Khai thác hợp chất kháng vi sinh vật từ phụ phẩm nhà máy thuỷ sản bằng phương pháp sinh học và ứng dụng trong bảo quản thịt tươi

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC07 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI “KHAI THÁC HỢP CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT TỪ PHỤ PHẨM

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC07

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“KHAI THÁC HỢP CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT TỪ PHỤ PHẨM NHÀ MÁY CHẾ BIẾN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH

HỌC ĐỂ BẢO QUẢN THỊT TƯƠI”

MÃ SỐ: KC.07.TN01/11-15

Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Bách khoa Hà nội Chủ nhiệm đề tài/dự án: TS Hồ Phú Hà

Hà Nội - 2012

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC07

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“KHAI THÁC HỢP CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT TỪ PHỤ PHẨM NHÀ MÁY CHẾ BIẾN THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH

HỌC ĐỂ BẢO QUẢN THỊT TƯƠI”

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội - 2012

LỜI CẢM ƠN

Tập thể cán bộ thực hiện Đề tài tiềm năng mã số KC.07.TN01/11-15 trân trọng cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Văn phòng các chương trình Khoa học Công

nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, Ban chủ nhiệm chương trình “Nghiên cứu ứng

dụng và phát triển công nghệ sau thu hoạch” KC.07/11-15 đã giao nhiệm vụ đề tài

và hướng dẫn, giúp đỡ để chúng tôi hoàn thành nhiệm vụ được giao

Chúng tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Phòng Khoa học - Công nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm (ĐH Bách khoa Hà Nội) đã thường xuyên quan tâm, chỉ đạo sâu sát và tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện Đề tài

Chúng tôi cũng xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp trong và ngoài trường, các em sinh viên đã nhiệt tình tham gia và giúp đỡ thực hiện Đề tài

LỜI CAM ĐOAN

Tập thể cán bộ thực hiện Đề tài tiềm năng mã số KC.07.TN01/11-15 xin cam đoan Đề tài này là kết quả do chúng tôi thực hiện Các số liệu công bố là hoàn toàn trung thực và không vi phạm bản quyền của bất kỳ tác giả nào khác

Chủ nhiệm đề tài

Hồ Phú Hà

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà nội, ngày tháng năm 20

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I THÔNG TIN CHUNG

Tên tổ chức đang công tác: Đại học Bách khoa Hà nội

Địa chỉ tổ chức: Số 1 Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng, Hà nội

Địa chỉ nhà riêng: Số 9, dãy 38, Tập thể Bách khoa, Hà nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài/dự án:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Đại học Bách khoa Hà nội

Điện thoại: 04 3869.2136 / 04 3868 2470 Fax: 04 3868 2470

E-mail: qlkh@mail.hut.edu.vn

Website: www.hust.vn

Địa chỉ: Số 1 Đại Cồ Việt, Hai Bà Trưng, Hà nội

Số tài khoản:.3711.1.1057109

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Hai Bà Trưng, Hà nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Khoa học Công nghệ

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 1/ năm 2012 đến tháng 12/ năm 2012

- Thực tế thực hiện: từ tháng 1/ năm 2012 đến tháng 12/ năm 2012

- Được gia hạn (nếu có):

Thời gian

(Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

…

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:

(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

TT

Số, thời gian ban

1

1612/QĐ-BKHCN

Quyết định về việc phê duyệt Danh mục đề tài nghiên cứu khoa học công nghệ tiềm năng thuộc lĩnh vực Công nghệ bảo quản và chế biến nông lâm thủy sản

và phát triển công nghệ sau thu hoạch

4 Số

01/2011/HĐ-

ĐTTN-KC.07/11-15

Hợp đồng nghiên cứu KH và phát triển công nghệ

Nội dung tham gia chủ yếu

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người kể

Nội dung tham gia chính

Sản phẩm chủ yếu đạt được

Ghi chú*

Chuyên đề, bài báo, báo cáo

Báo cáo

4 TS Phan

Thanh Tâm

TS Phan Thanh Tâm

Nội dung 3, ứng dụng

Chuyên đề, quy trình, bài báo

5 TS Chu Kỳ

Sơn

TS Chu Kỳ Sơn

Nội dung 3 Chuyên đề,

báo cáo

6 TS Vũ Thu

Trang

TS Vũ Thu Trang

Ứng dụng công nghệ

Báo cáo

7 TS Đăng

Minh Hiếu

TS Đăng Minh Hiếu

Nội dung 1 Chuyên đề

- Lý do thay đổi ( nếu có):

1

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

(Nội dung, thời gian, kinh

phí, địa điểm ) Ghi chú*

1 Hội thảo cho 40 người Tên hội thảo: Chitosan và

các dẫn xuất: Ứng dụng sinh học hướng tới phát triển bền vững

Thời gian: 14/12/2012; tại

ĐH Bách khoa Hà nội Kinh phí: 11 triệu đồng

2

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

1 Nội dung 1: Nghiên cứu tạo

TS Nguyễn Tiến Thành, Đại học Bách khoa

chitosan/COS từ phế liệu tôm

3 Nội dung 2: Nghiên cứu khả

năng kháng vi sinh vật của

các dẫn xuất thu được

6/2012 9/2012 TS Hồ Phú

Hà, TS Đặng Minh Hiếu

4 Nội dung 3: Nghiên cứu quy

trình công nghệ bảo quản thịt

bằng chế phẩm kháng vi sinh

vật

10/2012 12/2012 TS Hồ Phú

Hà, TS Đặng Minh Hiếu, TS Phan Thanh Tâm, TS Chu Kỳ Sơn

5 Báo cáo giải pháp công nghệ

6 Báo cáo ứng dụng quy trình

bảo quản tại cơ sở 12/2012

12/2012 TS Hồ Phú

Hà, TS Cung Thị Tố Quỳnh, TS

Vũ Thu Trang

7 Kiểm tra chất lượng sản phẩm 12/2012 12/2012 Viện Thú Y

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

Thực tế đạt được

chitosan/COS đạt chỉ tiêu, được nghiệm thu cấp cơ sở

Quy trình thu nhận

chitosan/COS đạt chỉ tiêu, được nghiệm thu cấp cơ sở

2 Giải pháp công nghệ ứng

dụng chế phẩm có hoạt tính

kháng khuẩn nhằm kéo dài

thời gian bảo quản 3 loại thịt

nguyên liệu (lợn, gà, bò)

Giải pháp dễ ứng dụng, đầy

đủ thông số kỹ thuật, được nghiệm thu cấp

cơ sở Thời gian bảo quản thịt đến 10-12 ngày

ở 0-2 o

C và 5-7 ngày ở 8-10 o

C bảo đảm chất lượng hóa lý, cảm quan và VSATTP theo tiêu chuẩn TCVN 7046- 2002

Giải pháp dễ ứng dụng, đầy

đủ thông số kỹ thuật, được nghiệm thu cấp

cơ sở Thời gian bảo quản thịt đến 13 ngày ở 0-

2oC và 7 ngày ở 8-10oC bảo đảm chất lượng hóa

lý, cảm quan và VSATTP theo tiêu chuẩn TCVN 7046- 2002

3 Bảng số liệu đánh giá chất

lượng sản phẩm Đầy đủ chỉ tiêu chất lượng sản

phẩm

Đầy đủ chỉ tiêu chất lượng sản phẩm

cơ sở

- Lý do thay đổi (nếu có):

1 01 bài báo Đăng trên tạp

chí chuyên ngành

02 Tạp chí Khoa

học và công nghê, tập 50, số 3A

2 01 Báo cáo hội thảo Hội thảo chuyên

ngành

Báo cáo tại hội thảo lần thứ 3

“Nghiên cứu và phát triển các sản phẩm tự nhiên” tại TP HCM 9- 10/11/2012

3 Tham gia đào tạo 2 kỹ sư Chuyên ngành

Công nghệ thực phẩm, công nghệ sinh học

2 kỹ sư CNTP,

3 kỹ sư CNSH tốt nghiệp 6/2012

- Lý do thay đổi (nếu có):

d) Kết quả đào tạo:

Theo kế hoạch

Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Theo

kế hoạch

Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Công ty TNHH nhà nước 1 thành viên thực phẩm

Hà nội

Đã kéo dài thời gian bảo quản thịt lợn, bò, gà ở 0-4oC đến 12 ngày và ở 8-

10oC đến 5-6 ngày

2

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

Đề tài đã đưa ra được 2 quy trình: sản xuất chế phẩm chitosan/COS có tính kháng khuẩn sử dụng phương pháp sinh học và giải pháp bảo quản thịt tươi bằng chitosan kháng vi sinh vật Chế phẩm tạo ra đạt tiêu chuẩn sản phẩm ngang với các sản phẩm thị trường

Đề tài cũng đã đi sâu vào nghiên cứu cơ bản để tìm hiểu về phổ kháng vi sinh vật của chế phẩm chitosan cũng như khả năng ứng dụng của chế phẩm trong bảo quản thịt tươi kết hợp với những hợp chất thân thiện khác

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Chế phẩm chitosan sản xuất bằng phương pháp sinh học đã tận dụng được phế liệu đầu vỏ tôm sau khi sản xuất tôm đông lạnh, tạo điều kiện làm tăng giá tri gia tăng

của nguồn hải sản Việt nam Nước thải của quy trình sản xuất chitin bằng phương pháp sinh học không độc hại và giảm thiểu được tác hại đối với môi trường

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

I Báo cáo định kỳ

phòng các chương trình

và Ban chủ nhiệm chương trình KC07 chủ trì

1

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 8

DANH MỤC CÁC BẢNG 9

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 11

MỞ ĐẦU 15

1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 17

1.1 Đặc điểm của chitin, chitosan và chitooligosaccharide (COS) 17

1.1.1 Giới thiệu chung 17

1.1.2 Tính chất hóa lý của chitosan 18

1.1.2.1Mức độ Deacetylation (DD) 19

1.1.2.2Độ nhớt 20

1.1.3 Ứng dụng 20

1.1.3.1Đặc tính kháng khuẩn của chitosan và COS 21

1.1.3.2Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan 21

1.1.3.3Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan 22 1.1.4 Sản xuất Chitin và Chitosan 25

1.1.4.1Phương pháp hóa hoc 26

1.1.4.2Phương pháp sinh học 27

2

1.1.4.3Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp

hóa học 31

1.1.5 Các phương pháp thu nhận COS 32

1.1.5.1Phương pháp vật lý 33

1.1.5.2Phương pháp hóa học 33

1.1.5.3Phương pháp sinh học 34

1.1.6 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan, COS ở Việt Nam 34 1.2 Thịt tươi và các yếu tố gây hư hỏng thịt 40

