* Quy trình nhân giống Aspergillus ssp.
Môi trường Czapek thạch nghiêng
Ống mốc cấy chuyển
Nuôi cấy 30-320C trong 5-6 ngày
Nước cất Giống trong ống thạch nghiêng
Trộn đều bào tử
Cho vào môi trường czapek lỏng trong bình tam giác
3.5.6.3. Quy trình lên men thu chế phẩm enzym cellulase
Nguyên liệu Xử lí nguyên liệu Hấp khử trùng Ủ trên khay Làm nguội
Bóp tơi Trộn giống vsv
Cho vào thau cho nước cất vào
Cồn hay sunlfat amon Lọc
Thu kết tủa enzyme Sấy
Enzyme bán tinh khiết
3.5.6.4. Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu: Nguồn tinh bột rẽ tiền như: cám gạo, ngô, bắp, bã khoai mỳ,...hàm lượng tinh bột phải đạt trên 20-30%, độ ẩm không quá 15%, tạp chất không quá 0.05%. Nguyên liệu xốp giúp sợi nấm phát triển tốt đa để sinh hoạt lực enzyme cao nhất
Hấp thanh trùng: nguyên liệu có nhiều bào tử vsv khác nên phải thanh trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vsv ngoại lai, thanh trùng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Trước khi thanh trùng dùng HCL hay H2SO4 để điền chỉnh pH môi trường.
Sau khi thanh trùng làm nguội bắt đầu cấy giống. Trộn giống vi sinh vật: Sau khi làm nguội, tiến hành cấy giống vào, trộn đều, tỉ lệ cấy giống thường là 0,5-20% so với khối lượng của môi trường.
Kỹ thuật nuôi cấy: Sau khi đã trộn giống xong, môi trường được trải đều ra các khay. Để trong phòng ủ có nhiệt độ và độ ẩm không khí thích hợp cho sợi nấm phát triển. Nhiệt độ thích hợp là 28-320C.
Thu chế phẩm enzyme: sau khi nuôi trong thời gian 5-6 ngày. Ta cho vào bì và cho nước cất vào, bóp cho tơi, tiếp theo lọc cho vào thau, cho cồn hay sunlfat amon vào để kết tủa enzyme. Sau đó sấy thu dịch enzyme thô
Trong khi tiến hành kết tủa, ta phải làm lạnh dịch enzym thô xuống 4-70C, để tránh làm mất hoạt tính của enzym. Khi đổ dung dich kết tủa thì phải đổ một cách từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
3.6. Kết quả và thảo luận
3.6.1. Sản xuất thử probiotic vi sinh
Tìm thời gian ln men thích hợp
Lên men các vi sinh vật Saccharomyces, Bacillus, Lactobacillus, lấy mẫu sau 24, 48, 56 và 72 h, đo sinh khối và vòng kháng vi sinh vật chỉ thị (Shigella spp.). Thử nghiệm hoạt tính kháng vsv trong môi trường lên men tìm thời gian lên men thích hợp.( kết quả trình by bảng 3.1)
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vsv trong môi trường lên men
Chủng Sốvsv(cfu/ml)và hoạtlượng tính sinh học
Thời gian lên men (giờ)
24 48 56 72 Saccharomyces Số lượng vsv 5.8× 10 7 8 ×108 7.8 ×108 7.6 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm) 4 10 9 8 Bacillus Số lượng vsv 4.9 ×108 7.8 ×109 9.9 ×108 8 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm 6 18 12 10 Lactobacillus Số lượng vsv 6.8 ×107 9.5 ×109 8× 108 7.5 ×108 Hoạt tính kháng Shigella(D-d,mm 9 18 20 19
- Bảng 3.1. cho ta thấy nồng độ vsv giảm dần theo thời gian lên men và thời gian lên men trong 48 giờ là tốt nhất đối với các chủng vsv, tại bảng kết quả cho thấy với 56 giờ thì khả năng kháng shigella của chủng vk Lactobacillus là cao nhất . Thử nghiệm các phương pháp sấy, xác định tỉ lệ sống sót
Trong sấy phun giai đoan dầu là giai đoạn nước bay hơi, tiếp theo là rơi trong buồng sấy, các yếu tố như: nhiệt độ khí ra vào, thời gian lưu và đốc độ bơm thụ động là các yếu tố ảnh hưởng tới tỉ lệ sống sót của vi khuẩn probiotics. Nhiệt độ vi khuẩn khi vào buồng sấy được coi là thông số quyết định tỉ lệ sấy phun. Nhiệt độ < 640C, nhiệt độ này tổn thương màng tế bào, khi vượt quá 650C thì xảy ra biến tính protein và ribosome gây chết tế bào.
Trong sấy đông khô tổn thương tế bào lại do sự đông đá. Sấy đông khô là quá trình làm mất nước đã được làm lạnh đông. Trong quá trình làm lạnh đông làm tăng nồng độ chất hòa tan ngoại bào, vì vậy nước di chuyển từ trong tế bào ra ngoài. Tốc độ lạnh đông ( 0C/phút) là yếu tố quyết định thu hồi sản phẩm. nếu tốc độ thấp thì nước bên trong nội bào không đủ thời gian thoát ra bên ngoài, làm lạnh quá nhanh mng phospholipid co thắt hạn chế nước thoát ra, nồng độ môi trường tăng cao, áp xuất thẩm thấu cũng tăng gây stress cho tế bào và gây tổn thương cho ribosomes.
Bảng 3.2 trình by tỉ lệ sống sĩt của vi sinh vật probiotic sau 2 qu trình sấy phun và đông khô. Tỉ lệ sống sĩt của hỗn hợp vi sinh vật là 75% đối với sấy phun và 80% đối với đông khô.
Bảng 3.2. Tỉ lệ sống sĩt của vsv qua 2 qu trình sấy
Quá trình sấy Sấy phun Đông khô
Thông số sấy
Nhiệt độ đầu vào, ra 1450C và 55 0C
Kích thước hạt: 0.1 – 0.5µm Hệ số thu hồi chất rắn: 60% Năng xuất 2 lít/giờ
Tốc độ đông khô đá: 0.8 0C/ phút
Nhiệt độ đông: - 400C Bơm chân không 1,95×10- 3mbar
Năng xuất 2 lít/giờ Thành phần chất bảo
vệ (%) Sữa gầy 20% + lactose 2% +cao nấm men 0.05% + NaCl 0.01%
Sữa gầy 20% + lactose 10% + sucrose 10% + gelatin 1%
Nồng độ tế bào trước
khi sấy cfu/ml 6×10
9 6×109
Nồng độ tế bào sau
khi sấy cfu/ml 4.5×10
9 4.8×109
Tỉ lệ sống sót % 75% 80%
Sấy bằng nhiệt thì cũng gây tổn thương cho tế bào nhưng tỷ lệ tổn thương có thể ít hơn, nhiệt độ sấy từ 35 – 400C. Dùng phương pháp này thì không tốn chi phí về thiế bị như hai phương pháp trên. Nhưng sẽ dễ bị tạp nhiễm bởi môi trường xung quanh.
Chế độ phơi ngoài nhiệt độ bình thường thì không bị ảnh hưởng do nhiệt độ là phương pháp rẽ tiền, không tốn trang thiết bị …Nhưng khả năng bị tạp nhiễm cc vsv khc bởi môi trường xung quanh rất dễ dng.
Dù sấy bằng phương pháp nào thì tế bào vẫn bị tỗn thương do mất nước và hay đổi cấu trúc không gian protein màng.
Tìm chất mang, chế độ phối trộn v khảo st thời gian bảo quản
Sau khi sấy, hỗn hợp vi sinh probiotic được trộn với cc thnh phần chất mang khc nhau. Tỉ lệ sống sĩt sau 15, 30, 60, 90 ngy bảo quản được theo di (bảng 3.3).
