3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.2Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan có độ deaxetyl hóa và phân tử
khác nhau
3.1.2.1 Ảnh hưởng của nguồn chitin đến khả năng deaxetyl hóa
Chitin thu đƣợc từ 3 loại vỏ tôm khác nhau (bảng 3.1.13) cùng deaxetyl trong một điều kiện: NaOH 40%, thời gian 24h, tỷ lệ 1:15 (w/v), nhiệt độ 70oC.
89
Bảng 3.1.13. Đặc tính chitosan
Mẫu chitin Đặc tính Độ deacetyl (%)
Tôm thẻ Màu hơi xám, tan tốt trong axit acetic
1%, độ nhớt khá cao 79
Tôm sắt Màu hơi xám, tan tốt trong axit acetic
1%, độ nhớt khá cao 83
Tôm sú Màu hơi xám, tan tốt trong axit acetic
1%, độ nhớt khá cao 84
Kết quả bảng 3.1.13 cho thấy tại điều kiện sử dụng này nguồn chitin cũng nhƣ chất lƣợng của chitin ít có ảnh hƣởng đến khả năng deaxetyl hóa và sau 24h tất cả chitosan thu đƣợc đều có độ deaxetyl nằm trong khoảng thƣờng thấy của quá trình deaxetyl hóa là từ 75-85%.
3.1.2.2 Ảnh hưởngcủa thời gian và nhiệt độ đến độ deaxetyl
Nhiệt độ và thời gian có ảnh hƣởng đến khả năng deaxetyl của chitin và ảnh hƣởng đến chất lƣợng của chitosan thu đƣợc. Theo nhiều nghiên cứu trƣớc đây, quá trình deaxetyl thƣờng đƣợc thực hiện tại nhiệt độ cao từ 90 – 110o
C, chitosan thu đƣợc thƣờng có độ deaxetyl cao trên 90%. Kết quả deaxetyl đối với tôm sú đƣợc biểu diễn trên hình 4.1.
90
Hình 3.1.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến độ deaxetyl DDA.
Quá trình deaxetyl chitin diễn ra tại nhiệt độ 30oC (), 50oC (), 70oC (), 100oC () và 121oC () bằng NaOH 40% với tỉ lệ 1:15
Theo kết quả trên hình 3.1.15. có thể thấy rằng nhiệt độ deaxetyl càng cao thì quá trình deaxetyl diễn ra càng nhanh thể hiện ở độ dốc của đƣờng càng cao. Quá trình deaxetyl ở nhiệt độ 30o
C chỉ đạt độ DDA 73% sau 4 ngày. Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trƣớc là tại nhiệt độ thấp 30oC độ DDA chỉ đạt đƣợc 72% sau 7 ngày [92]. Theo nghiên cứu khác độ DDA tại 40o
C sau 7 ngày cũng chỉ đạt đƣợc 80% [93]. Tại nhiệt độ 50o
C và 70oC quá trình deaxetyl diễn ra nhanh hơn và độ deaxetyl cũng đạt đƣợc cao hơn, cụ thể là tại 50oC sau 1 ngày đã có thể đạt DDA 83% còn tại 70oC sau 16h đã đạt 91%, tại 100oC sau 4h đã đạt 99% và tại 121o
C chỉ sau 20 phút đã đạt 97%. Nhƣ vậy kết quả thu đƣợc tại hình 3.1.15 hoàn toàn phù hợp với các kết quả đã công bố trƣớc đây. Màu sắc các mẫu chitosan thu đƣợc tại các nhiệt độ deaxetyl khác nhau đƣơc mô tả trên bảng 3.1.14.
91
Bảng 3.1.14. Ảnh hưởng của nhiệt độ deaxetyl đến màu sắc chitosan
Nhiệt độ deaxetyl (oC) Màu sắc
30oC Màu trắng đục, độ xốp cao
50oC Màu trắng ngà, độ xốp cao
70oC Màu hơi vàng, độ xốp cao
100 oC Màu vàng, độ xốp rất cao
121 oC Màu vàng, độ xốp rất cao
Kết quả từ hình 3.1.15 và bảng 3.1.14 cho thấy nhiệt độ deaxetyl cao sẽ rút ngắn thời gian deaxetyl và cho độ DDA cao hơn. Tuy nhiên nhiệt độ cao làm cho chitin có màu ngả vàng (bảng 3.1.14). Hơn nữa nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng tại nhiệt độ cao độ nhớt của chitin sẽ giảm [94].