1.2.1 Các dạng hư hỏng của thịt 40

1.2.2 Nguồn gây ô nhiễm vi sinh vật trong thịt 40

1.2.3 Thực trạng chất lượng nguyên liệu thịt ở Việt Nam 42

1.3 Ứng dụng chitosan trong bảo quản thực phẩm 44

1.3.1 Bao bì và các các phương pháp bao gói thịt 46

1.3.1.1Phương pháp bảo quản thịt sử dụng khay xốp PS có bọc màng co dãn (màng căng - Stretch Film) 46

1.3.1.2Bảo quản thịt bằng phương pháp bao gói bằng túi PE và hút chân không 47 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.1 Vật liệu 49

2.1.1 Phế liệu tôm 49

3

2.1.2 Chitosan thương mại 49

2.1.3 Vi sinh vật 51

2.1.4 Thịt tươi 52

2.1.5 Các loại bao bì sử dụng 52

2.2 Hóa chất – môi trường 53

2.2.1 Môi trường vi sinh vật 53

2.2.2 Hóa chất 55

2.2.3 Các loại enzym sử dụng 55

2.2.4 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 56

2.3 Các phương pháp- Tiến hành thí nghiệm 56

2.3.1 Các phương pháp phân tích vi sinh 56

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy đối kháng trong di ̣ch lỏng 56

2.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 57

2.3.4 Các phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh 58

2.3.5 Xác định lượng protein trong chitin bằng phương pháp Biuret 59

2.3.6 Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng 59

2.3.7 Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp UV 60

2.3.8 Xác định độ nhớt của chitosan 60

2.3.9 Xác định độ hòa tancủa chitosan 61

2.3.10 Xác định lượng đường khử 61

4

2.3.11 Sản xuất chitin ứng dụng chế phẩm enzym 61

2.3.12 Qui trình thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn B subtilis CH36 62

2.3.13 Qui trình thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn L plantarum NCDN4 62 2.3.14 Phương pháp thu nhận chitosan 62

2.3.15 Phương pháp thủy phân chitosan 63

2.3.16 Kiểm tra phổ sản phẩm bằng phương pháp sắc kí bản mỏng 63

2.3.17 Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm 64

2.3.18 Ứng dụng chitosan thu được để bảo quản thịt 64

2.4 Cách tính hiệu suất loại protein và loại khoáng 65

2.5 Phương pháp tính toán và xử lý số liê ̣u 66

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67

3.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan và các dẫn xuất COS từ phế liệu nhà máy thủy sản 67

3.1.1 Lựa chọn phương án thu hồi chitin từ phế liệu tôm (PLT) bằng phương pháp sinh học 67

3.1.1.1Dùng chế phẩm Neutrase 1.5L 67

Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein 67

3.1.1.2Dùng chế phẩm Alcalse 2.4L 70

3.1.1.3Phương pháp thu nhận chitin ứng dụng B subtilis 73

3.1.1.4Phương pháp thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn lactic 78

5

3.1.1.5Kết quả thử nghiệm với qui mô 500g 87

3.1.1.6Kết hợp Alcalase và vi khuẩn L plantarum NCDN4 87

3.1.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan có độ deaxetyl hóa và phân tử lượng khác nhau 88

3.1.2.1Ảnh hưởng của nguồn chitin đến khả năng deaxetyl hóa 88

3.1.2.2Ảnh hưởngcủa thời gian và nhiệt độ đến độ deaxetyl 89

3.1.2.3Quá trình deaxetyl 2 giai đoạn 91

3.1.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm COS bằng phương pháp sinh học 93

3.1.3.1Lựa chọn chế phẩm enzym thương mại cho quá trình thủy phân chitosan 93

3.1.3.2Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitosan của chế phẩm Celluclast 1.5L 94

3.1.4 Quy trình sản xuất chitosan 95

3.2 Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các dẫn xuất chitosan 101

3.2.1 Khả năng kháng nấm men, nấm mốc 101

3.2.1.1Khả năng ức chế của chitosan lên nấm men 101

3.2.1.2Khả năng ức chế của chitosan lên nấm mốc 105

3.2.2 Khả năng kháng vi khuẩn cuả chế phẩm chitosan nghiên cứu 109

3.2.2.1Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm CA 109

3.2.2.2Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan đến hoạt tính kháng E.coli 110

6

3.2.2.3Lựa chọn chế phẩm chitosan/COS có tính kháng E coli tốt 113

3.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ bảo quản thịt bằng chế phẩm chitosan kháng vi sinh vật 1143.3.1 Khảo sát đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu thịt 1143.3.2 Lựa chọn phương pháp xử lý và nồng độ chế phẩm chitosan kháng khuẩn thích hợp trong bảo quản 3 loại thịt 1183.3.2.1Lựa chọn phương pháp xử lý 1183.3.3 Lựa chọn nồng độ chế phẩm kháng vi sinh vật thích hợp 1213.3.3.1Ảnh hưởng của nồng độ và thành phần chế phẩm đến các chỉ tiêu hóa lý 121

3.3.3.2Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến các chỉ tiêu vi sinh vật 1233.3.3.3Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm đến chất lượng cảm quan: 1243.3.4 Nghiên cứu bảo quản nguyên liệu thịt bằng chitosan kết hợp với natri diaxetat và natri lactat 1243.3.5 Nghiên cứu kết hợp hỗn hợp (chitosan + natridiaxetat+ natri lactat) với nisin nhằm tăng cường hiệu quả tác dụng 1293.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại bao gói và nhiệt độ bảo quản tới chất lượng thịt trong thời gian bảo quản 1313.3.6.1Ảnh hưởng của các loại bao gói và nhiệt độ đến chất lượng thịt lợn 131

3.3.6.2Ảnh hưởng của các loại bao gói và nhiệt độ đến chất lượng thịt

bò và gà 135

7

KẾT LUẬN 139KIẾN NGHỊ 140TÀI LIỆU THAM KHẢO 141

8

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc

COS: Chitosanoligosaccharide

DA: mức độ axetyl hóa

DD, DDA: mức độ deacetylation, mức độ deaxetyl hóa

DP: mức độ polymer hóa

E/S: Tỷ lệ enzyme/cơ chất

EG: Ethylene glycol

EPS: Expandable Polystyrene

LLDPE: (Linear low density polyethylene) Polyethylene mật độ thấp tuyến tính

9

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 So sánh giữa 3 quy trình sản xuất trong nước 38Bảng 1.3 Bảng quy định đánh giá chất lượng thịt 40Bảng 2.1 Các chế phẩm chitosan/COS thương mại dùng trong đề tài 49Bảng 2.2 Các vi sinh vật đã sử dụng 51Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 53Bảng 3.1.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình loại protein 67Bảng 3.1.2 Ảnh hưởng của pH tới quá trình khử protein 68Bảng 3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein 68Bảng 3.1.4 Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme tới quá trình khử protein 69Bảng 3.1.5 Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát 70Bảng 3.1.6 So sánh 2 phương pháp hóa học và enzym 73Bảng 3.1.7 Ảnh hưởng của pH ban đầu tới hiệu suất loại protein và loại khoáng 75Bảng 3.1.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường tới hiệu quả loại protein và khoáng 76Bảng 3.1.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới hiệu quả loại protein và khoáng77Bảng 3.1.10 Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu quả loại protein và khoáng 78Bảng 3.1.11 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến pH của dịch nuôi cấy 79Bảng 3.1.12 Tính chất của chitin thu nhận 88Bảng 3.1.13 Đặc tính chitosan 89

10

Bảng 3.1.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ deaxetyl đến màu sắc chitosan 91Bảng 3.1.15 Ảnh hưởng qui trình deaxetyl đến độ nhớt chitosan 92Bảng 3.1.16 Đặc tính sản phẩm COS 95Bảng 3.1.17 Sơ bộ đánh hiệu quả kinh tế của quy trình 100Bảng 3.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của chitosan ở các nồng độ khác nhau 109Bảng 3.2.3 Mật độ vi khuẩn E coli theo thời gian (log cfu/ml) sau khi tiếp xúc với các chế phẩm chitosan/COS 114Bảng 3.3.1: Chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu thịt lợn tại các điểm lấy mẫu khác nhau 115Bảng 3.3.2: Chất lượng nguyên liệu thịt bò tại các điểm lấy mẫu khác nhau 116Bảng 3.3.3: Chất lượng nguyên liệu thịt gà tại các điểm lấy mẫu khác nhau 117Bảng 3.3.4 Nồng độ chế phẩm tối ưu cho các ngày bảo quản 125Bảng 3.3.5 So sánh các chỉ tiêu cảm quan giữa mẫu được xử lý bằng dung dịch tối ưu và mẫu kiểm chứng 126Bảng 3.3.6 So sánh các chỉ tiêu chất lượng giữa mẫu được xử lý bằng dung dịch tối ưu thực nghiệm và theo tính toán với mẫu kiểm chứng 128Bảng 3.3.7 Chất lượng nguyên liệu thịt sau bảo quản khi sử dụng kết hợp hỗn hợp (chitosan + natridiaxetat+ natri lactat) với nisin 130

11

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin 17Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan 18Hình 1.4 Qui trình thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học [4] 27Hình 1.5 Quy trình thu chitin từ phế liệu vỏ giáp xác 31Hình 1.8 Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học 32Hình 1.9 Quy trình của Đỗ Minh Phụng 36Hình 1.10 Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy đặc sản Hà Nội 37Hình 1.11 Quy trình sử dụng enzyme papain để sản xuất chitosan 38Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp đối kháng trực tiếp trong dịch nuôi cấy lỏng 57Hình 2.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 58Hình 2.3 Qui trình thủy phân chitosan 63Hình 3.1.1 Bề mặt đáp ứng của quá trình khử protein 71Hình 3.1.2 Phế liệu tôm trước và sau khi khử protein lần 1 bằng Alcalase 72Hình 3.1.3 Sự thay đổi pH trong quá trình lên men 74Hình 3.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung đến sự thay đổi pH của quá trình lên men 75Hình 3.1.5 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến sự thay đổi pH trong quá trình lên men 77

12

Hình 3.1.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sự thay đổi pH và nồng độ acid tạo thành 80Hình 3.1.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới hiệu suất khử khoáng và khử protein 81Hình 3.1.8 Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự thay đổi pH và nồng độ acid tạo thành 81Hình 3.1.9 Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất khử khoáng và khử protein 82Hình 3.1.10 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến pH và nồng độ acid tạo thành 83Hình 3.1.11 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới hiệu suất khử khoáng và khử protein 84Hình 3.1.12 Ảnh hưởng của pH dịch ban đầu đến sự thay đổi pH của quá trình lên men và nồng độ acid tạo thành 84Hình 3.1.13 Ảnh hưởng của pH dịch tôm ban đầu tới hiệu suất khử khoángvà khử protein 85Hình 3.1.14 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất khử khoáng và khử protein 86Hình 3.1.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến độ deaxetyl DDA 90Hình 3.1.16 Ảnh hưởng của qui trình deaxetyl đến DDA 1-chitin từ tôm thẻ; 2-chitin từ tôm sắt; 3- chitin từ tôm sú 92Hình 3.1.24 Kiểm tra phổ sản phẩm của sản phẩm COS 94Hình 3.1.25 : Quy trình sản xuất chitosan 97

