Khả năng kháng vi khuẩn cuả chế phẩm chitosan nghiên cứu

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2.2 Khả năng kháng vi khuẩn cuả chế phẩm chitosan nghiên cứu

3.2.2.1 Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của chế phẩm CA

Nồng độ ƣ́c chế tối thiểu MIC đƣợc đi ̣nh nghĩa là nồng đô ̣ nhỏ nhất của chất kháng khuẩn có thể ức chế sự phát triển của 104

cfu/ml vi sinh vật so với kiểm chƣ́ng [100]. Do thời gian nghiên cứu của đề tài có hạn, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn với chế phẩm chitosan CA nhận đƣợc ban đầu với quy trình chƣa tối ƣu. Chế phẩm Chitosan CA vớ i đô ̣ nhớt 840 cPs, mƣ́c deaxetyl hóa DDA 95%. Chúng tôi đã tiến hành khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn của chế phẩm CA ở nồng độ khác nhau nhằm tìm ra nồng độ ức chế nhỏ nhất. Kết quả thể hiện ở bảng sau

Bảng 3.2.1. Khả năng kháng vi khuẩn của chitosan ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ chế phẩm (ppm) 4000 2000 1000 500 250 125 62,5 31,25 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028™ + + - - - - Escherichia coli ATCC 25922 + + + + + + - - B. subtilis ATCC® 11774™ - - - - Bacillus sp. + + + + + - - - Staphylococcus aureus Phillip + + + + + - - -

110

+: không xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn khi chang trên đĩa thạch; -: có khuẩn lạc vi khuẩn chang trên đĩa thạch

Kết quả cho thấy nồng độ ức chế nhỏ nhất của chế phẩm nghiên cứu có khác nhau đối với loại vi khuẩn khác nhau, thậm chí khác nhau trong cùng một giống vi khuẩn (Bacillus). Nhƣ vậy, nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chế phẩm đối với Salmonella là 2000 ppm. Nồng độ này cao hơn khá nhiều so với MIC của E. coli (125 ppm). Nhƣ vậy chế phẩm thu đƣợc có hiệu quả hơn đối với E. coli. Chế phẩm không có biểu hiện kháng chủng Bacillus subtilis ATCC® 11774™ thử nghiệm, tuy nhiên đối với chủng Bacillus sp. phân lập từ thực phẩm, chế phẩm chitosan có biểu hiện khả năng kháng từ nồng độ 250 ppm. Tƣơng tự nhƣ vậy,

S. aureus Phillip bị tiêu diệt hoàn toàn tại nồng độ chitosan 250 ppm.

Trong các nghiên cứu khác nhau cho thấy khả năng kháng vi sinh vật phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử hay độ nhớt của chế phẩm. Chúng tôi tiến hành đi sâu nghiên cứu hơn tác dụng của các chitosan phân tử lƣợng khác nhau lên sự phát triển của vi khuẩn E. coli

3.2.2.2 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan đến hoạt tính kháng E.coli

Chế phẩm CA đƣợc nghiên cứu cùng với 3 chế phẩm thƣơng mại HMWC, MMWC và LMWC với khối lƣợng phân tử, độ nhớt khác nhau (phần vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu).

Tiến hành thí nghiê ̣m với dải nồng đô ̣ là 1200; 600; 300; 150; 120; 75; 60; 50; 37,5; 30; 25; 20 ppm của từng chế phẩm chitosan , kết quả cho thấy cả 4 chế phẩm đều có khả năn g kháng E.coli, nồng độ ƣ́c chế tối thiểu của các chế phẩm đối với E.coli đƣợc thể hiện trong bảng 3.1.2. Trong nghiên cƣ́u của Lin Jiang

111 [101], xác định đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu của 5 loại chitosan đối với E. coli

nằm trong khoảng 30 – 16000 ppm, khoảng trọng lƣợng phân tử sử dụng trong nghiên cƣ́u của chúng tôi nằm trong kho ảng trọng lƣợng phân tử đƣợc nghiên cƣ́u bởi Lin Jiang tƣ̀ 43-1100 kDa, nhƣ vâ ̣y kết quả chúng tôi thu đƣợc khá phù hợp với nghiên cƣ́u này

