Các dòng plasmid tái tổ hợp trước tiên được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn
Kpn I. Các khuẩn lạc A. tumefaciens có chứa Ti-plasmid tái tổ hợp tạo được nhờ xung
điện được phát hiện bằng phương pháp chọn lọc trên môi trường đặc hiệu, tách chiết DNA plasmid và tiếp tục được biến nạp trở lại tế bào E. coli và tiến hành các thí
nghiệm phân tích phân tử tiếp theo. Sở dĩ cần phải thực hiện bước biến nạp trở lại DNA plasmid vào trong tế bào vi khuẩn E. coli vì số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp này trong tế bào Agrobacterium rất ít, không đủ để tiến hành các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của các kết cấu gen đưa vào.
Các plasmid dự đoán có mang vector biểu hiện pCB1300_xylB_hph được tinh sạch và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với hai cặp mồi nhân xylB và hph. Kết quả PCR trên hình 3. 16 cho thấy, chúng tôi đã đưa được plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph vào trong tế bào A. tumefaciens. Các dòng sau biến nạp được dùng làm nguyên liệu để chuyển vào nấm.
Hình 3. 16: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của xylB trong Agrobacteirum bằng PCR
1–7: Sản phẩm PCR của plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium M: Marker 100 bp
Vì cấu trúc biểu hiện gen xylB đã được chuyển cùng với cấu trúc biểu hiện gen
hph vào A. tumefaciens. Do vậy, dòng plasmid tái tổ hợp tách từ Agrobacterium tiếp
tục được kiểm tra bằng PCR sử dụng cặp mồi đặt hiệu của gen hph.
Trên điện đồ (Hình 3. 17) sản phẩm PCR rất đặc hiệu với kích thước khoảng 0,6 kb. PCR là phương pháp đơn giản, hiệu quả và nhanh chóng để xác định chính xác cấu trúc của gen đã chuyển vào Agrobacterium.
0,6 ~ 0,7
1 2 3 4 5 6 7 M kb
Hình 3. 17: Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của hph trong Agrobacteirum bằng PCR
1–7: Sản phẩm PCR của gen hph M: Marker 100 bp
Như vậy, chúng tôi đã tạo được chủng Agrobacterium CV58C1 - pGV2260 mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph. Các dòng khuẩn lạc sau khi kiểm tra sẽ được lưu giữ để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm.