Nhƣ trên đã trình bày chitosan có khả năng kháng vi sinh vật và đƣợc ứng dụng trong hỗ trợ chế biến và bảo quản thực phẩm . Tuy nhiên việc ứng dụng chitosan trong bảo quản thịt tƣơi không có nhiều thông tin.
Chitosan có thể đƣợc bổ sung trực tiếp vào thực phẩm, phun trên bề mặt nguyên liệu hoặc tạo màng bao bọc thực phẩm.
Chitosan đƣợc nghiền nhỏ bằng máy để gia tăng bề mặt tiếp xúc và sau đó đƣợc pha với nồng độ chitosan 3% trong dung dịch axit axetic 1,5%. Sau đó bổ sung chất phụ gia PEG - EG 10% (tỷ lệ 1:1) vào và trộn đều, để yên một lúc để loại bọt khí. Hỗn hợp thu đƣợc đem quét đều lên một ống inox đã đƣợc nung nóng ở nhiệt độ 64-65oC (ống inox đƣợc nâng nhiệt bằng hơi nƣớc). Màng đƣợc làm khô trong vòng 35 phút rồi tách màng. Lúc này ngƣời ta thu đƣợc một vỏ bóng có mầu vàng ngà, không mùi vị, đó là lớp màng chitosan có những tính năng mới ƣu việt. Trong thực tế ngƣời ta đã dùng màng chitosan để đựng và bảo quản các loại rau quả nhƣ đào, dƣa chuột, đậu, quả kiwi v.v...Ƣu điểm của màng chitosan
45 là dễ phân huỷ sinh học. Chitosan có thể đƣợc phun lên bề mặt nguyên liệu hoặc pha thành dung dịch rồi nhúng thực phẩm vào, sau đó để ráo và bảo quản. Phƣơng pháp này đa phần áp dụng cho các loại quả vỏ nhẵn và sau đó tùy vào nồng độ chitosan và thời gian nhúng cũng nhƣ số lần nhúng có thể tạo màng lên bề mặt quả.
Phƣơng pháp này ít đƣợc báo cáo cho các loại thực phẩm nhƣ nguyên liệu thịt, cá tƣơi do tạo sự chảy ƣớt, nhiễm khuẩn cũng nhƣ màu sắc không tốt cho loại nguyên liệu này, thêm vào đó lƣợng dung dịch cần nhúng khá lớn dẫn đến hiệu quả không cao.
Thịt và các sản phẩm thịt là môi trƣờng lý tƣởng cho sự phát triển của vi sinh vật, đặc biệt là thịt tƣơi và dễ bị oxy hóa chất béo gây ra mùi ôi, làm giảm giá trị dinh dƣỡng và giá trị cảm quan. Chitosan có thể làm hạn chế sự oxy hóa và có khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây thối hỏng, gây ngộ độc trong quá trình bảo quản. Theo nghiên cứu của Darmadji và Izumoto, 1994 [86], dung dịch chitosan 0,01% ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây thối và gây bệnh nhƣ Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fragi và Staphylococcus aureus. Ở nồng độ 0,1%, dung dịch lỏng chitosan ức chế sự phát triển của các vi sinh vật ban đầu trong thịt, Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Micrococcus varians. Sau khi bảo quản ở 30°C trong 2 ngày hoặc khi bảo quản ở 4°C trong 10 ngày, chitosan 1% có tác dụng ức chế sự sinh trƣởng của vi sinh vật gây hƣ hỏng, giảm sự oxy hóa chất béo, sự thối rữa và tạo tính chất cảm quan tốt hơn. Độ giảm log CFU/g trung bình sau 10 ngày bảo quản ở 4°C là 1,0 với tổng số vi sinh vật, 2,6 với Pseudomonas, 1,0 với Staphylocci, 1,4 với Coliform, trên 2,0 với vi sinh vật Gr (-), và trên 2,0 log CFU/g lƣợng khuẩn lạc Micrococci.
46 Tƣơng tự nhƣ thế, theo Lee và cộng sự, 2003 [87], chitosan 0,5% - 1% ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây thối hỏng, giảm oxy hóa chất béo, giữ màu đỏ của thịt sau khi bảo quản 8 ngày ở 10°C.
Đối với một số sản phẩm ăn liền, nghiên cứu của Z.Jiang, H.Neetoo, H.Chen, 2011 [88] cho thấy dung dịch chitosan 1% chứa natri lactat 1,2% và natri diaxetat 0,25% hoặc chứa kali socbat 0,15% và natri diaxetat 0,125% sau khi phun sƣơng lên bề mặt nguyên liệu giúp làm giảm lƣợng Listeria monocytogenes
trong sản phẩm cá hồi hun khói đến hơn 2,8 log cfu/g sau khi bảo quản ở 4°C trong 30 ngày. Màng bao chitosan đƣợc bổ sung thêm 1,2% natri lactat và 0,25% natri diaxetat giúp làm giảm L.monocytogenes đến trên 1,3log CFU/g sau khi bảo quản ở 4°C trong 30 ngày.
Nhƣ vậy các nghiên cứu đã cho thấy chitosan có hiệu quả trong bảo quản thực phẩm, trong đó có nguyên liệu thịt. Các nghiên cứu cũng cho thấy khi kết hợp chitosan và các chế phẩm bảo quản khác cho hiệu quả tốt hơn sử dụng chitosan riêng rẽ.
1.3.1 Bao bì và các các phương pháp bao gói thịt
1.3.1.1 Phương pháp bảo quản thịt sử dụng khay xốp PS có bọc màng co dãn (màng căng - Stretch Film)
Đối với màng căng, hầu hết nguyên liệu đƣợc sử dụng là LLDPE biến tính thƣờng đƣợc sản xuất trên máy 2-3 lớp và thêm vào chất keo để tạo hiệu ứng dính ở 1 hoặc 2 mặt của film. Một số loại film PVC cũng đƣợc dùng trong ứng dụng này.
Màng căng là một cách đặt tên mang tính đặc trƣng vì nó dùng để quấn quanh 1 vật dƣới tác dụng lực cơ học. Đây là 1 loại màng có thể giãn ra theo cả 2 chiều
47 ngang và dọc mà không cần nhiệt và giữ sản phẩm bên trong bằng 1 lực ổn định trong thời gian dài. Khả năng định hƣớng theo chiều ngang cao giúp cho màng căng có thể kéo giãn mạnh theo chiều dọc va gia tăng lực căng chung.
Đây là phƣơng pháp hiện đang đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong bao gói và bảo quản các sản phẩm thực phẩm tƣơi sống nhƣ rau quả, thịt cá,...Nguyên liệu thực phẩm đƣợc đặt vào khay xốp (vật liệu EPS, PS), sau đó dùng màng co dãn (vật liệu LLDPE biến tính hay PVC) rất mỏng và có khả năng co dãn tốt bọc kín bề mặt khay và sau đó đƣợc bảo quản lạnh ở 0- 4oC hay 8-10oC.
Ƣu điểm: ngăn vi khuẩn ngoài môi trƣờng xâm nhiễm gây hỏng thịt, hình thức bao gói tiện lợi và đẹp.
Nhƣợc: Màng co dãn có khả năng thẩm thấu hơi nƣớc và không khí, thêm vào đó môi trƣờng bên trong không hút triệt để không khí nên chỉ bảo quản trong thời gian ngắn..
1.3.1.2 Bảo quản thịt bằng phương pháp bao gói bằng túi PE và hút chân không
Phƣơng pháp bao gói chân không (bảo quản thịt trong môi trƣờng không có O2) sẽ ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc, nấm men và hầu hết các vi sinh vật hiếu khí trong điều kiện nhiệt độ thấp. Tuy nhiên các vi sinh vật kị khí vẫn phát triển gây ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm. Vì thế cần hạn chế đến mức tối thiểu lƣợng vi sinh vật nhiễm vào trong quá trình xử lý, cắt và bao gói. Nghĩa là bao gói chân không phải đƣợc thực hiện trong điều kiện vệ sinh đƣợc kiểm soát nghiêm ngặt.
Phƣơng pháp bảo quản thịt bằng bao gói chân không có những ƣu điểm làm hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí gây hại, hạn chế sự lây nhiễm chéo
48 của các sản phẩm và ngăn cản hoặc làm chậm lại phản ứng oxy hóa có hại cho thực phẩm trong suốt quá trình bảo quản nhờ vào khả năng ngăn cản oxy của bao bì. Phƣơng pháp này cũng dễ thực hiện.
