Kính hiển vi điện tử (Nikon Nhật), Tủ lắc ổn nhiệt (Vision Hàn Quốc), Thùng ổn nhiệt có đảo trộn (TA17D, Ý), nồi hấp thanh trùng (Nga), nồi cô
quay chân không (Buchi, Thụy sĩ), bếp, nhiệt kế, máy khuấy từ, máy xay, chiết quang kế, máy đo quang phổ UV-VIS Ultrospec (Pharmacy, Thụy sĩ),
tủ sấy, lò nung (Barntead 48000, Mỹ), thiết bị Kjeldahl (Đức), máy đo pH (Hanna, Ý), máy li tâm (Beckman, Mỹ), và một số thiết bị khác. Các nghiên
cứu đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn CNSH, Phòng thí nghiệm bộ môn CNTP, trung tâm thực hành công nghệ thực phẩm và Trung tâm nghiên cứu và phát triển CNSH thuộc Viện CNSH và CNTP trƣờng Đại học
Bách Khoa Hà nội.
2.3 Các phương pháp- Tiến hành thí nghiệm 2.3.1 Các phương pháp phân tích vi sinh
Xác định vi sinh vật tổng số theo TCVN 7928 : 2008
Xác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830-1 : 2005 Xác định tổng số vi sinh vật đƣờng ruột Enterobacteriaceae (theo National standard method of Health Protection Agency - UK ).
Xác định tổng nấm men, nấm mốc theo TCVN 7132-2002
2.3.2 Phương phá p nuôi cấy đối kháng trong di ̣ch lỏng
Phƣơng pháp nuôi đối kháng trong dịch lỏng đƣợc thƣ̣c hiên theo phƣơng pháp đã mô tả trƣớc đây và có hiê ̣u chỉnh để phù hợp. Cụ thể nhƣ sau:
Ống chứa 4ml MP 0,4ml E.coli hoạt hóa 16h,
đi ̣nh lƣợng mâ ̣t đô ̣ E.coli
0,6ml chitosan ở các nồng đô ̣, kiểm chƣ́ng là đê ̣m acetat và nƣớc cất
Dịch A, nuôi 37o
57
Hình 2.1: Sơ đồ phương pháp đối kháng trực tiếp trong di ̣ch nuôi cấy lỏng 2.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Định nghĩa nồng độ ức chế tối thiểu: là nồng độ mà tại đó vi sinh vật với mật độ 104
tế bào/ml có thể bị ức chế hoàn toàn. Nồng độ ức chế tối thiểu thể hiện khả năng ức chế của một chất lên sự sinh trƣởng và phát triển của tế bào vi sinh vật.
- Chuẩn bị dịch tế bào, bào tử:
+ Vi khuẩn và nấm men đƣợc cấy vào ống nghiệm chứa môi trƣờng LB lỏng và PDB tƣơng ứng. Vi khuẩn và nấm men sau đó đƣợc nuôi lắc tại nhiệt độ thích hợp để đạt tới mật độ 106 tế bào / ml môi trƣờng. Dịch tế bào sau đó đƣợc cấy vào trong các ống nghiệm môi trƣờng chứa chitosan đã đƣợc chuẩn bị theo tỷ lệ 1%.
+ Nấm mốc đƣợc nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trƣờng PDA trong điều kiện nhiệt độ thích hợp. Sau khi nấm mốc đã phát triển và sinh bào tử, bào tử nấm mốc đƣợc thu vào dung dich muối sinh lý và pha loãng tới mật độ 106 bào tử / ml. Dịch bào tử sau đó đƣợc cấy vào trong các ống nghiệm môi trƣờng PDB chứa chitosan đã đƣợc chuẩn bị theo tỷ lệ 1%.
58 - Phƣơng pháp tiến hành (Xem hình 2.2):
+ Dịch môi trƣờng + chitosan chứa tế bào (bào tử) vi sinh vật ở mật độ 104 tế bào (bào tử) / ml đƣợc lắc trong điều kiện nuôi cấy 24h.
+ Sau 24h, dịch lắc đƣợc lấy ra và cấy chang lên đía petri chứa môi trƣờng LB thạch hay PDA và nuôi trong điều kiện thích hợp.
+ Sự phát triển của khuẩn lạc đƣợc quan sát từ sau 24h nuôi cấy. Sau 48 h nuôi cấy, tại nồng độ mà tại đó không thấy sự xuất hiện của khuẩn lạc đƣợc xem là nồng độ ức chế tối thiểu.
Hình 2.2. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu 2.3.4 Các phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh
59 Phƣơng pháp xác định độ ẩm sấy khô đến trọng lƣợng không đổi
Phƣơng pháp xác định khả năng giữ nƣớc của thịt theo phƣơng pháp Filter Paper Press Method (Grau and Hamm, 1957; Honikel, 1987).
Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đạm thối NH3 theo TCVN 3706 : 1990 Phƣơng pháp xác định chỉ số peroxit theo TCVN 6121: 1996
2.3.5 Xác định lượng protein trong chitin bằng phương pháp Biuret (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Protein trong mẫu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Biuret (Theo hƣớng dẫn của Sigma-Aldrich). Trƣớc khi xác định mẫu đƣợc xử lý nhƣ sau:
Cân 5g mẫu cho vào bình tam giác 100ml, thêm 50ml NaOH 3% và để qua đêm ở nhiệt độ phòng . Tiếp đó đun bình lên 90o
C trong 1giờ và làm lạnh tới nhiệt độ phòng rồi tiến hành lọc hỗn hợp
Nồng độ protein đƣợc phân tích ở phần vừa đƣợc lọc. Dịch lọc đƣợc li tâm với tốc độ 6000vòng/phút trong 15phút để chắc chắn rằng nƣớc lọc đã đƣợc loại bỏ hoàn toàn các hạt nhỏ mà lọc ko loại đƣợc. Tiến hành lọc lại sau li tâm, dịch protein thủy phân sau khi lọc (dịch trong) đƣợc pha loãng tới khoảng nồng độ thuộc đƣờng chuẩn đã đƣợc xây. Sau khi pha loãng , 1ml của dịch thủy phân đƣợc trộn với 4ml thuốc thử Biuret . Nồng độ của dịnh đƣợc tính theo OD của dịch đo đƣợc với bƣớc sóng hấp thụ 570nm dựa theo đƣờng chuẩn sử dụng BSA.
2.3.6 Xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng
Hàm lƣợng ẩm và khoáng xác định theo AOAC (1990). Cốc sấy đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong thời gian 5 giờ (đến khối lƣợng không đổi), sau đó để trong bình hút ẩm để làm nguội. Cân xác định khối lƣợng của cốc sấy là W1. Cho mẫu
60 vào cốc sấy cân đƣợc khối lƣợng W2. Sấy ở 105oC trong 24h, cân đƣợc khối lƣợng W3. Tất cả khối lƣợng xác định đều tính theo gram.
% Hàm lƣợng ẩm = [(W2 – W3)/(W2 – W1)] x 100
Sau khi xác định hàm lƣợng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khô ở nhiệt độ 600o
C, khoảng 6 giờ, để trong bình hút ẩm và can đƣợc khối lƣợng W4. Hàm lƣợng tro đƣợc xác định theo công thức sau:
% Hàm lƣợng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)]x100
2.3.7 Xác định độ deacetyl của chitosan bằng phương pháp UV
Hòa tan 100 mg chitosan trong 20ml dung dịch H3PO4 85%, khuấy đảo ở 60oC trong vòng 40 phút.
Lấy 10 ml dung dịch ở trên định mức đến 100ml bằng nƣớc cất, sau đó ủ dung dịch trên trong 2 giờ ở 60o
C
Độ deacetyl của chitosan đƣợc tính theo công thức sau:
DD= 100* (1-µmolGlcNAC/(µmolGlcNAC+µmolGlc)) µmolGlc = (w-(µmolGlcNAC*0.20321))/0.16117
Trong đó:
W : Khối lƣợng mẫu khô tuyệt đối
µmol GlcNAC: Hàm lƣợng N-acetyl glucosamine xác định theo đƣờng chuẩn. µmol Glc: Hàm lƣợng Glucosamine
2.3.8 Xác định độ nhớt của chitosan
Theo phƣơng pháp thứ 2 độ nhớt đƣợc xác định bằng thiết bị đo độ nhớt Elcometer-2300 RV1-L. Chitosan với khối lƣợng 1g (khối lƣợng khô) đƣợc hòa tan trong 100 mL dung dịch axit axetic 1% và lắc tại nhiệt độ 30o
61 tốc độ 100 rpm sau đó đƣợc đo tại nhiệt độ 32oC. Kết quả độ nhớt đƣợc hiện thị trên thiết bị đo và đƣợc ghi chép lại. Đơn vị tính là centipoises (cPs).
2.3.9 Xác định độ hòa tancủa chitosan
0.5g đƣợc hòa trong 50 mL AcOH 5%, giữ 24h sau đó cho thêm 15mL 5% NaNO2, để nhiệt độ phòng 40h, lọc trên giấy lọc đã làm khô trƣớc→sấy ở 105oC→cân
Cách tính:
Độ hòa tan S%=100-[(W1/W2)*100]
W1-trọng lƣợng chitosan (0.5g) W2- trọng lƣợng phần không tan
2.3.10 Xác định lượng đường khử
Xác định lƣợng đƣờng khử theo phƣơng pháp axit dinitro salicylic (DNS) đƣợc cải tiến bởi Miller [89]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phƣơng pháp dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử axít dinitro salicylic. Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử. Biết đƣợc mật độ quang của dung dịch đƣờng khử nghiên cứu, dựa vào đồ thị chuẩn của D-glucosamin với thuốc thử này suy ra đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của dịch nghiên cứu.
2.3.11 Sản xuất chitin ứng dụng chế phẩm enzym
Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phƣơng pháp sinh học kết hợp hóa học sử dụng chế phẩm protease có sẵn trên thị trƣờng. Các chế phẩm protease sử dụng trong nghiên cứu là Neutrase, Alcalse, Papain, protease từ B. subtilis hay dịch ép vỏ
62 dứa. Nghiên cứu các ảnh hƣởng của tỉ lệ nƣớc/PLT, tỉ lệ E/S, nhiệt độ, pH đối với từng enzym cho quá trình thủy phân. Tiêu chí đánh giá là hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng còn lại trong bã chitin và hiệu suất loại protein và hiệu suất loại khoáng, thời gian xử lí .
2.3.12 Qui trình thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn B. subtilis CH36
Nghiên cứu sản xuất chitin bằng phƣơng pháp sinh học sử dụng B. subtillis
CH36 có khả năng sinh protease. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ rỉ đƣờng, pH, nhiệt độ, nồng độ giống đến quá trình loại protein và khoáng của B. subtilis
CH36. Tiêu chí đánh giá là hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng còn lại trong bã chitin và hiệu suất khử khoáng và khử protein.
Xác định chất lƣợng chitin thu đƣợc: hàm lƣợng tro, protein dƣ và độ ẩm.
2.3.13 Qui trình thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn L. plantarum NCDN4
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ rỉ đƣờng, pH, nhiệt độ, nồng độ giống đến quá trình loại protein và khoáng bằng L. platarum NCDN4. Tiêu chí đánh giá là hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng còn lại trong bã chitin và thời gian xử lí. Xác định chất lƣợng chitin thu đƣợc: hàm lƣợng tro, protein dƣ và độ ẩm.
2.3.14 Phương pháp thu nhận chitosan
Chitin thu đƣợc theo phƣơng pháp sinh học đƣợc xử lí với NaOH 40%, tỷ lệ chitin: dịch NaOH 1:10 (w/v) tại nhiệt độ khảo sát 30, 50, 70oC. Chitosan thu đƣợc đem sấy 8h tại nhiệt độ 60o
C và đánh giá chất lƣợng (độ nhớt và mức độ deacetyl hóa). Các quy trình deacetyl sau đó đƣợc tiến hành 2 lần nhƣ sau:
Qui trình 1: deaxetyl chitin tại 30oC trong 4 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70oC trong 24h
63 Qui trình 2: deaxetyl chitin tại 50oC trong 1 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70oC trong 24h
Qui trình 3: deaxetyl chitin tại 70oC trong 1 ngày và định mức lại bằng NaOH bù chỗ bay hơi và tiến hành deaxetyl tiếp trong 24h
Độ nhớt và mức độ deacetyl hóa của sản phẩm sẽ đƣợc kiểm tra
2.3.15 Phương pháp thủy phân chitosan
Quá trình thủy phân chitosan đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trên hình 2.1. Các ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ, pH, tỉ lệ E/S đến hiệu suất thủy phân và phổ sản phẩm tạo thành đƣợc nghiên cứu.