Bảng 3.3. kết quả khảo sát chất mang phối trộn và thời gian bảo quản sau khi sấy
Chất mang Nồng độ tế bào ban đầu
Thời gian bảo quản sau khi sấy đông khô (ngày)
15 30 60 90
CM I 6 ×109 4.5 ×109 4.0 ×109 8.2×108 7.8 ×108
CM II 6 ×109 5.0 ×109 4.5 ×109 2.3 ×109 2.0 ×109
CM III 6 ×109 4.5 ×109 3.2 ×109 2.0 ×109 1.0 ×109
CM IV 6 ×109 4.8 ×109 4.0 ×109 7.5 ×108 6.5 ×108
Nhìn vào kết quả ta thấy sau thời gian bảo quản lượng sinh khối của vsv giảm dần, cụ thể sự thay đổi về nồng độ của vsv trong các môi trường và sau thời gian bảo quản 60 và 90 ngày so với ban đầu như sau:
CM I: 15% - 13% CM II: 75% - 35% CM III: 35% -16 CM IV: 13% - 11%
Kết quả cho thấy môi chất mang II và chất mang III không giảm nhiều so với 2 chất mang I và IV. Vậy nên chọn chất mang II và III là thích hợp. Thời gian bảo quản khoảng 60 ngày là thích hợp vì càng về sau nồng độ tế bào càng giảm.
Bao bì bảo quản sản phẩm
Sản phẩm đựơc nghiên cứu bảo quản trong hai lọai bao bì polyethylene v bao trng nhơm. Tỉ lệ sống sĩt sau thời gian bảo quản được trình by trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Khảo sát các chế độ bảo quản chế phẩm
Chế độ bảo quản
Thời gian bảo quản (ngày)
Polyethelene 158.5 ×108 308.2 ×108 607.5 ×108 906.7 ×108 Bao tráng
nhôm
8.2 ×108 8. ×108 7.6 ×108 7.2 ×108
Với bao bì Polyethelene, tỉ lệ sống sĩt cịn 78% sau 90 ngy so với 15 ngày, trong khi đó khi sử dụng bao tráng nhôm, tỉ lệ này tương ứng đạt 85%.
Bảo quản trong bao tráng nhôm cho tỉ lệ sống sót của vi sinh vật probiotic cao hơn so với bao bì Polyethelene., tuy nhin khc biệt ny khơng cĩ ý nghĩa thống k, nn cả 2 loại bao bì trên đều thích hợp để bảo quản vi sinh vật probiotic.
3.6.2. Sản xuất thử enzyme cellulase hỗ trợ tiêu hóa
Chọn chủng thích hợp: Từ 2 chủng ban đầu chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm thăm dò và rút ra được khả năng phân giải cellulose của 2 chủng nấm mốc
Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (bảng 3.5, hình 3.2) và (bảng 3.5, hình 3.3)
Những chủng nấm mốc nói trên đều được phân lập và tuyển chọn từ những nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc trong nước, rất sẵn có và rẻ tiền. Đồng thời có tính ổn định tốt, khả năng tăng trưởng và sinh tổng hợp enzyme tốt.
Bảng 3.5.Chủng A1: (Aspergillus niger)
Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 33 34,33 1 35 5735 37 35,67
Hình 3.2. Vòng phân giải của chủng A1: (Aspergillus niger)
Bảng 3.6. Chủng A2: (Aspergillus oryzae)
Hình 3.3. Vòng phân giải của Chủng A2: (Aspergillus oryzae)
Lặp lại Nồng độ CMC Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB CMC 0,5 36 34 39 36 1 34 30 32 32 1,5 30 29 29 29,33
Lên men thu chế phẩm enzym cellulase bổ sung vo chế phẩm probiotic
Phương pháp lên men bề mặt đã đựơc áp dụng để sản xuất enzyme protease bổ sung vào chế phẩm probiotics. Nhân giống sản xuất bằng lên men chìm sử dụng môi trường Czapek. Lên men bề mặt sản xuất enzyme sử dụng nguyên liệu rẻ tiền là bã khoai mỳ bổ sung khoáng Czapek. Enzyme được thu hồi qua phương pháp kết tủa bằng cồn hoặc sunfat amôn, sau đó sấy ở nhiệt độ 35-40oC, 2 đến 3 ngày (xem vật liệu và phương pháp).
Bảng 3.7. Tĩm tắt qu trình ln enzyme thu chế phẩm enzyme cellulase Chuẩn bị và tiệt trùng môi
trường nuôi cấy:
Môi trường lên men bã khoai mỳ sau khi hấp thanh trùng
Trộn giống sau khi làm nguội môi trường.
tỉ lệ giống: 0,5-20%
Lên men bề mặt:
Nhiệt độ thích hợp là 28-320C. thời gian ln men 5-6 ngày
Canh trường lên men trộn với nước cất để trích ly enzyme
3.6.3. Hoàn thành quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Hình 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic
Phối trộn với chất mang (bột đậu nành, cám gạo, trấu, bã khoai mỳ). xử lí nhiệt, độ ẩm 15%
Đồng hóa hỗn hợp dịch giống với chất bảo quản nhiệt
Đồng hĩa huyền ph với chất bảo quản nhiệt
Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Phối trộn giống (tạo hỗn hợp) Lên men chìm, 16h/370C
Lên men riêng rẽ từng giống Ln men ring rẽ từng giống
Giống
Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL Sữa gầy 20%, cao nấm men 0.05%, lacto 2%, NaCL
0.01%
Sấy ( sấy phun, đông khô, sấy nhiệt …)
Đóng gói Sản phẩm, bảo quản 100C
3.6.4. Chế phẩm probiotic dưới dạng bột đông khô và dạng lỏng
Đã sản xuất được 20 lít chế phẩm dạng lỏng, 5 kg sản phẩm dạng bột
Thành phần sản phẩm:
Dạng lỏng:
Lactobacillus plantarum, L. brevis : 109CFU/ml
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :108CFU/ml
Saccharomyces cerevisae, S. boulardii : 109CFU/ml
Amylase : 9 UI/ml
Protease : 9,7 UI/ml
Cellulase : 1841 UI/ml
Hình 3.9. Chế phẩm probiotic dạng lỏng Dạng bột Lactobacillus
plantarum, L. brevis : 8.5 x 108cfu/g
Bacillus amyloliquefaciens, B. megaterium :8.2 x 107CFU/g
CHƯƠNG VI: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận:
Sau quá trình tìm hiểu và thực nghiệm về chế phẩm probiotic trong chăn nuôi. Em đã tổng kết cho mình được những kiến thức, hiểu hơn về chế phẩm này và nhận thấy rằng:
chăn nuôi là một chế phẩm chủ yếu chứa vi sinh vật sống có họat tính kháng vi sinh gây bệnh đường ruột và tăng cường miễn dịch nhằm tăng hiệu quả trong chăn nuôi gia súc gia cầm.
Hiện nay trên thế giới và Việt Nam có nhiều nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn được những chủng vi sinh vật hoạt tính probiotics. Trong khi chế phẩm probiotic chăn nuôi đã được thương mại hóa rộng rãi ở nứơc ngòai và xuất hiện trên thị trường Việt Nam, thì nghiên cứu trong nước đang ở giai đọạn hoàn thiệt quy trình sản xuất probiotic quy mô phòng thí nghiệm, xác định điều kiện lên men tối ưu tăng sinh khối và các phương pháp thu hồi sản phẩm cho tỉ lệ sống sót cao. Bên cạnh đó, sản xuất các enzyme hỗ trợ tiêu hóa cũng được chú ý nhằm phối hợp với vi sinh probiotic tạo thành chế phẩm thức ăn bổ sung vừa phòng chữa bệnh vừa tăng hiệu suất sử dụng thức ăn.
4.2.Đề nghị
Hòan thiện quy trình sản xuất chế phẩm probiotic, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và qúa trình thu hồi sản phẩm.