Bảng 3.1.2. Nồng độ ức chế tối thiểu của các chế phẩm chitosan đối với E.coli

Tên chế phẩm HMWC MMWC LMWC CA

Nồng đô ̣ ƣ́c chế

tối thiểu (ppm) 75 50 30 75

Tiến hành theo dõi khả năng ức chế E. coli của các chế phẩm chitosan theo thời gian với các nồng độ ban đầu khác nhau (75, 150, 300 và 600 ppm) với kiểm chứng là dung dịch đệm axetat. Kết quả thí nghiê ̣m cho thấy trong khi tế bào E.coli tiếp tục sinh trƣởng trong môi trƣờng kiểm chƣ́ng là đê ̣m acetat thì trong môi trƣờng chƣ́a HMWC ở nồng đô ̣ ƣ́c chế tố i thiểu 75ppm, E.coli bị ức chế trong khoảng 4h đầu , sau đó la ̣i tiếp tu ̣c phát triển trở la ̣i . Vớ i nồng đô ̣ 300ppm (4×MIC), số lƣợng tế bào sống sót giảm dần theo thời gian , đến 24h thì

E.coli bị tiêu diệt hoàn toàn.

Trong môi trƣờ ng chƣ́a MMWC ở nồng đô ̣ ƣ́c chế tối thiểu 50 ppm, E.coli bị ức chế trong khoảng 4h đầu, sau đó la ̣i tiếp tu ̣c phát triển trở la ̣i . Với nồng đô ̣ 300ppm (6×MIC), số lƣợng tế bào sống sót giảm dần theo thời gian , đến 12h

E.coli bị tiêu diệt hoàn toàn . Kết quả này khá phù hợp với nghiên cƣ́u của Liu [102], chitosan A có khối lƣợng phân tƣ̉ 155 kDa gần vớ i khối lƣợng của

112 MMWC, ở nồng độ 200 ppm E.coli bị ức chế , vớ i nồng đô ̣ 500 ppm E. coli bị tiêu diê ̣t.

Hình 3.2.6. Khả năng kháng E.coli củ a các chế phẩm chitosan theo thời gian

Trong môi trƣờ ng chƣ́a LMWC ở nồng đô ̣ ƣ́c chế tối thiểu 30ppm, E.coli bị ức chế trong khoảng 4h đầu , sau đó la ̣i tiếp tu ̣c phát triển trở la ̣i . Vớ i nồng đô ̣ 240ppm (8× MIC ), số lƣợng tế bào sống sót giảm dần theo thời gian , đến 20h

E.coli bị tiêu diệt hoàn toàn và không phát triển lại sau ít nhất 72h, đây có thể coi là nồng độ diệt khuẩn của LMWC đối với E.coli. Kết quả này k há phù hợp với nghiên cƣ́u của Lê Thanh Hà và cô ̣ng sƣ̣ [103] với nồng đô ̣ 380 ppm LMWC có khả năng ức chế hoàn toàn E.coli ngay tƣ̀ 2 giờ đầu tiên và hiê ̣u quả ít nhất trong 48h thƣ̉ nghiê ̣m. Tuy nhiên trong nghiên cƣ́u của chúng tôi sau 4 giờ đầu mâ ̣t đô ̣

113 Điều này có thể do sƣ̣ khác nhau về nồng đô ̣ LMWC sƣ̉ du ̣ng. Khi chúng tôi tăng nồng đô ̣ LMWC lên tới 500 ppm, E.coli đã bi ̣ tiêu diê ̣t ngay sau 4 giờ thƣ̉ nghiê ̣m.

Trong môi trƣờng ch ứa CA ở nồng đô ̣ ƣ́c chế tối thiểu 75ppm, E.coli bị ức chế trong khoảng 8h đầu, sau đó la ̣i tiếp tu ̣c phát triển trở la ̣i . Với nồng đô ̣ 300ppm (4× MIC ), số lƣợng tế bào sống sót giảm dần theo thời gian , đến 24h E.coli bị tiêu diê ̣t hoàn toàn. Nhƣ vậy trong 4 chế phẩm nghiên cứu, chế phẩm LMWC có khả năng kháng E. coli tốt nhất. Chế phẩm chitosan CA có độ nhớt cao , gần giống chế phẩm HMWC , tính kháng khuẩn tƣơng đƣơng với chế phẩm thƣơng mại HMWC. Để có thể ƣ́ng du ̣ng tốt hơn trong bảo quản thƣ̣c phẩm , chế phẩm này cần đƣợc tiến hành chuyển hóa tiếp để thu đƣợc chitosan có khối lƣợng phân tƣ̉ thấp hơn có khả năng kháng khuẩn tốt hơn.

3.2.2.3 Lựa chọn chế phẩm chitosan/COS có tính kháng E. coli tốt

Với kết quả thu đƣợc ở phần sản xuất các chế phẩm chitosan độ nhớt 13; 21 cPs và COS độ nhớt 5 cPs, chúng tôi tiến hành thử nghiệm các chế phẩm này bằng cách nuôi cùng E. coli trong môi trƣờng lỏng, sau 24h định lƣợng lại vi khuẩn E. coli, đối chứng là dung dịch đệm và dịch LMWC (độ nhớt 20 cPs). Kết quả thể hiện ở bảng 3.2.3.

Kết quả cho thấy chế phẩm chitosan có độ nhớt 21 cPs và chế phẩm chitosan thƣơng mại LMWC (20 cPs) có tác dụng tốt nhất. Chế phẩm chitosan đã nghiên cứu CA có khả năng tiêu diệt hoàn toàn E. coli sau 24 h. Khá ngạc nhiên là chitosan độ nhớt thấp hơn (13 cPs) và chế phẩm COS (độ nhớt 5 cPs) lại kháng

114 sau 24h tiếp xúc. Cơ chế kháng vi sinh vật của các chế phẩm chitosan cần đƣợc nghiên cứu thêm. Chúng tôi lựa chọn chế phẩm chitosan có độ nhớt 21 cPs cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Bảng 3.2.3. Mật độ vi khuẩn E. coli theo thời gian (log cfu/ml) sau khi tiếp xúc với các chế phẩm chitosan/COS

Các loại chế phẩm

Mật độ E. coli ban đầu 7 log cfu/ml

Mật độ E. coli ban đầu 5 log cfu/ml

4h 24h 4h 24h Dung dịch đệm 9,1 9,5 6,1 9,0 LMWC 0 0 0 0 COS 5 cPs 9,1 9,5 5,5 9,3 Chitosan 13 cPs 0 3,97 1,6 1 Chitosan 21 cPs 0 0 0 0 Chitosan CA 3,1 0 1,5 0

3.3 Nghiên cứu quy trình công nghệ bảo quản thịt bằng chế phẩm chitosan kháng vi sinh vật

3.3.1 Khảo sát đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu thịt

Tiến hành thu mua nguyên liệu thịt (lợn, bò, gà) tại các cơ sở giết mổ, siêu thị, chợ cóc trên địa bàn thành phố Hà Nội (theo phƣơng pháp thực nghiệm).

115 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh vật các mẫu nguyên liệu thịt đƣợc xử lý thống kê bằng phẩm mềm SPSS, so sánh trung bình các giá trị của các điểm lấy mẫu theo Oneway ANOVA.

Thịt lợn là nguồn nguyên liệu thịt chiếm chủ yếu ở Việt Nam (hơn 75%), việc thu mua khảo sát nguyên liệu thịt lợn đƣợc thực hiện tại: 03 cơ sở giết mổ ở ở khu vực ngoại thành Hà Nội (Từ Liêm, Thanh Trì), 02 siêu thị lớn và 03 các chợ cóc trong khu vực nội thành Hà Nội. Kết quả đƣợc thể hiện ở các bảng 3.3.1:

Bảng 3.3.1: Chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu thịt lợn tại các điểm lấy mẫu khác nhau

Chỉ tiêu Cơ sở giết mổ Siêu thị Các chợ

pH 5,82a ± 0.07 5,87a ± 0.06 5,96a ± 0.09 NH3 (mg/100g mẫu) 25,23a ± 0.71 25,32ab ± 0.70 26,72b ± 0.67 Khả năng giữ nƣớc (diện

tích vùng loang)-(cm2) 0,98a ± 0.09 1,15ab ± 0.08 1,28b ± 0.12 VSV tổng số (logCFU/g) 5,09a ± 0.1 5,15b ± 0.20 5,43c ± 0.15 S.aureus (logCFU/g) 3,10a ± 0.09 3,24b ± 0.05 3,56c ± 0.08 Enterobacteriacea (logCFU/g) 4,10a ± 0.11 4,24b ± 0.10 4,47c ± 0.12