Ở phƣơng pháp này, ngƣời ta đặt nguyên liệu thịt trong những bao bì PE có độ thẩm khí hạn chế và hút không khí ở trong ra, tạo nên một môi trƣờng chân không. Trong trƣờng hợp này những quá trình oxi hoá xảy ra khi có không khí bị kìm hãm mạnh, lớp bề mặt của sản phẩm không bị khô, giữ đƣợc màu sắc và tính chất ban đầu của sản phẩm.
49
2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
2.1.1 Phế liệu tôm
Phế liệu tôm tƣơi và khô bao gồm đầu và vỏ tôm, thuộc giống tôm sú Penaeus monodon (cơ sở 1: Công ty cổ phần chế biến và xuất khẩu thủy sản Phú Minh Hƣng – Thị trấn Quảng Yên, huyện Quảng Yên, tỉnh Quảng Ninh) thành phần tƣơng ứng độ ẩm 77.8%, protein 51.42%, khoáng 23.26% và 10.72%, protein 31.16%, khoáng 22.63% đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Phế liệu tôm thẻ Litopenaeus vannamei (Xí nghiệp chế biến thủy sản Xuân Thủy Nam Định) thành phần tƣơng ứng độ ẩm 69.75 1.34%, protein 31.231.09%, khoáng 37.661.53% đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Phế liệu tôm sú (Cơ sở 2: Công ty cổ phần xuất nhập khẩu thủy sản Thành phố Hạ Long tỉnh Quảng Ninh) nguồn gốcvới thành phần tƣơng ứng độ ẩm 76.21± 0.52%, protein 45.62 ± 1.28%, khoáng 18.57% ± 0.62% đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.
2.1.2 Chitosan thương mại
Bảng 2.1. Các chế phẩm chitosan/COS thương mại dùng trong đề tài
TT Chế phẩm chitosan/COS Mục đích thí nghiệm Đặc tính Nguồn gốc 1 Chitosan Cơ chất xác định hoạt tính
độ deaxetyl hóa DDA 85%
Sigma, Mỹ
50 chitosanase và D- glucosamin 2 Chitooligosaccharit từ (GlcN)1-6 Chất chuẩn Hàn Quốc
3 Chitosan Cơ chất độ deaxetyl hóa
DDA 85% MTV, Việt nam 4 HMWC Xác định hoạt tính kháng khuẩn đô ̣ nhớt 800 cPs, trọng lƣợng phân
tƣ̉ 247kDa, mƣ́c deaxetyl hóa DDA
79±3%; Sigma, Mỹ 5 MMWC Xác định hoạt tính kháng khuẩn đô ̣ nhớt 200 cPs, trọng lƣợng phân
tƣ̉ 152 kDa, mƣ́c deaxetyl hóa DDA
79±3% Sigma, Mỹ 6 LMWC Xác định hoạt tính kháng khuẩn đô ̣ nhớt 20 cPs, trọng lƣợng phân
tƣ̉ 37kDa, mƣ́c deaxetyl hóa DDA
86±2%
Sigma, Mỹ
51
2.1.3 Vi sinh vật
Bảng 2.2. Các vi sinh vật đã sử dụng
TT Tên vi sinh vật Mục đích Nguồn gốc
1 Bacillus subtilis CH36
Sinh protease, loại protein
Viện công nghệ sinh học – Viện Khoa học và công
nghệ Việt nam 2 Lactobacillus
plantarum NCDN4
Loại khoáng Viện Công nghiệp Thực phẩm 3 Escherichia coli ATCC 25922, Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội. 4 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium ATCC® 14028™ Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội. 5 Salmonella sp. phân lập từ thực phẩm Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
Viện Thú Y Quốc gia
6 Bacillus subtilis ATCC® 11774™, Bacillus sp. phân lập từ thực phẩm lên men Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
52 7 Staphylococcus aureus Phillip Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
8 Asperillus niger D15 Thử nghiệm khả năng kháng vi
sinh vật
Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.
