Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm đầu những năm 80 của thế 19. Kỹ thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu.
Một chu kỳ PCR bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần [25]:
Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94° – 95°C trong thời gian ngắn.
Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 50° – 60°C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15 – 30 base sẽ tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
Enzyme polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc hiệu, phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 72°C.
Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1X đoạn DNA cần nhân sẽ có 2X đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của
hai đoạn mồi.
PCR bao gồm các thành phần sau đây:
Một đoạn DNA khuôn.
Một cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15 nucleotide – 30 nucleotide.
Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt.
Phản ứng kết thúc, điện di kiểm tra 8 μl sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. Thành phần phản ứng chạy PCR: dNTPs (10 mM) : 1µl Buffer (10 X) : 2.5µl Primer F (10 µM): 1µl Primer R (10 µM): 1µl Taq (5 U/ul): 0.2µl H2O: 18.3µl DNA plasmid: 2µl Tổng thể tích: 25 µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR của gen mã hóa xylanase và hph: 94°C 92°C 60°C 72°C 72°C 4°C 5 phút 43 giây 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút