Hình 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Phối trộn với chất mang (bột đậu nành, cám gạo, trấu, bã khoai mỳ). xử lí nhiệt, độ ẩm 15%
Đồng hóa hỗn hợp dịch giống với chất bảo quản nhiệt
Đồng hĩa huyền ph với chất bảo quản nhiệt
Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Lên men chìm, 16h/370C
Lên men riêng rẽ từng giống Ln men ring rẽ từng giống
Giống
Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL
0.01%
Sấy ( sấy phun, đông khô, sấy nhiệt …)
Đóng gói Sản phẩm, bảo quản 100C
3.6.4. Chế phẩm probiotic dưới dạng bột đông khô và dạng lỏng
Đã sản xuất được 20 lít chế phẩm dạng lỏng, 5 kg sản phẩm dạng bột
Thành phần sản phẩm:
Dạng lỏng:
Lactobacillus plantarum, L. brevis : 109CFU/ml
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :108CFU/ml
Saccharomyces cerevisae, S. boulardii : 109CFU/ml
Amylase : 9 UI/ml
Protease : 9,7 UI/ml
Cellulase : 1841 UI/ml
Hình 3.9. Chế phẩm probiotic dạng lỏng Dạng bột Lactobacillus
plantarum, L. brevis : 8.5 x 108cfu/g
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :8.2 x 107CFU/g
CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận:
Sau quá trình tìm hiểu và thực nghiệm về chế phẩm probiotic trong chăn nuôi. Em đã tổng kết cho mình được những kiến thức, hiểu hơn về chế phẩm này và nhận thấy rằng:
chăn nuôi là một chế phẩm chủ yếu chứa vi sinh vật sống có họat tính kháng vi sinh gây bệnh đường ruột và tăng cường miễn dịch nhằm tăng hiệu quả trong chăn nuôi gia súc gia cầm.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam có nhiều nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn được những chủng vi sinh vật hoạt tính probiotics. Trong khi chế phẩm probiotic chăn nuôi đã được thương mại hóa rộng rãi ở nứơc ngòai và xuất hiện trên thị trường Việt Nam, thì nghiên cứu trong nước đang ở giai đọạn hoàn thiệt quy trình sản xuất probiotic quy mô phòng thí nghiệm, xác định điều kiện lên men tối ưu tăng sinh khối và các phương pháp thu hồi sản phẩm cho tỉ lệ sống sót cao. Bên cạnh đó, sản xuất các enzyme hỗ trợ tiêu hóa cũng được chú ý nhằm phối hợp với vi sinh probiotic tạo thành chế phẩm thức ăn bổ sung vừa phòng chữa bệnh vừa tăng hiệu suất sử dụng thức ăn.
4.2.Đề nghị
Hòan thiện quy trình sản xuất chế phẩm probiotic, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và qúa trình thu hồi sản phẩm.
Thử nghiệm sản phẩm trên gia súc
Nghiên cứu các thành phần bổ sung vào chế phẩm probiotics nhằm đa dạng hóa và nâng cao hiệu quả sử dụng sản phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội
2. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội, Tạp chí khoa học, ĐHQG- Khoa tự nhiên và công nghệ 24, Hà Nội
3. Nguyễn Đức Lượng (2006), Vi sinh vật học công nghiệp, tập 1,2, XNB Đại học Quốc Gia,Tp.HCM
4. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm văn Tỵ (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội
5. Nguyễn Tiến Thắng (2009), Gíao Trình Công Nghệ Enzyme, Tp.HCM
6. Trung tâm công nghệ sinh học- ĐHQG Hà nội, báo cáo khoa học (2006), nghiên cứu tuyển chọn đánh giá các đặc tính sinh học, tạo tổ hợp các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất một số chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi, Hà Nội
7. Trường ĐH Kỹ thuật công nghệ,Tp.HCM, đề tài báo cáo khoa học cấp trường (2009), phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic
8. Viện KHKT Nông Nghiệp Miền Nam, Tp.HCM, đề tài báo cáo khoa hoc, (2006-2008), Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật có lợi sản xuất chế phẩm probiotic trong thức ăn chăn nuôi
9. Viện vi sinh vật và CNSH-ĐHQG Hà Nội, báo cáo khoa học (2008), Nghiên cứu các thông số kỹ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng và dạng bột dùng trong chăn nuôi.