13

Hình 3.2.1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên nấm men Saccharomyces cerevisiae 103Hình 3.2.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của dẫn xuất thủy phân chitosan trên nấm men Saccharomyces cerevisiae 105Hình 3.2.3 Khả năng ức chế của chế phẩm chitosan tinh sạch lên sự sinh trưởng

và phát triển của Aspergillus niger 106Hình 3.2.4 So sánh tốc độ hình thành bào tử của nấm mốc Asperillus niger sau khi xử lý với chitosan ở các nồng độ khác nhau 107Hình 3.2.5 Khả năng ức chế của dẫn xuất thủy phân chitosan lên sự sinh trưởng

và phát triển của Aspergillus niger 108Hình 3.2.6 Khả năng kháng E.coli của các chế phẩm chitosan theo thời gian 112Hình 3.3.15: Chỉ tiêu hóa lý các mẫu nguyên liệu thịt được xử lý bằng các phương pháp khác nhau 119Hình 3.3.16 Chỉ tiêu vi sinh vật của các mẫu nguyên liệu thịt được xử lý bằng các phương pháp khác nhau qua thời gian bảo quản 120Hình 3.3.17 pH của các mẫu xử lý bằng các dung dịch bảo quản khác nhau 122Hình 3.3.18 Hàm lượng NH3 của mẫu xử lý với dung dịch bảo quản khác nhau 122Hình 3.3.19 Chỉ số VSV của mẫu xử lý với các dung dịch khác nhau 123Hình 3.3.20 Mẫu kiểm chứng và mẫu xử lý ngay sau khi phun dung dịch xử lý tối ưu 127Hình 3.3.21 Mẫu thịt sau 11 ngày bảo quản ở 4°C 127

14

Hình 3.3.22 Các chỉ tiêu hóa lý của thịt bao gói và bảo quản ở các chế độ khác nhau 132Hình 3.3.23 Chỉ tiêu vi sinh của các mẫu thịt lợn bảo quản ở 0-4oC và 8-10oC với các loại bao gói khác nhau 134Hình 3.3.24: Sự biến đổi chất lƣợng hóa lý các mẫu nguyên liệu thịt bò, gà theo thời gian bảo quản ở 0-4oC với các loại bao gói khác nhau 135Hình 3.3.25: Sự biến đổi chất lƣợng vi sinh vật các mẫu nguyên liệu thịt bò, gà theo thời gian bảo quản ở 0-4oC với các loại bao gói khác nhau 136Hình 3.3.26 : Sự biến đổi chất lƣợng hóa lý các mẫu nguyên liệu thịt bò, gà bảo quản ở 8-10oC với các loại bao gói khác nhau 137Hình 3.3.27 : Các chỉ tiêu vi sinh vật các mẫu nguyên liệu thịt bò, gà bảo quản ở 8-10oC với các loại bao gói khác nhau 138

15

MỞ ĐẦU

Hiê ̣n nay , nguy cơ mất an toàn vê ̣ sinh thực phẩm là vấn đề cấp thiết , mang tính thời sự vì tổn thất do mất vê ̣ sinh an toàn thực phẩm rất lớn và không ngừng tăng lên Hâ ̣u quả của mất an toàn vê ̣ sinh thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người , ô nhiễm môi trường… Thi ̣t là thực phẩm giàu dinh dưỡng có nguy cơ mất an toàn vê ̣ sinh thực phẩm ca o viê ̣c tìm kiếm , áp dụng các giải pháp để bảo quản thịt an toàn đã và đang thu hút được sự quan tâm của các doanh nghiệp sản xuất cũng như các nhà khoa học

Mô ̣t số phương pháp bảo quản thông thường hiê ̣n nay đang bảo quả n thi ̣t là: bảo quản lạnh , lạnh đông kết hợp bao gói chân không , dùng tia cực tím ,… Tuy nhiên các phương pháp này tốn năng lượng , chất lượng hóa lý và cảm quan của thực phẩm chưa được bảo đảm Viê ̣c nghiên cứu các chất bảo quản có nguồn gốc sinh ho ̣c , có khả năng ức chế và tiêu diệt vi sinh vật trong quá trình thu hoạch, chế biến và bảo quản thực phẩm nhưng vẫn giữ được các đă ̣c tính , cảm quan ban đầu của sản phẩm rất được quan tâm

Chitosan có thể dễ dàng thu được từ vỏ cua, ghẹ, tôm hùm, hoặc vỏ tôm đồng Đây là những nguồn giàu chitin nhất và là nguồn chủ yếu để chế biến thành chitin và chitosan Chitosan và chitin thường được tách từ vỏ tôm bằng phương pháp hóa học sử dụng NaOH và HCl Việc này có thể gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến chất lượng của chitosan Chế phẩm chitosan tách chiết bằng phương pháp sinh học được quan tâm nhằm thu được chế phẩm ổn định chất lượng và thân thiện với môi trường Mặt khác dịch protein thu được sau xử

lý có thể tận dụng làm thức ăn chăn nuôi gia tăng giá trị sử dụng của phế liệu tôm