Hình 2.3. Qui trình thủy phân chitosan
2.3.16 Kiểm tra phổ sản phẩm bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
Sản phẩm của quá trình thủy phân chitosan bằng enzym đem phân tích dùng phƣơng pháp sắc kí bản mỏng TLC tráng Silica G60 đã đƣợc mô tả bởi Chen và cộng sự [90].
64
Dung môi dùng cho phân tách COS là hỗn hợp với tỷ lệ n-propanol: NH3 (30%) = 1:2. Sử dụng chất hiện màu là dung dịch ninhydrin 0,5 – 1% trong
cồn etanol nguyên chất.
2.3.17 Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm
Chitosan và COS đƣợc hòa tan trong đệm axetat (0.2 M axetat natri và axit axetic 0.5M, pH 4.5). Xác định độ nhớt của chitosan và COS dùng nhớt kế Oswald. Khối lƣợng phân tử trung bình đƣợc tính toán dựa trên phƣơng trình Mark–Houwink
[] = K.Mva
Trong đó là độ nhớt, K = 3.5 x 10-4 và a=0.76, Mv là khối lƣợng phân tử trung bình của sản phẩm COS [91]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.18 Ứng dụng chitosan thu được để bảo quản thịt
Dung dịch chitosan đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan chitosan với nồng độ khác nhau, tối đa 1% trong axit axetic 1%. Tiến hành bảo quản nguyên liệu thịt bằng 2 phƣơng pháp nhƣ sau:
+ Phun sƣơng lên bề mặt miếng thịt :
Sử dụng thiết bị máy nén và hệ thống phun sƣơng với áp lực phun là 4 kG/cm2 và 5,4kG/cm2, lƣu lƣợng phun 20ml dịch/kg sản phẩm tƣơng ứng 0,09m2
bề mặt, phun đều lên bề mặt miếng thịt
+ Nhúng trong dung dịch bảo quản trên với tỷ lệ 1 kg/1 lít dung dịch cho ngập miếng thịt, sau đó vớt ra để ráo.
- Các mẫu đƣa đi bảo quản trong các túi PE tiệt trùng hút chân không ở 0- 4°C trong tủ lạnh và sau đó đƣợc đánh giá các theo các chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu thịt:
65 + Hóa lý : pH, hàm lƣợng NH3, độ hao hụt trọng lƣợng, khả năng giữ nƣớc. + Vi sinh vật : Tổng số vi sinh vật hiếu khí, Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus
+ Cảm quan
Chitosan cũng đƣợc nghiên cứu phối hợp với các chất khác: Bổ sung natri diaxetat: 0,1-0,4%, natri lactat: 1-3% vào dung dịch chitosan 0,1-1%. Dùng bài toán quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 với phần mềm Design Expert 8.0.6 để tối ƣu hóa nồng độ các chất xử lý chitosan, natri lactat, natri diaxetat. Dịch sử dụng đƣợc bổ sung thêm nisin với nồng độ khác nhau và đánh giá hiệu quả bảo quản thông qua các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan nhƣ trên.
2.4 Cách tính hiệu suất loại protein và loại khoáng
Hiệu suất thủy phân protein: DP (%) = [ Po x O − (Pr x R)]
(Po x O) x 100
Hiệu suất khử khoáng đƣợc tính theo công thức DM (%) = [ Ao x O − Ar x R ]
(Ao x O) x 100
Po, Pr: Hàm lƣợng protein (g/g) tƣơng ứng của mẫu phế liệu trƣớc và sau khi thủy phân bằng enzyme neutrase
Ao, Ar : Hàm lƣợng khoáng (g/g) tƣơng ứng mẫu PLT trƣớc và sau lên men lactic khử khoáng.