3.1.2.3 Quá trình deaxetyl 2 giai đoạn
Với mục đích thu chitosan có độ deaxetyl cao, chúng tôi tiến hành deaxetyl theo 3 qui trình với NaOH 40% tỷ lệ 1:15 (w/v)
Qui trình 1: deaxetyl chitin tại 30oC trong 4 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70o
C trong 24h
Qui trình 2: deaxetyl chitin tại 50oC trong 1 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70o
C trong 24h
Qui trình 3: deaxetyl chitin tại 70oC trong 1 ngày và định mức lại bằng NaOH bù chỗ bay hơi và tiến hành deaxetyl tiếp trong 24h
Qui trình 4: deaxetyl chitin tại 121oC trong 20 phút 2 lần
Kết quả độ DDA đƣợc biểu diễn trên hình 3.1.16 cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt về độ deaxetyl của các mẫu chitin trong một qui trình cũng nhƣ giữa các
92 qui trình khác nhau. Độ deaxetyl của các mẫu đều khá cao trên 85% trừ mẫu chitin tôm thẻ theo qui trình 1 đạt gần 81%. Riêng mẫu deaxetyl tại 121oC cho độ deaxetyl khá cao 97%.
Hình 3.1.16. Ảnh hưởng của qui trình deaxetyl đến DDA. 1-chitin từ tôm thẻ; 2- chitin từ tôm sắt; 3- chitin từ tôm sú
Các mẫu chitin từ tôm sú theo 3 qui trình đƣợc đem xác định độ nhớt theo phƣơng pháp mô tả trong mục vật liệu và phƣơng pháp. Kết quả độ nhớt đƣợc thể hiện trên bảng 3.1.15
Bảng 3.1.15. Ảnh hưởng qui trình deaxetyl đến độ nhớt chitosan
Qui trình Tổng thời gian (h) Độ nhớt (cPs)
1 120 13
2 48 21
3 48 42
93 Nhƣ vậy độ nhớt của chitosan ở qui trình 3 cao hơn qui trình 2 và 1. Mặc dù nhiệt độ ở qui trình 3 cao hơn nhƣng do thời gian xử lí ngắn hơn nên dƣới tác dụng đồng thời của cả 2 yếu tố nhiệt độ và thời gian độ nhớt ở qui trình 3 là cao nhất. Hơn nữa theo quan sát của chúng tôi thì chitosan thu đƣợc ở qui trình 3 hòa tan dễ dàng trong 1% axit axetic hơn chitosan thu đƣợc theo qui trình 1 và 2. Còn theo qui trình 4 do nhiệt độ cao đã làm phân cắt chitosan nên độ nhớt lại giảm. Các mẫu chitosan có độ nhớt khác nhau thu đƣợc sẽ đƣợc xác định khả năng kháng vi sinh vật ở các nội dung tiếp theo.
3.1.3 Nghiên cứu tạo chế phẩm COS bằng phương pháp sinh học
3.1.3.1 Lựa chọn chế phẩm enzym thương mại cho quá trình thủy phân chitosan
Bên cạnh các enzym đặc hiệu nhƣ chitinase, chitosanase và lysozym, chitosan cũng có thể đƣợc thủy phân bởi một số enzym không đặc hiệu nhƣ cellulase, protease, lipase và pepsin. Trong phạm vi đề tài này chúng tôi sử dụng ba loại enzym thƣơng mại: celluclast, pepsin, papain để thử hoạt tính chitosanase.
Để so sánh khả năng thủy phân chitosan của các enzym trên chúng tôi đã tiến hành thủy phân chitosan 1% trong điều kiện tối ƣu cho từng loại enzym theo các tài liệu đã công bố [64]. Chế phẩm celluclast thủy phân chitosan trong điều kiện 50oC, pH=5.0, tỷ lệ enzym : cơ chất là 0.5% (v/v); enzym pepsin ở 40oC, pH=4.5, tỷ lệ enzym : cơ chất là 0.5% (w/v); enzym papain trong điều kiện 50oC, pH=5.0, tỷ lệ enzym : cơ chất là 0.5% (w/v). Thực hiện thủy phân trong điều kiện có khuấy 250 vòng/phút. Khả năng thủy phân chitosan của các chế phẩm thể hiện ở lƣợng đƣờng khử tạo thành và sắc ký đồ các sản phẩm tạo thành. Kết quả cụ thể đƣợc trình bày kỹ hơn trong chuyên đề 3 của đề tài. Kết quả thu đƣợc
94 trên đây cho thấy chế phẩm celluclast có khả năng thủy phân chitosan tạo COS với hiệu suất cao hơn và phổ sản phẩm tạo thành có độ polimer hóa DP từ 2-6 là các COS mong muốn nên sẽ đƣợc lựa chọn để tối ƣu điều kiện thủy phân.