Sơ bộ đánh giá cho thấy các chỉ tiêu hóa lý nguyên liệu thịt lợn ngay sau khi thu mua tại các địa điểm nói chung đều đáp ứng tiêu chuẩn TCVN 7046- 2002, tuy vậy các chỉ tiêu vi sinh vật đều vƣợt ngƣỡng cho phép theo tiêu chuẩn này ở mức độ ít nhiều. Ô nhiễm ít nhất với các mẫu tại các cơ sở giết mổ, rồi đến các siêu thị, còn ở các chợ cóc sự ô nhiễm là cao nhất. Điều này có thể đƣợc giải thích là do chợ cóc là địa điểm cuối cùng trong chuỗi cung ứng nguyên liệu thịt

116 hiện tại nên có thời gian tiếp xúc với môi trƣờng xung quanh dài nhất mà không có bất cứ một phƣơng pháp bảo quản nào, và đây chính là nguyên nhân gây nguy cơ mất VSATTP cho ngƣời tiêu dùng.

Với các mẫu thịt bò do sản lƣợng thịt bò ít hơn thịt lợn rất nhiều (chiếm khoảng 10%) nên đƣợc thu mua khảo sát tại 02 cơ sở giết mổ ở khu vực Mai Động và Gia Lâm, 02 siêu thị lớn và 03 chợ cóc trong khu vực nội thành Hà Nội. Kết quả đánh giá chất lƣợng thịt bò đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.2:

Bảng 3.3.2: Chất lượng nguyên liệu thịt bò tại các điểm lấy mẫu khác nhau

Chỉ tiêu Cơ sở giết

mổ Siêu thị Các chợ

pH 6,12a ± 0.04 6,12a ± 0.05 6,19b ± 0.05 NH3 (mg/100g mẫu) 26,7a ± 0.72 27,1a ± 0.80 28,6b ± 0.70 Khả năng giữ nƣớc (Diện

tích vùng loang, cm2 ) 1,02 a ± 0.06 1,09a ± 0.09 1,13a ± 0.07 VSV tổng số (logCFU/g) 5,17a ± 0.08 5,25b ± 0.09 5,56c ± 0.06 S.aureus (logCFU/g) 3,16a ± 0.05 3,37b ± 0.06 3,56c ± 0.07 Enterobacteriacea (logCFU/g) 4,17 a ± 0.07 4,35b ± 0.08 4,58c ± 0.06 Kết quả cho thấy chất lƣợng thịt bò có sự tƣơng đồng với thịt lợn, các chỉ tiêu hóa lý tƣơng đối đạt theo tiêu chuẩn TCVN-7046-2002, các chỉ tiêu vi sinh vật có sự ô nhiễm cao hơn so với thịt lợn và cũng thấp nhất ở cơ sở giết mổ và cao nhất ở các chợ cóc.

Tình trạng giết mổ thịt gia cầm có khác đôi chút so với hai nguồn nguyên liệu thịt lợn và bò, do khối lƣợng nhỏ nên gia cầm có thể đƣợc giết mổ ở khắp

117 mọi nơi, số có sở giết mổ tập trung gia cầm chƣa có nhiều, do vậy việc thu mua khảo sát lấy mẫu thịt gà đƣợc thực hiện tại 01 cơ sở giết mổ tập trung (Hà Đông), 02 siệu thị lớn và 03 chợ cóc trong khu vực nội thành Hà Nội. Kết quả đánh giá chất lƣợng thịt gà đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.3:

Bảng 3.3.3: Chất lượng nguyên liệu thịt gà tại các điểm lấy mẫu khác nhau

Chỉ tiêu Cơ sở giết

mổ Siêu thị Các chợ

pH 5,82a ± 0.05 5,84a ± 0.07 5,87a ± 0.09 NH3 (mg/100g mẫu) 24,8a ± 0.56 25,34ab ± 0.54 25,58b ± 0.60 Khả năng giữ nƣớc (Diện

tích vùng loang (cm2) 1,34 a ± 0.05 1,39ab ± 0.04 1,42b ± 0.07 VSV tổng số (logCFU/g) 4,96a ± 0.04 5,18b ± 0.07 5,29c ± 0.07 S.aureus (logCFU/g) 2,89a ± 0.07 2.96b ± 0.03 3,16c ± 0.04 Enterobacteriacea (logCFU/g) 3,98 a ± 0.05 4,18b ± 0.02 4,36c ± 0.05

a, b, c: Nhóm có cùng ký hiệu a hoặc b hoặc c là có trung bình giống nhau. Và ngược lại, các nhóm không có ký hiệu nào giống nhau thì có trung bình khác nhau.(Ví dụ: như bảng 3 ở trên, giá trị pH trung bình ở các điểm lấy mẫu (cơ sở giết mổ, siêu thị, chợ cóc) là như nhau. Về giá

trị trung bình của VSV tổng số là khác nhau.)