16

Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu ứng du ̣ng hợp chất chitosan vào lĩnh vực công nghệ thực phẩm , bảo quản các nguyên liệu thực phẩm bắt nguồn từ thực vâ ̣t, đô ̣ng vâ ̣t, thủy hải sản, kết quả thu được tiết kiê ̣m nguồn năng lượng, bảo vệ môi trường , các sản phẩm thực phẩm tươi ngon , đáp ứng được thi ̣ hiếu của người tiêu dùng Các nghiên cứu đi sâu vào nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vâ ̣t của chitosan cũng được các quốc gia quan tâm, đầu tư rất nhiều với mu ̣c đích hiểu rõ nguyên nhân , cơ chế kháng khuẩn , tìm được hàm lượng thích hợp của chitosan để ứng dụng nhiều hơn trong các lĩnh vực n ói chung và lĩnh vực công nghê ̣ thực phẩm nói riêng

Đề tài này đặt ra mục tiêu 1) đưa ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm chitosan/chitosanoligossacharide (COS) có tính kháng vi sinh vật từ phụ liệu tôm bằng phương pháp sinh học; 2) Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của chế phẩm thu được; 3) Ứng dụng chế phẩm chitosan hoặc COS kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thịt

17

1.1 Đặc điểm của chitin, chitosan và chitooligosaccharide (COS)

1.1.1 Giới thiệu chung

vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitosan và các dẫn xuất của chúng

chitin-Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin

18

hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation)

DD > 75% thì gọi là chitosan, nếu DD < 75% gọi là chitin

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của chitosan

Chitosan oligosaccharide (COS)

Chitosan oligosaccharide (COS) là chitosan phân tử lượng thấp, cấu tạo từ 3 đến

11 đơn vị glucozamin liên kết với nhau thông qua cầu nối β-(1-4)-D- glucozit COS (có mức polime hóa DP thấp) có khả năng hòa tan tốt hơn các chitosan phân tử lượng thấp (LMWC-low molecular weight chitosan) với mức DP cao hơn Nói chung phân tử lượng của COS có thể lên đến 10 kDa Trong quá trình sản xuất COS, độ nhớt được dùng để xác định phân tử lượng trung bình của COS

1.1.2 Tính chất hóa lý của chitosan

Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau ứng với các nguồn chitin khác nhau Khối lượng phân tử chitin trong tự nhiên thường lớn hơn một triệu Daltons trong khi sản phẩm chitosan thương mại có khối lượng phân tử từ 100,000 - 1,200,000 Daltons phụ thuộc vào quá trình xử lý của nhà sản xuất

Trong khi chitin không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, chitosan tan tốt trong các dung dịch axít loãng có pH dưới 6.0 Các axít hữu cơ như axít axetic, formic, và axit lactic được sử dụng để hoà tan chitosan Chitosan cũng tan trong

19

axít hydrochloric 1%, nhưng không hoà tan trong axít sunfuaric và phosphoric

Sự hoà tan của chitosan trong axít vô cơ là có giới hạn pH trên 7.0 làm cho sự hoà tan chitosan khó khăn hơn Tại pH cao, sự kết lắng hoặc sự tạo gel có khuynh hướng xảy ra và dung dịch chitosan ở dạng poly – ion sẽ tạo phức hợp với các ion Cl- kết quả là hình thành gel [2]

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc, cồn, axeton và các dung môi hữu cơ khác nhưng tan trong axit loãng (pH=6) điển hình như tan trong axit acetic loãng tạo thành dung dịch keo Độ nhớt của dung dịch chitosan trong dung dịch keo phụ thuộc và khối lượng phân

tử của chitosan, nguồn gốc và phương pháp điều chế Dung dịch chitosan trong axit có độ nhớt phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitosan (DD%) Độ nhớt của chitosan có DD = 100% là 10800 cm3/g

Mức độ deacetyl ảnh hưởng lớn tới độ hòa tan [4] Chitosan có thể hòa tan

> 95% trong dung dịch axit acetic 1% với nồng độ 0,5%

20

1.1.2.2 Độ nhớt

Cũng như với các mẫu thực phẩm khác, độ nhớt là một yếu tố quan trọng trong việc xác trọng lượng phân tử chitosan và trong việc xác định các ứng dụng thương mại của nó công nghệ sinh học cũng như trong hệ thống thực phẩm Chitosan có trọng lượng phân tử cao hơn thường có độ nhớt cao, mà có thể không được mong muốn để xử lý công nghiệp Tuy nhiên, chitosan có độ nhớt thấp có thể tạo điều kiện thuận lợi cho xử lý dễ dàng

1.1.3 Ứng dụng

Chitin và chitosan có rất nhiều ứng dụng trong thực tế như chất bảo quản trong thực phẩm [5], chất làm trong trong và chống nấm trong nước quả [6], chất kích thích sinh trưởng thực vật và chất hấp phụ [2] Gần đây chitosan còn được dùng như thức ăn kiêng do khả năng hấp phụ chất béo và dầu [7]

Không giống chitosan, COS có thể tan trong nước và hấp thụ dễ dàng bởi ruột, nhanh chóng đi vào máu và có tác động sinh học lên cơ thể [8] Ngoài ra COS còn có nhiều đặc tính sinh học khác như kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm, hoạt tính chống lại sự phát triển của các khối u, hoạt động như một tác nhân miễn dịch và liên kết với các protein kháng bệnh ở các loài thực vật bậc cao [9]