3.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân chitosan của chế phẩm Celluclast 1.5L
Ảnh hƣởng của các yếu tố pH, nhiệt độ, thời gian và tỷ lệ enzyme/ cơ chất (E/S) lên quá trình thủy phân chitosan đã đƣợc nghiên và tối ƣu hóa điều kiện thủy phân. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: điều kiện thủy phân tối ƣu là nhiệt độ 50oC, pH6, chitosan nồng độ 1.5% và tỉ lệ E/S là 1 trong thời gian 8h. Sau đó sản phẩm đƣợc sấy thu COS dạng bột bằng phƣơng pháp đông khô. Sản phẩm thu đƣợc đƣợc kiểm tra phổ sản phẩm và các thông số hóa lý.
Kết quả sắc kí bản mỏng trên hình 3.1.24 cho thấy sản phẩm có chứa các dimer, trimer, tetramer, pentamer, hexamer và cao hơn nữa.
Hình 3.1.24. Kiểm tra phổ sản phẩm của sản phẩm COS.
Mẫu 1: D-Glucosamin chuẩn, mẫu 2- COS chuẩn (Hàn Quốc), mẫu 3: Celluclast 1.5L,
95
Bảng 3.1.16. Đặc tính sản phẩm COS
Thông số Giá trị Trọng lƣợng phân tử 3600 Da Độ ẩm 9.77% Độ nhớt 5cPs Hàm lƣợng monomer 4.91% Protein dƣ 0.9% Tro dƣ 1.86%
3.1.4 Quy trình sản xuất chitosan
Sau khi nghiên cứu lựa chọn, tối ƣu hóa, quy trình sản xuất chitosan có hoạt tính kháng khuẩn đƣa ra nhƣ sau (Hình 3.1.25)
Thuyết minh quy trình (Quy mô 200 kg phế liệu tôm/mẻ)
1) Nguyên liệu phế liệu tôm
Thu gom đầu, vỏ tôm từ các nhà máy chế biến thủy sản. Kiểm tra chất lƣợng phế liệu bao gồm độ ẩm theo phƣơng pháp sấy đến trọng lƣợng không đổi, hàm lƣợng protein tính theo hàm lƣợng chất khô theo phƣơng pháp Biuret. Độ ẩm của PLT thƣờng vào khoảng 70-80% và hàm lƣợng protein dao động khá lớn vào khoảng 22-51%. Với độ ẩm 76% và hàm lƣợng protein 46% thì
96 lƣợng protein trong 1 kg PLT là 0.11 kg.
2) Rửa
Dùng nƣớc sạch để rửa loại bỏ bẩn nhƣ cát và rác bằng rổ và rá
3) Xay
Tiến hành xay PLT bằng máy xay thịt với lỗ lƣới φ=10 cm
4) Thủy phân
Trộn với nƣớc sạch theo tỉ lệ 1:1 (1kg PLT/1L nƣớc). Cho chế phẩm enzym Alcalase (chế phẩm hãng Novo với hoạt độ 2.4 AU/g) với liều lƣợng enzyme 60 AU/kg protein. Đối với 1kg PLT với độ ẩm 76% và hàm lƣợng protein 46% thì cần 33 AU tức là 1,375 g chế phẩm. Giữ trong thời gian thủy phân 165 phút.
5) Tiến hành tách hỗn hợp bã sau thủy phân.