Với ba mẫu thịt lợn, bò, gà trung bình các chỉ tiêu về vi sinh vật ở ba điểm lấy mẫu là khác nhau. Các chỉ tiêu hóa lý của nguyên liệu tại cơ sở và siêu thị và chợ cóc đa phần là khác nhau. Các chỉ tiêu VSATTP tại chợ cóc là lớn nhất, sau đó tới siêu thị, cuối cùng là cơ sở.

118 Sau khi tiến hành khảo sát những nguyên liệu mua về để tiến hành quá trình bảo quản có thể thấy :

- Các chỉ tiêu về hóa lý nhƣ pH, NH3, khả năng giữ nƣớc đểu ở mức cho phép. - Các chỉ tiêu về vi sinh vật hầu hết đều vƣợt ngƣỡng cho phép ở mức độ khác nhau giữa các địa điểm thu mua và giữa các loại nguyên liệu thịt. Kết quả sơ bộ cho thấy mức độ ô nhiễm vi sinh vật ở các cơ sở giết mổ < siêu thị < chợ cóc. Và ở thịt gà ô nhiễm vi sinh vật < thịt lợn < thịt bò.

 Điều này có thề lý giải bởi do hiện tại hầu hết quá trình giết mổ, vận chuyển gia súc, gia cầm tại Hà Nội cũng nhƣ cả nƣớc hầu hết vẫn rất thủ công, việc kiểm soát thú y mới chỉ đáp ứng đƣợc từ 30-70% tùy từng thành phố và địa phƣơng. Thịt vẫn chủ yếu đƣợc tiêu thụ dƣới dạng tƣơi nóng và đƣợc bày bán thủ công tại các chợ, thời gian bảo quản ngắn (trong ngày) nên việc ô nhiễm vi sinh vật là không tránh khỏi và nguy cơ gây mất ATVSTP cho ngƣời tiêu dùng là rất cao. Chính vì vậy việc nghiên cứu tìm ra phƣơng pháp kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thịt đảm bảo VSATTP là rất cần thiết.

3.3.2 Lựa chọn phương pháp xử lý và nồng độ chế phẩm chitosan kháng khuẩn thích hợp trong bảo quản 3 loại thịt

3.3.2.1 Lựa chọn phương pháp xử lý

Chuẩn bị dung dịch xử lý bảo quản nguyên liệu thịt gồm chitosan 1% pha trong đệm axetat có pH 5,5 và tiến hành xử lý bảo quản nguyên liệu thịt bằng 2 phƣơng pháp:

119 - Phun sƣơng lên toàn bộ bề mặt nguyên liệu thịt bằng thiết bị áp lực với 2 áp lực phun là 4 và 5,4 kg/cm2, liều lƣợng 20 ml dung dịch/1kg thịt.

- Nhúng toàn bộ nguyên liệu thịt trong dung dịch phun với tỷ lệ 1kg nguyên liệu thịt/1 lít dung dịch bảo quản.

Kết quả đánh giá chỉ tiêu hóa lý các mẫu nguyên liệu thịt theo các phƣơng pháp xử lý khác nhau đƣợc thể hiện ở hình:

Hình 3.3.15: Chỉ tiêu hóa lý các mẫu nguyên liệu thịt được xử lý bằng các phương pháp khác nhau

Kết quả cho thấy với phƣơng pháp phun sƣơng có tác dụng bảo quản tốt hơn phƣơng pháp nhúng qua tất cả các chỉ tiêu hóa lý, mẫu phun sƣơng với áp lực phun 5,4 kg/cm2 có kết quả bảo quản tốt nhất. Kết hợp với đánh giá cảm quan cho thấy với mẫu nhúng có sự thấm dịch khá ƣớt, màu sắc không có màu đỏ hồng tƣơi đặc trƣng mô cơ, ngay sau nhúng và sau quá trình bảo quản có sự chảy

120 dịch khá nhiều. Để thể hiện rõ rệt hơn nữa hiệu quả của các phƣơng pháp xử lý,