Đặc điểm của chitin, chitosan và chitooligosaccharide (COS)

1.1.1 Giới thiệu chung

Chitin

Chitin là polymer hữu cơ phổ biến thứ hai trong tự nhiên sau cellulose, đƣợc tạo ra trung bình 20g/năm/m2

bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin khá cao từ 14 - 35% so với trọng lƣợng khô [1]. Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin- chitosan và các dẫn xuất của chúng.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của chitin

Chitosan

Trong số các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế.

Việc sản xuất chitosan tƣơng đối đơn giản, không cần dung môi, hóa chất độc hại, đắt tiền. Chitosan thu đƣợc bằng phản ứng deacetyl hóa chitin, biến đổinhóm N-acetyl thành nhóm amin ở vị trí C2. Do quá trình khử acetyl xảy ra không

18 hoàn toàn nên ngƣời ta qui ƣớc nếu độ deacetyl hóa (degree of deacetylation) DD > 75% thì gọi là chitosan, nếu DD < 75% gọi là chitin.

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của chitosan

Chitosan oligosaccharide (COS)

Chitosan oligosaccharide (COS) là chitosan phân tử lƣợng thấp, cấu tạo từ 3 đến 11 đơn vị glucozamin liên kết với nhau thông qua cầu nối β-(1-4)-D- glucozit. COS (có mức polime hóa DP thấp) có khả năng hòa tan tốt hơn các chitosan phân tử lƣợng thấp (LMWC-low molecular weight chitosan) với mức DP cao hơn. Nói chung phân tử lƣợng của COS có thể lên đến 10 kDa. Trong quá trình sản xuất COS, độ nhớt đƣợc dùng để xác định phân tử lƣợng trung bình của COS.

1.1.2 Tính chất hóa lý của chitosan

Chitosan có khối lƣợng phân tử khác nhau ứng với các nguồn chitin khác nhau. Khối lƣợng phân tử chitin trong tự nhiên thƣờng lớn hơn một triệu Daltons trong khi sản phẩm chitosan thƣơng mại có khối lƣợng phân tử từ 100,000 - 1,200,000 Daltons phụ thuộc vào quá trình xử lý của nhà sản xuất.

Trong khi chitin không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, chitosan tan tốt trong các dung dịch axít loãng có pH dƣới 6.0. Các axít hữu cơ nhƣ axít axetic, formic, và axit lactic đƣợc sử dụng để hoà tan chitosan. Chitosan cũng tan trong

19 axít hydrochloric 1%, nhƣng không hoà tan trong axít sunfuaric và phosphoric. Sự hoà tan của chitosan trong axít vô cơ là có giới hạn. pH trên 7.0 làm cho sự hoà tan chitosan khó khăn hơn. Tại pH cao, sự kết lắng hoặc sự tạo gel có khuynh hƣớng xảy ra và dung dịch chitosan ở dạng poly – ion sẽ tạo phức hợp với các ion Cl- kết quả là hình thành gel [2].

1.1.2.1 Mức độ Deacetylation (DD)

Quá trình deacetylation liên quan đến việc loại bỏ các nhóm acetyl từ chuỗi phân tử của chitin, để thu đƣợc một hợp chất (chitosan) với nhóm (-NH2) là nhóm có khả năng tham gia phản ứng cao. Điều này làm cho mức độ deacetylation (DD) là một bƣớc quan trọng trong sản xuất chitosan vì nó ảnh hƣởng đến các tính chất hóa lý, do đó xác định các ứng dụng thích hợp của chitosan [3]. Deacetylation cũng ảnh hƣởng đến khả năng phân huỷ sinh học và hoạt tính miễn dịch [3].

Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nƣớc, dung dịch kiềm và axit đậm đặc, cồn, axeton và các dung môi hữu cơ khác nhƣng tan trong axit loãng (pH=6) điển hình nhƣ tan trong axit acetic loãng tạo thành dung dịch keo. Độ nhớt của dung dịch chitosan trong dung dịch keo phụ thuộc và khối lƣợng phân tử của chitosan, nguồn gốc và phƣơng pháp điều chế. Dung dịch chitosan trong axit có độ nhớt phụ thuộc vào độ deacetyl hóa chitosan (DD%). Độ nhớt của chitosan có DD = 100% là 10800 cm3/g.

Mức độ deacetyl ảnh hƣởng lớn tới độ hòa tan [4]. Chitosan có thể hòa tan > 95% trong dung dịch axit acetic 1% với nồng độ 0,5%.

20

1.1.2.2 Độ nhớt

Cũng nhƣ với các mẫu thực phẩm khác, độ nhớt là một yếu tố quan trọng trong việc xác trọng lƣợng phân tử chitosan và trong việc xác định các ứng dụng thƣơng mại của nó công nghệ sinh học cũng nhƣ trong hệ thống thực phẩm. Chitosan có trọng lƣợng phân tử cao hơn thƣờng có độ nhớt cao, mà có thể không đƣợc mong muốn để xử lý công nghiệp. Tuy nhiên, chitosan có độ nhớt thấp có thể tạo điều kiện thuận lợi cho xử lý dễ dàng.

1.1.3 Ứng dụng

Chitin và chitosan có rất nhiều ứng dụng trong thực tế nhƣ chất bảo quản trong thực phẩm [5], chất làm trong trong và chống nấm trong nƣớc quả [6], chất kích thích sinh trƣởng thực vật và chất hấp phụ [2]. Gần đây chitosan còn đƣợc dùng nhƣ thức ăn kiêng do khả năng hấp phụ chất béo và dầu [7].

Không giống chitosan, COS có thể tan trong nƣớc và hấp thụ dễ dàng bởi ruột, nhanh chóng đi vào máu và có tác động sinh học lên cơ thể [8]. Ngoài ra COS còn có nhiều đặc tính sinh học khác nhƣ kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn và nấm, hoạt tính chống lại sự phát triển của các khối u, hoạt động nhƣ một tác nhân miễn dịch và liên kết với các protein kháng bệnh ở các loài thực vật bậc cao [9].

COS đƣợc biết có nhiều hoạt tính sinh học nhƣ kháng nấm [6, 10], hoạt tính kháng vi khuẩn [11-20], kháng các khối u, bƣớu [21], tăng cƣờng khả năng miễn dịch [17], và bảo vệ chống lại sự nhiễm trùng và oxi hóa [22-27]. Các đặc tính của COS nhƣ mức độ polymer hóa (DP) và mức độ axetyl hóa (DA), sự phân bố điện tích và các biến đổi hóa học có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính sinh học của

21 chúng. Kích thƣớc phân tử của COS đƣợc xem là thông số chính quan trọng liên quan tới hoạt tính sinh học của chúng [9, 14].

1.1.3.1 Đặc tính kháng khuẩn của chitosan và COS

Các nghiên cứu gần đây cho thấy chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn hiệu quả. Ví dụ, chitosan có khối lƣợng 470 KDa đã ức chế hiệu quả vi khuẩn gram dƣơng ngoại trừ Lactbacillus sp., trong khi đó chitosan với khối lƣợng là 1,106 KDa thì có hiệu quả đối với vi khuẩn gram âm. Chitosan thƣờng có khả năng kháng khuẩn với các vi khuẩn gram dƣơng (Listeria monocytogenes, Bacillus megaterium, B. cereus, Staphylococcus aureus, Lactobacillus plantarum, L. brevis, and L. bulgaris) hiệu quả hơn vi khuẩn gram âm (E.coli, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhymurium, and Vibrio parahaemolyticus) với nồng độ chitosan là 0,1% [28].

Chitosan đã đƣợc phê duyệt nhƣ là một phụ gia thực phẩm tại Hàn Quốc và Nhật Bản tƣơng ứng từ năm 1995 và 1983. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan ở pH thấp sẽ cao hơn và cho thấy rằng bổ sung của chitosan để các loại thực phẩm có tính axit sẽ tăng cƣờng hiệu quả của nó nhƣ là một chất bảo quản tự nhiên [28].

1.1.3.2 Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan

Nhìn chung các kết luận cơ chế chính xác hoạt động kháng khuẩn của chitosan vẫn chƣa đƣợc công bố rõ ràng , nhƣng cơ chế chí nh đã đƣợc đề xuất nhƣ sau: (1) tƣơng tác giƣ̃a các ion tích điê ̣n dƣơng trên các phân tƣ̉ chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc màng thế bào , thay đổi khả năng thẩm thấu gây r ò rỉ protein và các thành phần khác trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn đến

22 mất khả năng bảo vê ̣, trao đổi chất của tế bào; (2) chitosan đóng vai trò nhƣ chất chọn lọc liên kết với các ion kim loa ̣i, sau đó ƣ́c chế các chất đô ̣c và sƣ̣ phát triển của vi khuẩn ; (3) chitosan liên kết với nƣớc , ức chế các enzym khác nhau ; (4) chitosan thâm nhâ ̣p vào bào tƣơng của các vi sinh vâ ̣t và thông qua các liên kết với AND, ngăn cản sự tổng hợp ARN và protein ; (5) Chitosan ta ̣o thành mô ̣t lớp cao phân tƣ̉ không thấm nƣớc trên bề mă ̣t tế bào làm thay đổi tính thấm của tế bào và ngăn các chất dinh dƣỡng vào tế bào; (6) chitosan có thể hấp phu ̣ các điê ̣n tích âm trong tế bào , làm chúng kết dính thành từng mảng , làm nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh vật dẫn đến phá hủy tế bào [29].

1.1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan

Mƣ́ c đô ̣ kháng vi sinh vâ ̣t của chitosan bi ̣ ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên trong và bên ngoài nhƣ khối lƣợng phân tử , đô ̣ deacetyl , pH, nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ hòa tan , nguồn gốc và vi sinh vâ ̣t đích . Để các ƣ́ng du ̣ng của hợp chất chitosan có hiê ̣u quả cần phải nắm rõ các yếu tố này.

 Trọng lƣợng phân tử

Ảnh hƣởng của trọng lƣợng phân tử chitosan đến hoạt động kháng khuẩn đã đƣợc nghiên cƣ́u . Chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của

chitosan có thể so sánh đƣợc tùy thuô ̣c vào vi khuẩn thƣ̉ nghiê ̣m , điều kiê ̣n thƣ̉ nghiê ̣m và tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ của chitosan, nhƣng ngay cả các kết quả thu đƣợc không hoàn toàn tƣơng thích, có sự khác biệt. Tăng tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ dẫn đến giảm hoạt tính kháng E.coli của chitosan trong một số nghiê n cƣ́ u [30]. Ngƣợc lại với kết quả đƣợc đề cập ở trên không có sự khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn của chitosan có tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ khác nhau đối với E.coli và Bacillus subtilis [13, 30].

23 Shimojoh cù ng cô ̣ng sƣ̣ [31] tìm thấ y chitosan 220000 Dalton là hiê ̣u quả nhất, tuy nhiên hoa ̣t đô ̣ng kháng khuẩn của chitosan 70000 Dalton tốt hơn 426000 Dalton đối vớ i mô ̣t số vi khuẩn, nhƣng đối với các nghiên cƣ́u khác, hiê ̣u quả ngƣợc lại . Yalpani [53] báo cáo rằng chitosan có tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ trung bình cho thấy hoạt đông kháng B.circulans tốt hơn là chitooligosaccharides . Tƣ̀ nhƣ̃ng kết quả của Shimojoh và Yalpani có thể nhâ ̣n thấy rằng mối quan hê ̣ giƣ̃a trọng lƣợng phân tử của chitosan va tính kháng khuẩn có thể bi ̣ ảnh hƣởng bởi các vi sinh vật thử nghiệm . Nhiều nhà nghiên cƣ́u đã thông báo rằng hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử . Hwang cùng cô ̣ng sƣ̣ [32] kết luâ ̣n rằng với chitosan tro ̣ng lƣợng phân tử lớn hơn 30000 Dalton cho hiê ̣u quả cao nhất diê ̣t khuẩn E.coli tƣ̀ nghiên cƣ́u của ho ̣ khảo sát trong pha ̣m vi trọng lƣợng phân tử chitosan 10000 – 170000 Dalton. Jeon [13] cho rằng tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ của chitosan rất quan tro ̣ng cho sƣ̣ ƣ́c chế vi sinh vâ ̣t và k ết luận với tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ cao hơn 10000 Dalton cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tốt hơn.

Rất khó để tìm đƣợc mối tƣơng quan rõ ràng giƣ̃a hoa ̣t tính kháng khuẩn và trọng lƣợng phân tử của chitosan. Tuy nhiên hoa ̣t tính này giảm so với một trọng lƣợng phân tƣ̉ cao nhất đi ̣nh. Sƣ̣ khác biê ̣t giƣ̃a kết quả của các nghiên cƣ́u có thể là so độ deacetyl và trọng lƣợng phân tử khác nhau của chitosan . Viê ̣c đánh giá sƣ̣ phu ̣ thuô ̣c đòi hỏi phải khảo sát p hạm vi trọng lƣợng phân tử chitosan rộng với đô ̣ deacetyl là nhƣ nhau , điều này gă ̣p phải khó khăn vì chitosan là mô ̣t polymer tƣ̣ nhiên . Nhƣ vâ ̣y, khó có thể xác định trọng lƣợng phân tử tối ƣu nhất cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tố t nhất . Viê ̣c lƣ̣a cho ̣n tro ̣ng lƣơng phân tƣ̉ của chitosan phu ̣ thuô ̣c vào ƣ́ng du ̣ng của nó.

24

 Độ deacetyl (DD)

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan tỷ lê ̣ thuâ ̣n với DD của chitosan[33-35]. Sƣ̣ gia tăng DD có nghĩa là số lƣợng các nhóm amin trên chitosan tăng lên , kết quả là trong môi trƣờng có tính axit làm gia tăng sự tƣơng tác giữa chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật [36]. Simpson và các cô ̣ng sƣ̣ [34] báo cáo rằng chitosan với DD là 92,5% hiệu q uả hơn so với chitosan có DD 85%.

 Độ pH

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan bị ảnh hƣơng mạnh mẽ bở i pH [33, 37- 38]. pH thấp hơn làm tăng hoạt tính kháng khuẩn đƣợc giải thích bới nhiều lí do, ngoài hiệu ứng ức chế vi sinh vật mục tiêu của các axit . Tsai và Su [38] kiểm tra hoạt đô ̣ng kháng khuẩn của chitosan (DD 98%) đối với E.coli ở giá trị pH khác nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Các hoạt động kháng khuẩn tốt nhất quan sát đƣợc ở pH = 5,0 và chitosan có rất ít hoạt tính kháng khuẩn ở pH = 9,0. Các nhà nghiên cƣ́u khác [33, 37] kết luâ ̣n rằng chitosan không có hoa ̣t tính kháng khuẩn ở pH = 7,0 do nhóm amin và đô ̣ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém. Điều này cho thấy hoa ̣t tính kháng khuẩn còn phu ̣ thuô ̣c bản chất cation của chitosan.

 Nhiê ̣t đô ̣

Nhiệt đô ̣ cũng có ảnh hƣởng đến hoa ̣t tính kháng khuẩn củ a chitosan. Nhiê ̣t đô ̣ cao hơn 370

C làm tăng cƣờng hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan so với nhiê ̣t đô ̣ la ̣nh. Tuy nhiên, ảnh hƣởng lớn nhất về hoạt động kháng khuẩn là môi trƣờng xung quanh. Tsai và Su [38] kiểm tra tác đô ̣ng của nhiê ̣t đô ̣ đến hoa ̣t đô ̣ng kháng

E.coli của chitosan . Huyền phù tế bào trong đê ̣m phosphat (pH = 6) có chứa chitosan với nồng đô ̣ 150ppm đƣợc nuôi ở 4, 15, 25, 370