Tiếng Anh
1. D. Czerucka, T. Piche, &P.Rampal, (2007) ,Review article: yeast as probiotics – Saccharomyces boulardii, Alimentary Pharmacology & Therapeutics, France 2. David J. Nisbet, Donald E. Corrier, John R. Deloach, (1995), Probiotic for control of Salmonela, United Stales Patent Number, 5,478,557
3. Elizete de F. Reque; Ashok Pandey; Sebastião G. Franco; Carlos R. Soccol,2000,Gisolation, identification and physiological study of lactobacillus fermentum LPB for usd as probiotic in chickensb, razilian Journal of Microbiology (2000) 31:303-307 ,ISSN 1517-8382
4. Marion Bernardeau, Micheline Guguen & Jean Paul Vernoux, 2006, Benefcial lactobacilli infoodand feed: long-termuse,biodiversity and proposals for specifc and realistic safetyassessments, Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, ISBIO, Universit ´ e de Caen Basse-Normandie, Caen, France 5. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, Popa Ovidiu., Câmpeanu Gheorghe, 2005 , Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used foobtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (5), pp. 403-408, May 2005, Applied Biochemistry and Biotechnology Center – Biotehnol, Bd.Marasti no. 59, sector 1, Bucharest, Romania
5. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, Popa Ovidiu., Cmpeanu Gheorghe, 2005 , Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used foobtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (5), pp. 403-408, May 2005, Applied Biochemistry and Biotechnology Center – Biotehnol, Bd.Marasti no. 59, sector 1, Bucharest, Romania
PHỤ LỤC
Đề tài nghiên cứu phân lập đặc điểm vi khuẩn lactic ứng dụng làm chế phẩm vi sinh. Khoa sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên ĐHQGHN
Bảng 1. kết quả phân lập, định danh theo phương pháp cổ điển đã tuyển chọn được 10 chủng có đặc tính sinh học.
Chủng Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc
Lo Que ngắn, xếp chuỗi Tròn, trong, nhỏ
L1 Que, chuỗi dài Tròn, trắng
L2 Que, xếp chuỗi ngắn Tròn, trắng sữa chân
N3 Que ngắn, xếp chuỗi dài Tròn, trắng sữa
N7 Que, chuỗi dài Tròn, trắng đục
N10 Que mãnh, xếp dài Tròn, nhỏ, trắng sữa
Dr1 Que, dài Tròn, trắng sữa
Dr3 Que dài, tế bào mập Tròn, trắng sữa
Dc2 Que ngắn, xếp chuỗi Tròn, đục
Dc3 Que ngắn, xếp chuỗi Tròn, trắng sữa
phương pháp tiến hành tuyển chọn chủng vsv có tiềm năng probiotic
- Khả năng sinh axit lactic: 10 chủng vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh axit lactic đ được tuyển chọn (trình by bảng 2)
- Hoạt tính ức chế vsv kiểm định( bằng phương pháp khuếch tn trn giếng thạch) Lấy lượng axit đạt cực đại trong 48 giờ tới 72 giờ, ly tâm thu dịch trong. Tiến hành phân tích hoạt tính theo phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Kết quả cho thấy khả năng ức chế vi khuẩn kiểm định, phổ kháng rộng ( kháng được cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm ) đường kính vòng phân giải cao (trên 10mm ), trong đó có 4 chủng thể hiện hoạt tính cao nhất: L0, L2, R1,Dc2 (trình by bảng 3, hình 2, phụ lục) - Hoạt tính enzyme phân giải protein
Lấy dịch trong hút 1ml cho vào giếng thạch. Sau khi ủ 48 giờ/370C. Sau đó đo vòng phân giải ( trình bày tại bảng 4, hình 3, phụ lục)
Bảng 2. khả năng sinh axit lactic của 10 chủng lựa chọn Lượng axit tạo thành ( tính theo độ oT )
Stt Chủng 24 giờ 48 giờ 72 giờ 96 giờ
1 Lo 204 244 269 258 2 L1 199 248 263 258 3 L2 193 240 249 253 4 N3 204 239 266 253 5 N7 198 240 260 232 6 N10 219 235 262 250 7 Dr1 194 251 266 255 8 Dr3 244 226 251 254 9 Dc2 157 210 267 259 10 Dc3 202 204 258 255