Tách dịch thủy phân ra khỏi bã vỏ tôm bằng lƣới mắt sàng 5X5 mm. Lấy bã vỏ tôm để sản xuất chitin bằng lên men lactic
97
Hình 3.1.25 : Quy trình sản xuất chitosan
Alcalase [ T y p e a q
98
6) Chuẩn bị giống
L. plantarium NCDN4 đƣợc hoạt hóa trên môi trƣờng MRS lỏng có thành phần nhƣ sau (Pepton 1%, cao thịt 1%, cao nấm men 0.5%, CH3COONa 0.5%, K2HPO4 0.2%, (NH4)2C6H5O7 0.2%, Tween 80 0.1%, MgSO4.7H2O 0.01%, MnSO4.4H2O 0.005%) trong thời gian 20h, OD giống đạt vào khoảng 7. Cứ 1 kg PLT cần 0.2 L giống (tỉ lệ 20%).
7) Chuẩn bị dịch đƣờng glucose
Glucose đƣợc pha với nƣớc sạch với nồng độ 12.5% có nghĩa là 100 Lit nƣớc cần 12.5 kg đƣờng glucose.
8) Lên men
Đổ dịch glucose 12.5% vào bã chitin. Cứ 1 kg PLT ban đầu đƣợc trộn với 0.2L dịch đƣờng 12.5%. Điều chỉnh pH của hỗn hợp đến 6 bằng axit axetic và bổ sung 2% NaCl (w/w). Cấy giống vào theo tỉ lệ 20% (v/w) khuấy đảo cho đều và dùng nilon bịt kín thùng lại. Giữ trong thời gian 4 ngày.
9) Tách bã chitin
Tách bã chitin bằng lƣới kích thƣớc mắt lƣới 5x5 mm
10) Rửa bã chitin
Dùng lƣới vớt chitin đã loại protein ra và rửa sạch bằng nƣớc tới khi pH nƣớc rửa bằng 7
99 11) Deaxetyl hóa chitin
Tiến hành deaxetyl chitin bằng NaOH 40% ở nhiệt độ 121oC trong khoảng 20 phút với thời gian tăng nhiệt và hạ nhiệt tổng là 3h, tỉ lệ NaOH10%/bã chitin là 10/1.
12) Rửa
Chitin sau deaxetyl hóa đạt mức deaxetyl khoảng 85-90% đƣợc đem rửa bằng nƣớc đến khi khi pH nƣớc rửa bằng 7
13) Sấy khô
Tiến hành sấy chitosan đến khô
14) Ngâm nƣớc 80o
C
Ngâm bã chitin sau khi làm sạch trong nƣớc 80oC để lắng các cặn còn bám trên bã chitin. Sau đó vớt chitin bằng rây để loại cặn.
15) Hòa tan trong axit axetic
Hòa chitosan trong axit axetic 1% theo tỉ lệ 1% đến khi tan hết.
16) Kết tủa chitosan
Dùng NaOH 10% để kết tủa chitosan đến khi pH dịch bằng 8.
17) Li tâm
Li tâm liên tục tuần hoàn ở điều kiện tốc độ bơm dịch vào là 0.5 bar với thời gian là 20 phút cho 10 Lít dịch
18) Sấy
100 Sơ bộ đánh giá hiệu quả kinh tế của quy trình thu nhận chitosan phần sử dụng phƣơng pháp sinh học thu nhận chitin nhƣ sau
Bảng 3.1.17. Sơ bộ đánh hiệu quả kinh tế của quy trình
(từ bƣớc 1 đến bƣớc 12)
STT Quy trình Thời gian
Yêu cầu nguyên liệu và thiết bị cho 1 tấn tôm phế liệu (thu 30 kg sản phẩm) Chi phí cho 1kg sản phẩm (chƣa kể khấu hao thiết bị), VND Khả năng thu hồi protein Chi phí môi trƣờng, VND/ 1kg sản phẩm 1 Sinh học 5 ngày 25kg đƣờng 200 kg giống 1,3 L Alcalase 40 kg NaOH 432 000 Có mùi thơm lactic, có thể thu hồi làm thức ăn gia súc - 2 Hóa học 1-2 ngày NaOH, HCl 80 000 Không thu hồi 120 000
Giá thành cho chitin bằng phƣơng pháp sinh học ở đây chƣa tính đến khả năng thu hồi dịch thủy phân protein cũng nhƣ khả năng tiết kiệm giống bằng phƣơng
101 pháp cấy chuyển. Hơn nữa chi phí cho xử lí nƣớc thải khi ứng dụng qui trình sản xuất chitin bằng phƣơng pháp hóa học là khá lớn, qua đó nhận thấy quy trình sinh học là khá khả quan, tuy nhiên cần nghiên cứu tiết kiệm nguyên vật liệu và tối ƣu đồng thời các điều kiện của từng giai đoạn trong công nghệ nhằm hạ giá thành sản phẩm.