Thử nghiệm sản phẩm trên gia súc
Nghiên cứu các thành phần bổ sung vào chế phẩm probiotics nhằm đa dạng hóa và nâng cao hiệu quả sử dụng sản phẩm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Lương Đức Phẩm (2006), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội
2. Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn Hà Nội, Tạp chí khoa học, ĐHQG- Khoa tự nhiên và công nghệ 24, Hà Nội
3. Nguyễn Đức Lượng (2006), Vi sinh vật học công nghiệp, tập 1,2, XNB Đại học Quốc Gia,Tp.HCM
4. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Thạch, Phạm văn Tỵ (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập I, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội
5. Nguyễn Tiến Thắng (2009), Gíao Trình Công Nghệ Enzyme, Tp.HCM
6. Trung tâm công nghệ sinh học- ĐHQG Hà nội, báo cáo khoa học (2006), nghiên cứu tuyển chọn đánh giá các đặc tính sinh học, tạo tổ hợp các chủng vi sinh vật hữu ích phục vụ cho việc sản xuất một số chế phẩm probiotic dùng trong chăn nuôi, Hà Nội
7. Trường ĐH Kỹ thuật công nghệ,Tp.HCM, đề tài báo cáo khoa học cấp trường (2009), phân lập, tuyển chọn vi khuẩn lên men lactic làm chế phẩm probiotic
8. Viện KHKT Nông Nghiệp Miền Nam, Tp.HCM, đề tài báo cáo khoa hoc, (2006-2008), Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật có lợi sản xuất chế phẩm probiotic trong thức ăn chăn nuôi
9. Viện vi sinh vật và CNSH-ĐHQG Hà Nội, báo cáo khoa học (2008), Nghiên cứu các thông số kỹ thuật sản xuất probiotic dạng lỏng và dạng bột dùng trong chăn nuôi.
Tiếng Anh
1. D. Czerucka, T. Piche, &P.Rampal, (2007) ,Review article: yeast as probiotics – Saccharomyces boulardii, Alimentary Pharmacology & Therapeutics, France 2. David J. Nisbet, Donald E. Corrier, John R. Deloach, (1995), Probiotic for control of Salmonela, United Stales Patent Number, 5,478,557
3. Elizete de F. Reque; Ashok Pandey; Sebastião G. Franco; Carlos R. Soccol,2000,Gisolation, identification and physiological study of lactobacillus fermentum LPB for usd as probiotic in chickensb, razilian Journal of Microbiology (2000) 31:303-307 ,ISSN 1517-8382
4. Marion Bernardeau, Micheline Guguen & Jean Paul Vernoux, 2006, Benefcial lactobacilli infoodand feed: long-termuse,biodiversity and proposals for specifc and realistic safetyassessments, Laboratoire de Microbiologie Alimentaire, ISBIO, Universit ´ e de Caen Basse-Normandie, Caen, France 5. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, Popa Ovidiu., Câmpeanu Gheorghe, 2005 , Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used foobtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (5), pp. 403-408, May 2005, Applied Biochemistry and Biotechnology Center – Biotehnol, Bd.Marasti no. 59, sector 1, Bucharest, Romania
5. Vamanu Emanuel, Vamanu Adrian, Popa Ovidiu., Cmpeanu Gheorghe, 2005 , Isolation of a Lactobacillus plantarum strain used foobtaining a product for the preservation of fodders, African Journal of Biotechnology Vol. 4 (5), pp. 403-408, May 2005, Applied Biochemistry and Biotechnology Center – Biotehnol, Bd.Marasti no. 59, sector 1, Bucharest, Romania
PHỤ LỤC
Đề tài nghiên cứu phân lập đặc điểm vi khuẩn lactic ứng dụng làm chế phẩm vi sinh. Khoa sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên ĐHQGHN
Bảng 1. kết quả phân lập, định danh theo phương pháp cổ điển đã tuyển chọn được 10 chủng có đặc tính sinh học.
Chủng Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc
Lo Que ngắn, xếp chuỗi Tròn, trong, nhỏ
L1 Que, chuỗi dài Tròn, trắng
L2 Que, xếp chuỗi ngắn Tròn, trắng sữa chân