Hình 1: Khả năng sinh axit lactic của chủng L1 trn MT MRS Phương pháp khuếch trn giếng thạch:
Bảng 3. hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định các chủng nghiên cứu Hoạt tính ức chế ( D – d,mm)
Stt Chủng Bacillus spp. E.coli Shigella Saricina
1 Lo 21 20 25 22 2 L1 21 17 26 23 3 L2 20 18 25 29 4 N3 17 17 25 20 5 N7 18 15 26 22 6 N10 17 16 25 21 7 Dr1 20 18 26 21
8 Dr3 19 17 25.5 20
9 Dc2 19 17 26 26
10 Dc3 17 15 25 26
Hình 2: Hoạt tính ức chế Shigella ssp. Của chủng Lo(1); L1 (2); Drl (3) Bảng 4. Năng lực phân giải protein của 10 chủng
Nghiên cứu Hoạt tính phân giải( D – d,mm)
Chủng Cazein Gelatin L0 11 23 L1 12 24 L2 11 22 N3 11 21 N7 11 21 N10 10 24 Dr1 11 22 Dr3 11 22 Dc2 11 20 Dc3 20 22
Hình 3: Hoạt tính proteaza của 3 chủng Lo(1); L1 (2); Drl (3)
Đề tài phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ.tpHCM
Bảng 5. Một số hình thi khuẩn lạc dưới kính hiển vi ×100 và ×1000 đề tài đ phn lập được Stt Kí hiệu chủng Quan sát khuẩn lạc Mô tả khuẩn lạc Quan sát nhuộm gram Mô tả hình thái vi khuẩn 1 S1a Tròn, nhỏ, mép nhẵn, mặt lồi bóng, trắng đục Hình que, rất ngắn, nhỏ 2 S1b Tròn, to, mép nhẵn, lồi bóng, trắng đục Hình cầu 3 S2 Tròn, to, mép gợn sóng, lồi có nếp, trắng đục Hình que, ngắn, dính cặp 4 S3 Tròn, mép gợn sóng, phẳng có nếp gấp, trắng đục Que, ngắn, dính chùm 5 S5 Nhỏ, tròn, mép trơn, lồi nhẵn, bóng, trắng đục Que, ngắn
6 S6 Khuẩn lạc trung bình, tròn, mép trơn, mặt nhẵn bóng, trắng đục Que, nhỏ, ngắn, dính cặp 7 N1 Khuẩn lạc vừa, tròn không đều, mép gợn sóng, trắng đục Que, ngắn, dính chùm 8 N4 Nhỏ, tròn không đều, mép gợn, màu nâu Que, dài, thon, nhỏ 9 D2 To, tròn, mép gợn sóng, lồi, trắng đục Que, ngắn, dính cặp 10 T1b Khuẩn lạc trung bình, tròn không đều, mép gợn sóng, gồ ghề, màu nâu Hình oval
phương pháp tiến hành tuyển chọn chủng vsv có tiềm năng probiotic
- Kháng vsv chỉ thị bằng các phương pháp khuếch tán trên bề mặt thạch, qua giếng thạch Tuyển chọn chủng có tiềm năng probiotics bằng cách khuếch tán qua giếng thạch
Cách thực hiện như sau : ta hút 0.1ml dịch chứa 105 tế bào vi khuẩn chỉ thị vào đĩa thạch chứa môi trường BHI có 2% agar, trang cho đều, đục lỗ thạch. Sau đó nhỏ 10µl dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic vào lổ thạch. Đem ủ 370C/24 giờ. Sau đó đo đường kính vòng kháng.(hình 4)
- Khả năng đối kháng bằng phương pháp Tubidimetricassay (đo độ đục). Thực hiện nuôi cấy vi khuẩn lactic trong môi trường MRS lỏng, kị khí. Và lấy dịch nuôi cấy phân tích lượng H2O2 sinh ra. Kết quả H2O2 không sinh ra trong quá trình nuôi cấy. Vậy chất kháng khuẩn còn lại là acid hữu cơ và bacteriocin. Để loại bỏ tác dụng của acid hữu cơ trong hoạt tính kháng khuẩn, tiến hành trung hòa dịch nuôi cấy rồi đem ly tâm và đo độ đục. (hình 5)
Hình 5. xác định khả năng đối kháng bằng phương pháp Tubidimetricassay (đo độ đục)
(a) (b)
- Hình a : phải là ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy ly tâm (không trung hòa) ủ với E.coli.
Trái là ống nghiệm đối chứng thay dịch nuôi cấy là môi trường MRS
- Hình b: phải là ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy ly tâm (trung hòa) ủ với E.coli
Hình 6. sơ đồ quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm probiotic
Hình 7: Sơ đồ Phân lập, định danh vi khuẩn lactic (theo phương pháp cổ điển Bergey,s Manual, 1957).
Giới thiệu một số thiết bị
1. Máy sấy phun 2. Máy đông khô
5. Tủ sấy 6. máy kiểm tra aflatocxin
7. Tủ giữ giống 8. Tủ đông lạnh