25 gian khác nhau và đi ̣nh lƣợng số tế bào còn sống sót . Các hoạt tính kháng khuẩn đƣợc tìm thấy tỷ lê ̣ thuâ ̣n với nhiê ̣t đô ̣ . Ở nhiệt độ 25 và 37o

C, các tế bào E.coli

đã hoàn toàn bi ̣ giết chết trong vòng 1 giờ. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn (4 và 150C) số lƣợng E.coli giảm trong vòng 5h đầu tiên và sau đó ổn đi ̣nh. Các tác giả kết luâ ̣n rằng hoa ̣t đô ̣ng chống vi khuẩn giảm do giảm tỷ lê ̣ tƣơng tác giƣ̃a

chitosan và các tế bào ở nhiê ̣t đô ̣ thấp hơn.

 Cation và polyanion

Các nhà nghiên cứu đề xuất rằng các cation tạo phức hợp với chitosan và làm giảm số nhóm amin dẫn đến giảm hiệu quả diệt khuẩn của chitosan.

1.1.4 Sản xuất Chitin và Chitosan

Chitosan nhƣ đã đề cập ở trên đƣợc chiết xuất từ chất thải giáp xác vỏ nhƣ cua, ghẹ, tôm, tôm hùm. Vỏ tôm chứa khoảng 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat, và chitin từ 20-30% hàm lƣợng chất khô [39]. Tỷ lệ phần trăm khác nhau với các loài giáp xác và theo từng mùa [40]. Phân tách của chitosan từ vỏ tôm thực hiện qua 4 bƣớc cơ bản: khử khoáng (DM), khử protein (DP), khử màu (DC), và deacetyl hóa (DA). Tuy nhiên, sự phân tách của chitin cụ thể gồm chỉ có hai bƣớc: khử khoáng (DM) và khử protein (DP), tƣơng ứng với việc loại canxi cacbonat bằng 1,0 N HCl và loại bỏ các protein bằng NaOH 3%.

Tuy nhiên trình tự khử khoáng và khử protein có thể đƣợc đảo ngƣợc. Các quá trình này thƣờng sử dụng hai phƣơng pháp: phƣơng pháp hóa học dùng axit, kiềm và phƣơng pháp sinh học sử dụng các enzyme protease.

Sau quá trình khử khoáng và protein của vỏ tôm ta thu đƣợc chitin có màu hồng là do sự có mặt của sắc tố astaxanthin. Sắc tố này có thể đƣợc loại bỏ trong bƣớc khử màu (DC). Sau khi khử màu chitin có màu trắng sáng. Chitin thu đƣợc

26 không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiên dẫn xuất của nó là chitosan có khả năng hòa tan trong hầu hết các axit yếu [4].

Một số phương pháp thu nhận chitin và chitosan hiện nay

Có ba phƣơng pháp chính để thu chitin hiện nay là phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp sinh học và phƣơng pháp hóa học kết hợp sinh học.

1.1.4.1 Phương pháp hóa hoc

Qui trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phƣơng pháp hóa học cho đến nay có nhiều nhƣng tựu chung lại đều chia 3 giai đoạn: loại bỏ khoáng bằng axit, loại bỏ protein bằng kiềm và tẩy màu loại sắc tố và chất béo. Trên hình 1.1 là một ví dụ qui trình thu nhận chitin bằng phƣơng pháp hóa học.

Chitin sản xuất bằng phƣơng pháp hóa học thƣờng bị deaxetyl hóa và thủy phân một phần. Qui trình sản xuất hóa học sẽ thải ra ngoài môi trƣờng một lƣợng lớn nƣớc thải độc hại gồm axit, kiềm và protein và dịch thủy phân protein làm ô nhiễm môi trƣờng cần phải xử lí trƣớc khi thải ra môi trƣờng [41]. Chất lƣợng của dịch thủy phân protein do phản ứng của axit amin với dung dịch kiềm cũng vì thế mà giảm [41].

27

Hình 1.4. Qui trình thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học [4]