COS được biết có nhiều hoạt tính sinh học như kháng nấm [6, 10], hoạt tính kháng vi khuẩn [11-20], kháng các khối u, bướu [21], tăng cường khả năng miễn dịch [17], và bảo vệ chống lại sự nhiễm trùng và oxi hóa [22-27] Các đặc tính của COS như mức độ polymer hóa (DP) và mức độ axetyl hóa (DA), sự phân bố điện tích và các biến đổi hóa học có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh học của

21

chúng Kích thước phân tử của COS được xem là thông số chính quan trọng liên quan tới hoạt tính sinh học của chúng [9, 14]

1.1.3.1 Đặc tính kháng khuẩn của chitosan và COS

Các nghiên cứu gần đây cho thấy chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của

vi khuẩn hiệu quả Ví dụ, chitosan có khối lượng 470 KDa đã ức chế hiệu quả vi

khuẩn gram dương ngoại trừ Lactbacillus sp., trong khi đó chitosan với khối

lượng là 1,106 KDa thì có hiệu quả đối với vi khuẩn gram âm Chitosan thường

có khả năng kháng khuẩn với các vi khuẩn gram dương (Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B cereus, Staphylococcus aureus, Lactobacillus plantarum, L brevis, and L bulgaris) hiệu quả hơn vi khuẩn gram âm (E.coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhymurium, and Vibrio parahaemolyticus) với nồng độ chitosan là 0,1% [28]

Chitosan đã được phê duyệt như là một phụ gia thực phẩm tại Hàn Quốc

và Nhật Bản tương ứng từ năm 1995 và 1983 Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan ở pH thấp sẽ cao hơn và cho thấy rằng bổ sung của chitosan để các loại thực phẩm có tính axit sẽ tăng cường hiệu quả của nó như là một chất bảo quản

tự nhiên [28]

1.1.3.2 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan

Nhìn chung các kết luận cơ chế chính xác hoạt động kháng khuẩn của chitosan vẫn chưa được công bố rõ ràng , nhưng cơ chế chí nh đã được đề xuất như sau: (1) tương tác giữa các ion tích điê ̣n dương trên các phân tử chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc màng thế bào , thay đổi khả năng thẩm thấu gây r ò rỉ protein và các thành phần khác trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn đến

22

mất khả năng bảo vê ̣, trao đổi chất của tế bào; (2) chitosan đóng vai trò như chất chọn lọc liên kết với các ion kim loa ̣i, sau đó ức chế các chất đô ̣c và sự phát triển của vi khuẩn ; (3) chitosan liên kết với nước , ức chế các enzym khác nhau ; (4) chitosan thâm nhâ ̣p vào bào tương của các vi sinh vâ ̣t và thông qua các liên kết với AND, ngăn cản sự tổng hợp ARN và protein ; (5) Chitosan ta ̣o thành mô ̣t lớp cao phân tử không thấm nước trên bề mă ̣t tế bào làm thay đổi tính thấm của tế bào và ngăn các chất dinh dưỡng vào tế bào; (6) chitosan có thể hấp phu ̣ các điê ̣n tích âm trong tế bào , làm chúng kết dính thành từng mảng , làm nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh vật dẫn đến phá hủy tế bào [29]

1.1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan

Mứ c đô ̣ kháng vi sinh vâ ̣t của chitosan bi ̣ ảnh hưởng bởi các yếu tố bên trong

và bên ngoài như khối lượng phân tử , đô ̣ deacetyl , pH, nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ hòa tan , nguồn gốc và vi sinh vâ ̣t đích Để các ứng du ̣ng của hợp chất chitosan có hiê ̣u quả cần phải nắm rõ các yếu tố này

 Trọng lượng phân tử

Ảnh hưởng của trọng lượng phân tử chitosan đến hoạt động kháng khuẩn đã được nghiên cứu Chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của

chitosan có thể so sánh được tùy thuô ̣c vào vi khuẩn thử nghiê ̣m , điều kiê ̣n thử nghiê ̣m và tro ̣ng lượng phân tử của chitosan, nhưng ngay cả các kết quả thu được không hoàn toàn tương thích, có sự khác biệt Tăng tro ̣ng lượng phân tử dẫn đến

giảm hoạt tính kháng E.coli của chitosan trong một số nghiê n cứu [30] Ngược

lại với kết quả được đề cập ở trên không có sự khác biệt trong hoạt động kháng

khuẩn của chitosan có tro ̣ng lượng phân tử khác nhau đối với E.coli và Bacillus subtilis [13, 30]

bình cho thấy hoạt đông kháng B.circulans tốt hơn là chitooligosaccharides Từ

những kết quả của Shimojoh và Yalpani có thể nhâ ̣n thấy rằng mối quan hê ̣ giữa trọng lượng phân tử của chitosan va tính kháng khuẩn có thể bi ̣ ảnh hưởng bởi các vi sinh vật thử nghiệm Nhiều nhà nghiên cứu đã thông báo rằng hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử Hwang cùng cô ̣ng sự [32] kết luâ ̣n rằng với chitosan tro ̣ng lượng phân tử lớn hơn 30000 Dalton cho

hiê ̣u quả cao nhất diê ̣t khuẩn E.coli từ nghiên cứu của ho ̣ khảo sát trong pha ̣m vi

trọng lượng phân tử chitosan 10000 – 170000 Dalton Jeon [13] cho rằng tro ̣ng lượng phân tử của chitosan rất quan tro ̣ng cho sự ức chế vi sinh vâ ̣t và k ết luận với tro ̣ng lượng phân tử cao hơn 10000 Dalton cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tốt hơn