2.1.4 Thịt tươi
Nguyên liệu thịt sử dụng để nghiên cứu bảo quản là thịt lợn, thịt bò, thịt gà đƣợc mua theo hợp đồng cung cấp. Thịt kiểm chứng đƣợc mua tại các quầy hàng trong các chợ, siêu thị và cơ sở giết mỏ vào đầu giờ sáng (6-7h sáng), ngay sau khi pha lọc.
2.1.5 Các loại bao bì sử dụng
Bao bì PE đóng gói chân không Bao bì màng co, khay xốp
53
2.2 Hóa chất – môi trường 2.2.1 Môi trường vi sinh vật
Bảng 2.3. Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
TT Môi trƣờng Thành phần
1 Môi trƣờng LB( Luria Bateri ) lỏng
Cao nấm men 0,5%, peptone 1%, Glucose 1%, NaCl 1%
2 Thạch LB LB + 2% Agar
3 Môi trƣờng cho Bacillus subtillis
Glucose 0,5%, cao nấm men 0,75%, dung dịch muối khoáng 5% (NaCl 0,5%, KH2PO4 0,5%, MgSO4.7H2O 0,5%, FeSO4.7H2O
0,01%).
4 MRS ( Deman, Rogosa,
Sharpe) dùng để giữ và nhân giống lên men chủng vi khuẩn
lactic
Pepton 1%, cao thịt 1%, cao nấm men 0.5%, CH3COONa 0.5%, K2HPO4 0.2%, (NH4)2C6H5O7 0.2%, Tween 80 0.1%, MgSO4.7H2O 0.01%, MnSO4.4H2O 0.005%, 5 Thạch MRS MRS lỏng + Agar 2%
6 Môi trƣờng PDA (Potato dextrose agar)
khoai tây 200 g ninh nhừ và nghiền trong 1 lít nƣớc, dextrose
54 7 Môi trƣờng PDB (Potato
dextrose broth)
khoai tây 200 g ninh nhừ và nghiền trong 1 lít nƣớc, dextrose 20 g/l.
8 Môi trƣờng thi ̣t pepton (MP) Cao thi ̣t 3g, pepton 10g, NaCl 5g, nƣớc cất 1000ml
9 Môi trƣờng MP rắn 2% agar MP bổ sung thêm 20g agar 10 Môi trƣờng MP bán rắn 0,9%
agar
MP bổ sung thêm 9g agar
11 Môi trƣờng TGA ( Xác định tổng số VSV hiếu khí)
Pepton: 5g, cao nấm men: 2,5g, Glucoza: 4g, Agar: 15g, nƣớc cất: 1000ml.
Hòa tan môi trƣờng và hấp ở 121°C trong 15 phút để tiệt trùng.
12 Môi trƣờng Violet Red Bile Glucose Agar - VRBGA (Xác định Enterobacteriaceae)
Pepton: 7g; cao nấm men: 3g; NaCl: 5g; Muối mật: 1,5g; Glucose: 10g; Đỏ trung tính: 0,03g, Tím tinh thể: 0,002g; agar: 12g, nƣớc cất: 1000ml. Hòa tan môi trƣờng, hấp ở 121°C trong 15 phút để tiệt trùng.
13 Môi trƣờng Chapman Agar (Xác định Staphylococcus aureus)
Pepton: 10g; Cao nấm men: 2,5g; Gelatin: 30g; Lactose: 2g; nƣớc cất: 1000ml: D-mannitol: 10g;
55 Dipotassium phosphate: 5g; agar: 15g; Hòa tan môi trƣờng, hấp ở 121°C trong 15 phút để tiệt trùng
2.2.2 Hóa chất
Hóa chất pha đệm: axit acetic CH3COOH, natri acetat CH3COONa.3H2O
Chuẩn bi ̣ các dung di ̣ch chitosan: Pha các dung di ̣ch đê ̣m acetat pH = 5; Hòa tan 0,5g chitosan tƣ̀ ng loa ̣i trong 5ml đê ̣m ở trên đƣợc dung di ̣ch chitosan 1%. Tiếp tục pha loãng chitosan ở nồng độ 0,5%; 0,25%; 0,125%; 0,0625%, 0,03125%, 0,015625%, 0,078125%… bằng đệm acetat pH = 5. Sau đó giƣ̃ trong tủ la ̣nh. Đo pH của các dung di ̣ch chitosan đã pha ở các nồng đô ̣ , chỉnh pH các dung di ̣ch đệm đến pH tƣơng ứng.
- Các hóa chất sử dụng trong phân tích
Dung dịch H3BO3 3%, dung dịch MgO 5%, dung dịch H2SO4 0,1N - Chỉ thị Taxiro, chỉ thị phenolphtalein
2.2.3 Các loại enzym sử dụng
Neutrase (Novo, Đan Mạch) 0.8 L (hoạt độ 0.8AU/g) đƣợc sản xuất từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens. Nhiệt độ bảo quản tốt nhất là -10oC. Điều kiện hoạt động tối ƣu cho enzyme Neutrase: nhiệt độ 45o
C – 55oC, pH 5.5 – 7.5.
Enzyme Alcalase 2.4 L (Novo, Đan Mạch) (hoạt độ 2.4 AU/g): Alcalase đƣợc sản xuất bằng cách lên men chìm của một chủng vikhuẩn Bacillus licheniformis. Alcalase có dạng màu nâu, sánh hoạt động ở nhiệt độ tối
56
2.2.4 Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu
Kính hiển vi điện tử (Nikon Nhật), Tủ lắc ổn nhiệt (Vision Hàn Quốc), Thùng ổn nhiệt có đảo trộn (TA17D, Ý), nồi hấp thanh trùng (Nga), nồi cô
quay chân không (Buchi, Thụy sĩ), bếp, nhiệt kế, máy khuấy từ, máy xay, chiết quang kế, máy đo quang phổ UV-VIS Ultrospec (Pharmacy, Thụy sĩ),
tủ sấy, lò nung (Barntead 48000, Mỹ), thiết bị Kjeldahl (Đức), máy đo pH (Hanna, Ý), máy li tâm (Beckman, Mỹ), và một số thiết bị khác. Các nghiên
cứu đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn CNSH, Phòng thí nghiệm bộ môn CNTP, trung tâm thực hành công nghệ thực phẩm và Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH thuộc Viện CNSH và CNTP trƣờng Đại học
Bách Khoa Hà nội.
2.3 Các phương pháp- Tiến hành thí nghiệm 2.3.1 Các phương pháp phân tích vi sinh
Xác định vi sinh vật tổng số theo TCVN 7928 : 2008
Xác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830-1 : 2005 Xác định tổng số vi sinh vật đƣờng ruột Enterobacteriaceae (theo National standard method of Health Protection Agency - UK ).
Xác định tổng nấm men, nấm mốc theo TCVN 7132-2002
2.3.2 Phương phá p nuôi cấy đối kháng trong di ̣ch lỏng
Phƣơng pháp nuôi đối kháng trong dịch lỏng đƣợc thƣ̣c hiên theo phƣơng pháp đã mô tả trƣớc đây và có hiê ̣u chỉnh để phù hợp. Cụ thể nhƣ sau:
Ống chứa 4ml MP 0,4ml E.coli hoạt hóa 16h,
đi ̣nh lƣợng mâ ̣t đô ̣ E.coli
0,6ml chitosan ở các nồng đô ̣, kiểm chƣ́ng là đê ̣m acetat và nƣớc cất
Dịch A, nuôi 37o
57
Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp đối kháng trực tiếp trong di ̣ch nuôi cấy lỏng 2.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Định nghĩa nồng độ ức chế tối thiểu: là nồng độ mà tại đó vi sinh vật với mật độ 104
tế bào/ml có thể bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ ức chế tối thiểu thể hiện khả năng ức chế của một chất lên sự sinh trƣởng và phát triển của tế bào vi sinh vật.
- Chuẩn bị dịch tế bào, bào tử:
+ Vi khuẩn và nấm men đƣợc cấy vào ống nghiệm chứa môi trƣờng LB lỏng và PDB tƣơng ứng. Vi khuẩn và nấm men sau đó đƣợc nuôi lắc tại nhiệt độ thích hợp để đạt tới mật độ 106 tế bào / ml môi trƣờng. Dịch tế bào sau đó đƣợc cấy vào trong các ống nghiệm môi trƣờng chứa chitosan đã đƣợc chuẩn bị theo tỷ lệ 1%.
+ Nấm mốc đƣợc nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trƣờng PDA trong điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khi nấm mốc đã phát triển và sinh bào