3.2 Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các dẫn xuất chitosan
Trong thời gian nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan với độ deaxetyl cao, chúng tôi thu đƣợc một số loại chitosan với độ nhớt và độ deaxetyl hóa khác nhau. Trong khuôn khổ thời gian của đề tài, trƣớc tiên chúng tôi tiến hành thí nghiệm bƣớc đầu xác định khả năng kháng nấm men, nấm mốc và vi khuẩn của chế phẩm ký hiệu CA thu đƣợc từ quy trình tạo chitosan nói trên với độ nhớt 84 cPs, mƣ́ c deaxetyl hóa DDA 95%.
3.2.1 Khả năng kháng nấm men, nấm mốc
3.2.1.1 Khả năng ức chế của chitosan lên nấm men
Trong thí nghiệm này chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae lên men bia đƣợc sử dụng làm chủng đại diện nhằm kiểm tra khả năng ảnh hƣởng của chế phẩm chitosan lên nấm men. Kết quả thể hiện trên hình 3.2.1 cho thấy, tại các nồng độ chitosan 5 và 2,5 mg/ml sau 48 h nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, không có khuẩn lạc nào xuất hiện. Khuẩn lạc nấm men bắt đầu xuất hiện tại nồng độ 1,25 mg/ml và nhiều hơn khi nồng độ giảm xuống 0,3 mg/ml. Trên mẫu kiểm chứng nơi tế bào đƣợc lắc trong môi trƣờng lỏng không chứa chitosan, nấm men phát triển mạnh và sau 48 h thì hầu nhƣ không còn nhìn rõ khuẩn lạc. Kết quả thể hiện trên các đĩa sau 72 h nuôi cấy cho kết quả tƣơng tự với nhiều khuẩn lạc hơn ở các đĩa tƣơng ứng với nồng độ chitosan 1,25; 0,625 và 0,3 mg/ml. Trên
102 các đĩa tƣơng ứng với nồng độ chitosan 5 và 2,5 mg/ml vẫn không có khuẩn lạc nào xuất hiện (kết quả không trình bày). Với kết quả nhƣ vậy, nồng độ 2,5 mg/ml đƣợc xác định là nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên nấm men
103
Hình 3.2.1: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu của chitosan trên nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Trong một nghiên trƣớc đây, Kendra và Hadwiger (1984) [95] xác định độ giảm mức độ polymer hóa của dẫn xuất chitosan mà tại đó hoạt tính kháng nấm của chitosan cho hiệu quả ngƣợc lại. Các dẫn xuất của chitosan đƣợc thử nghiệm trên hai chủng Fusarium solani gây bệnh trên thực vật. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính kháng nấm của chitosan thể hiện cao nhất trên dẫn xuất heptamer của chitosan. Tiếp theo, hoạt tính kháng nấm của dẫn xuất chitosan giảm dần theo độ dài của mạch polymer. Dẫn xuất trimer và dimer của N-acetylglucosamine hầu nhƣ không thể hiện hoạt tính. Trong nghiên cứu của Rhoades và Roller [96], chitosan đƣợc thủy phân bằng phản ứng oxy hóa khử, nhựa mủ đu đủ và lysozyme. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng chitosan đƣợc thủy phân nhẹ làm tăng khả năng bất hoạt hóa vi sinh vật trong dịch nƣớc muối, và ức chế tốt hơn quá trình phát triển của một số nấm gây hƣ hỏng thực phẩm trong môi trƣờng phòng thí nghiệm, trong khi dẫn xuất chitosan đƣợc thủy phân ở mức độ cao không thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật.
Trong thí nghiệm tiếp theo, dẫn xuất chitosan đƣợc thủy phân một phần bằng chitosanase trong phòng thí nghiệm đƣợc sử dụng để kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật trên chủng nấm men Sacchatomyces cerevisiae. Kết quả thể hiện trên hình 3.2.2 cho thấy, sau 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện thích hợp, từ nồng độ thử nghiệm 5 mg/ml tới 0,625 mg/ml (tƣơng ứng với các đĩa petri ký hiệu 1, 2, 3,