Rất khó để tìm được mối tương quan rõ ràng giữa hoa ̣t tính kháng khuẩn và trọng lượng phân tử của chitosan Tuy nhiên hoa ̣t tính này giảm so với một trọng lượng phân tử cao nhất đi ̣nh Sự khác biê ̣t giữa kết quả của các nghiên cứu có thể

là so độ deacetyl và trọng lượng phân tử khác nhau của chitosan Viê ̣c đánh giá sự phu ̣ thuô ̣c đòi hỏi phải khảo sát p hạm vi trọng lượng phân tử chitosan rộng với đô ̣ deacetyl là như nhau , điều này gă ̣p phải khó khăn vì chitosan là mô ̣t polymer tự nhiên Như vâ ̣y, khó có thể xác định trọng lượng phân tử tối ưu nhất cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tố t nhất Viê ̣c lựa cho ̣n tro ̣ng lương phân tử của chitosan phu ̣ thuô ̣c vào ứng du ̣ng của nó

24

 Độ deacetyl (DD)

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan tỷ lê ̣ thuâ ̣n với DD của chitosan[33-35] Sự gia tăng DD có nghĩa là số lượng các nhóm amin trên chitosan tăng lên , kết quả là trong môi trường có tính axit làm gia tăng sự tương tác giữa chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật [36] Simpson và các cô ̣ng sự [34] báo cáo rằng chitosan với DD là 92,5% hiệu q uả hơn so với chitosan có DD 85%

 Độ pH

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan bị ảnh hương mạnh mẽ bở i pH [33, 38] pH thấp hơn làm tăng hoạt tính kháng khuẩn được giải thích bới nhiều lí do, ngoài hiệu ứng ức chế vi sinh vật mục tiêu của các axit Tsai và Su [38] kiểm tra

37-hoạt đô ̣ng kháng khuẩn của chitosan (DD 98%) đối với E.coli ở giá trị pH khác

nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 Các hoạt động kháng khuẩn tốt nhất quan sát được

ở pH = 5,0 và chitosan có rất ít hoạt tính kháng khuẩn ở pH = 9,0 Các nhà nghiên cứu khác [33, 37] kết luâ ̣n rằng chitosan không có hoa ̣t tính kháng khuẩn

ở pH = 7,0 do nhóm amin và đô ̣ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém Điều này cho thấy hoa ̣t tính kháng khuẩn còn phu ̣ thuô ̣c bản chất cation của chitosan

 Nhiê ̣t đô ̣

Nhiệt đô ̣ cũng có ảnh hưởng đến hoa ̣t tính kháng khuẩn củ a chitosan Nhiê ̣t

đô ̣ cao hơn 370

C làm tăng cường hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan so với nhiê ̣t

đô ̣ la ̣nh Tuy nhiên, ảnh hưởng lớn nhất về hoạt động kháng khuẩn là môi trường xung quanh Tsai và Su [38] kiểm tra tác đô ̣ng của nhiê ̣t đô ̣ đến hoa ̣t đô ̣ng kháng

E.coli của chitosan Huyền phù tế bào trong đê ̣m phosphat (pH = 6) có chứa chitosan với nồng đô ̣ 150ppm được nuôi ở 4, 15, 25, 370

C trong các khoảng thời

25

gian khác nhau và đi ̣nh lượng số tế bào còn sống sót Các hoạt tính kháng khuẩn được tìm thấy tỷ lê ̣ thuâ ̣n với nhiê ̣t đô ̣ Ở nhiệt độ 25 và 37o

C, các tế bào E.coli

đã hoàn toàn bi ̣ giết chết trong vòng 1 giờ Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn (4 và

150C) số lượng E.coli giảm trong vòng 5h đầu tiên và sau đó ổn đi ̣nh Các tác giả

kết luâ ̣n rằng hoa ̣t đô ̣ng chống vi khuẩn giảm do giảm tỷ lê ̣ tương tác giữa

chitosan và các tế bào ở nhiê ̣t đô ̣ thấp hơn

 Cation và polyanion

Các nhà nghiên cứu đề xuất rằng các cation tạo phức hợp với chitosan và làm giảm số nhóm amin dẫn đến giảm hiệu quả diệt khuẩn của chitosan

1.1.4 Sản xuất Chitin và Chitosan

Chitosan như đã đề cập ở trên được chiết xuất từ chất thải giáp xác vỏ như cua, ghẹ, tôm, tôm hùm Vỏ tôm chứa khoảng 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat, và chitin từ 20-30% hàm lượng chất khô [39] Tỷ lệ phần trăm khác nhau với các loài giáp xác và theo từng mùa [40] Phân tách của chitosan từ vỏ tôm thực hiện qua 4 bước cơ bản: khử khoáng (DM), khử protein (DP), khử màu (DC), và deacetyl hóa (DA) Tuy nhiên, sự phân tách của chitin cụ thể gồm chỉ

có hai bước: khử khoáng (DM) và khử protein (DP), tương ứng với việc loại canxi cacbonat bằng 1,0 N HCl và loại bỏ các protein bằng NaOH 3%

Tuy nhiên trình tự khử khoáng và khử protein có thể được đảo ngược Các quá trình này thường sử dụng hai phương pháp: phương pháp hóa học dùng axit, kiềm và phương pháp sinh học sử dụng các enzyme protease

Sau quá trình khử khoáng và protein của vỏ tôm ta thu được chitin có màu hồng là do sự có mặt của sắc tố astaxanthin Sắc tố này có thể được loại bỏ trong bước khử màu (DC) Sau khi khử màu chitin có màu trắng sáng Chitin thu được