, cụ thể sự thay đổi về nồng độ của vsv trong các môi trường và sau thời gian bảo quản 60 và 90 ngày so với ban đầu như sau:
CM I: 15% - 13% CM II: 75% - 35% CM III: 35% -16 CM IV: 13% - 11%
Kết quả cho thấy môi chất mang II và chất mang III không giảm nhiều so với 2 chất mang I và IV. Vậy nên chọn chất mang II và III là thích hợp. Thời gian bảo quản khoảng 60 ngày là thích hợp vì càng về sau nồng độ tế bào càng giảm.
Bao bì bảo quản sản phẩm
Sản phẩm đựơc nghiên cứu bảo quản trong hai lọai bao bì polyethylene v bao trng nhơm. Tỉ lệ sống sĩt sau thời gian bảo quản được trình by trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khảo sát các chế độ bảo quản chế phẩm
Chế độ bảo quản
Thời gian bảo quản (ngày)
Polyethelene 158.5 ×108 308.2 ×108 607.5 ×108 906.7 ×108 Bao tráng
nhôm
8.2 ×108 8. ×108 7.6 ×108 7.2 ×108
Với bao bì Polyethelene, tỉ lệ sống sĩt cịn 78% sau 90 ngy so với 15 ngày, trong khi đó khi sử dụng bao tráng nhôm, tỉ lệ này tương ứng đạt 85%.
Bảo quản trong bao tráng nhôm cho tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic cao hơn so với bao bì Polyethelene., tuy nhin khc biệt ny khơng cĩ ý nghĩa thống k, nn cả 2 loại bao bì trên đều thích hợp để bảo quản vi sinh vật probiotic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.6.2. Sản xuất thử enzyme cellulase hỗ trợ tiêu hóa
Chọn chủng thích hợp: Từ 2 chủng ban đầu chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm thăm dò và rút ra được khả năng phân giải cellulose của 2 chủng nấm mốc
Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (bảng 3.5, hình 3.2) và (bảng 3.5, hình 3.3)
Những chủng nấm mốc nói trên đều được phân lập và tuyển chọn từ những nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc trong nước, rất sẵn có và rẻ tiền. Đồng thời có tính ổn định tốt, khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp enzyme tốt.
Bảng 3.5.Chủng A1: (Aspergillus niger)
Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 33 34,33 1 35 5735 37 35,67
Hình 3.2. Vòng phân giải của chủng A1: (Aspergillus niger)
Bảng 3.6. Chủng A2: (Aspergillus oryzae)
Hình 3.3. Vòng phân giải của Chủng A2: (Aspergillus oryzae)
Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 39 36 1 34 30 32 32 1,5 30 29 29 29,33
Lên men thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vo chế phẩm probiotic
Phương pháp lên men bề mặt đã đựơc áp dụng để sản xuất enzyme protease bổ sung vào chế phẩm probiotics. Nhân giống sản xuất bằng lên men chìm sử dụng môi trường Czapek. Lên men bề mặt sản xuất enzyme sử dụng nguyên liệu rẻ tiền là bã khoai mỳ bổ sung khoáng Czapek. Enzyme được thu hồi qua phương pháp kết tủa bằng cồn hoặc sunfat amôn, sau đó sấy ở nhiệt độ 35-40oC, 2 đến 3 ngày (xem vật liệu và phương pháp).
Bảng 3.7. Tĩm tắt qu trình ln enzyme thu chế phẩm enzyme cellulase Chuẩn bị và tiệt trùng môi
trường nuôi cấy:
Môi trường lên men bã khoai mỳ sau khi hấp thanh trùng
Trộn giống sau khi làm nguội môi trường.
tỉ lệ giống: 0,5-20%
Lên men bề mặt:
Nhiệt độ thích hợp là 28-320C. thời gian ln men 5-6 ngày
Canh trường lên men trộn với nước cất để trích ly enzyme
3.6.3. Hoàn thành quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Hình 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Phối trộn với chất mang (bột đậu nành, cám gạo, trấu, bã khoai mỳ). xử lí nhiệt, độ ẩm 15%
Đồng hóa hỗn hợp dịch giống với chất bảo quản nhiệt
Đồng hĩa huyền ph với chất bảo quản nhiệt
Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Lên men chìm, 16h/370C
Lên men riêng rẽ từng giống Ln men ring rẽ từng giống
Giống
Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL
0.01% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sấy ( sấy phun, đông khô, sấy nhiệt …)
Đóng gói Sản phẩm, bảo quản 100C
3.6.4. Chế phẩm probiotic dưới dạng bột đông khô và dạng lỏng
Đã sản xuất được 20 lít chế phẩm dạng lỏng, 5 kg sản phẩm dạng bột
Thành phần sản phẩm:
Dạng lỏng:
Lactobacillus plantarum, L. brevis : 109CFU/ml
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :108CFU/ml
Saccharomyces cerevisae, S. boulardii : 109CFU/ml
Amylase : 9 UI/ml
Protease : 9,7 UI/ml
Cellulase : 1841 UI/ml
Hình 3.9. Chế phẩm probiotic dạng lỏng Dạng bột Lactobacillus
plantarum, L. brevis : 8.5 x 108cfu/g
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :8.2 x 107CFU/g
CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận:
Sau quá trình tìm hiểu và thực nghiệm về chế phẩm probiotic trong chăn nuôi. Em đã tổng kết cho mình được những kiến thức, hiểu hơn về chế phẩm này và nhận thấy rằng:
chăn nuôi là một chế phẩm chủ yếu chứa vi sinh vật sống có họat tính kháng vi sinh gây bệnh đường ruột và tăng cường miễn dịch nhằm tăng hiệu quả trong chăn nuôi gia súc gia cầm.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam có nhiều nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn được những chủng vi sinh vật hoạt tính probiotics. Trong khi chế phẩm probiotic chăn nuôi đã được thương mại hóa rộng rãi ở nứơc ngòai và xuất hiện trên thị trường Việt Nam, thì nghiên cứu trong nước đang ở giai đọạn hoàn thiệt quy trình sản xuất probiotic quy mô phòng thí nghiệm, xác định điều kiện lên men tối ưu tăng