66
2.5 Phương phá p tính toán và xử lý số liê ̣u
Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và đƣợc xƣ̉ lý thống kê theo phần mềm Excel. Sai số trong phép đi ̣nh lƣợng đƣợc tính toán trong Excel , sƣ̉ du ̣ng công thƣ́c tính sai số toàn p hƣơng trung bình . Tối ƣu hóa dùng bài toán quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 với phần mềm Design Expert 8.0.6
67
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan và các dẫn xuất COS từ phế liệu nhà máy thủy sản máy thủy sản
3.1.1 Lựa chọn phương án thu hồi chitin từ phế liệu tôm (PLT) bằng phương pháp sinh học
3.1.1.1 Dùng chế phẩm Neutrase 1.5L
Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân cho thấy tại 50oC cho hiệu suất loại protein cao nhất tƣơng ứng với hàm lƣợng protein dƣ thấp nhất. Dựa vào một số nghiên cứu trƣớc đây và kết quả nghiên cứu thực tế chúng tôi chọn nhiệt độ cho quá trình khử protein là 50oC.
Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình loại protein
Nhiệt độ (o C) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%) 45 89,30 ± 0,52 13,62 ± 1,24 50 90,78 ± 0,78 9,28 ± 1,22 55 89,76 ± 0,39 10,37 ± 1,00 60 87,92 ± 0,39 16,00 ± 1,97
68 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ảnh hưởng của pH dịch thủy phân tới quá trình khử protein
Bảng 3.1.2 đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho enzyme neutraza hoạt động là 8.
Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình khử protein
pH DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%)
6 82.99 ± 1.76 18.26 ± 1.30
7 88.10 ± 0.78 14.66 ± 0.38
8 88.65 ± 2.34 13.76 ± 2.17
9 85.61 ± 0.39 17.42 ± 0.27
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy DP tăng với khi thời gian thủy phân tăng, từ 81.47% sau 1h lên đến 90.44% sau 5h thủy phân. Thời gian 5h thủy phân, hàm lƣợng protein có giảm so với 4h nhƣng không nhiều. Nhƣ vậy, với thời gian 4h thủy phân là tƣơng đối phù hợp cho việc khử protein trong PLT của enzyme neutraza.
Bảng 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein
Thời gian (h) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%)
1 81.47 ± 0.39 19.63 ± 0.75
2 84.09 ± 0.59 17.94 ± 1.19
3 86.44 ± 0.39 15.74 ± 1.00
4 88.37 ± 1.56 13.11 ± 1.83
69
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme tới quá trình khử protein
Theo số liệu ở bảng 3.4 cho thấy khi tỉ lệ enzyme tăng dần, hiệu quả khử protein cũng tăng dần. Ở nồng độ E/PLT nghiên cứu tăng dần từ 1% lên đến 4%, DP cũng tăng dần từ 78.29% lên đến 94.47% và hàm lƣợng protein còn lại giảm dần từ 24.85% xuống còn 7.37% (bảng 3.4).
Tuy nhiên, nếu lƣợng enzyme cho vào quá cao sẽ gây lãng phí.
Bảng 3.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme tới quá trình khử protein
Tỷ lệ E (%) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%) 1 78.29 ± 0.20 24.85 ± 0.33 1.5 85.62 ± 0.52 18.95 ± 0.62 2 86.26 ± 0.39 15.80 ± 0.01 2.5 88.38 ± 0.78 15.23 ± 1.25 3 91.14 ± 0.52 10.94 ± 0.27 3.5 92.34 ± 0.65 8.29 ± 0.19 4 94.47 ± 0.26 7.37 ± 0.23
Khi kết hợp điều kiện thích hợp trên (pH 8, nhiệt độ 50oC, 4h, tỉ lệ enzyme/PLT là 1,0%) với việc sử dụng cánh khuấy hiệu suất khử protein sau 1 h tăng từ