Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan

Nhìn chung các kết luận cơ chế chính xác hoạt động kháng khuẩn của chitosan vẫn chƣa đƣợc công bố rõ ràng , nhƣng cơ chế chí nh đã đƣợc đề xuất nhƣ sau: (1) tƣơng tác giƣ̃a các ion tích điê ̣n dƣơng trên các phân tƣ̉ chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật dẫn đến thay đổi trong cấu trúc màng thế bào , thay đổi khả năng thẩm thấu gây r ò rỉ protein và các thành phần khác trong tế bào, làm giảm chức năng sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn dẫn đến

22 mất khả năng bảo vê ̣, trao đổi chất của tế bào; (2) chitosan đóng vai trò nhƣ chất chọn lọc liên kết với các ion kim loa ̣i, sau đó ƣ́c chế các chất đô ̣c và sƣ̣ phát triển của vi khuẩn ; (3) chitosan liên kết với nƣớc , ức chế các enzym khác nhau ; (4) chitosan thâm nhâ ̣p vào bào tƣơng của các vi sinh vâ ̣t và thông qua các liên kết với AND, ngăn cản sự tổng hợp ARN và protein ; (5) Chitosan ta ̣o thành mô ̣t lớp cao phân tƣ̉ không thấm nƣớc trên bề mă ̣t tế bào làm thay đổi tính thấm của tế bào và ngăn các chất dinh dƣỡng vào tế bào; (6) chitosan có thể hấp phu ̣ các điê ̣n tích âm trong tế bào , làm chúng kết dính thành từng mảng , làm nhiễu loạn các hoạt động sinh lý của các vi sinh vật dẫn đến phá hủy tế bào [29].

1.1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kháng khuẩn của chitosan

Mƣ́ c đô ̣ kháng vi sinh vâ ̣t của chitosan bi ̣ ảnh hƣởng bởi các yếu tố bên trong và bên ngoài nhƣ khối lƣợng phân tử , đô ̣ deacetyl , pH, nhiê ̣t đô ̣, đô ̣ hòa tan , nguồn gốc và vi sinh vâ ̣t đích . Để các ƣ́ng du ̣ng của hợp chất chitosan có hiê ̣u quả cần phải nắm rõ các yếu tố này.

 Trọng lƣợng phân tử

Ảnh hƣởng của trọng lƣợng phân tử chitosan đến hoạt động kháng khuẩn đã đƣợc nghiên cƣ́u . Chỉ có một vài nghiên cứu về hoạt động diệt khuẩn của

chitosan có thể so sánh đƣợc tùy thuô ̣c vào vi khuẩn thƣ̉ nghiê ̣m , điều kiê ̣n thƣ̉ nghiê ̣m và tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ của chitosan, nhƣng ngay cả các kết quả thu đƣợc không hoàn toàn tƣơng thích, có sự khác biệt. Tăng tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ dẫn đến giảm hoạt tính kháng E.coli của chitosan trong một số nghiê n cƣ́ u [30]. Ngƣợc lại với kết quả đƣợc đề cập ở trên không có sự khác biệt trong hoạt động kháng khuẩn của chitosan có tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ khác nhau đối với E.coli và Bacillus subtilis [13, 30].

23 Shimojoh cù ng cô ̣ng sƣ̣ [31] tìm thấ y chitosan 220000 Dalton là hiê ̣u quả nhất, tuy nhiên hoa ̣t đô ̣ng kháng khuẩn của chitosan 70000 Dalton tốt hơn 426000 Dalton đối vớ i mô ̣t số vi khuẩn, nhƣng đối với các nghiên cƣ́u khác, hiê ̣u quả ngƣợc lại . Yalpani [53] báo cáo rằng chitosan có tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ trung bình cho thấy hoạt đông kháng B.circulans tốt hơn là chitooligosaccharides . Tƣ̀ nhƣ̃ng kết quả của Shimojoh và Yalpani có thể nhâ ̣n thấy rằng mối quan hê ̣ giƣ̃a trọng lƣợng phân tử của chitosan va tính kháng khuẩn có thể bi ̣ ảnh hƣởng bởi các vi sinh vật thử nghiệm . Nhiều nhà nghiên cƣ́u đã thông báo rằng hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc vào trọng lƣợng phân tử . Hwang cùng cô ̣ng sƣ̣ [32] kết luâ ̣n rằng với chitosan tro ̣ng lƣợng phân tử lớn hơn 30000 Dalton cho hiê ̣u quả cao nhất diê ̣t khuẩn E.coli tƣ̀ nghiên cƣ́u của ho ̣ khảo sát trong pha ̣m vi trọng lƣợng phân tử chitosan 10000 – 170000 Dalton. Jeon [13] cho rằng tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ của chitosan rất quan tro ̣ng cho sƣ̣ ƣ́c chế vi sinh vâ ̣t và k ết luận với tro ̣ng lƣợng phân tƣ̉ cao hơn 10000 Dalton cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tốt hơn.

Rất khó để tìm đƣợc mối tƣơng quan rõ ràng giƣ̃a hoa ̣t tính kháng khuẩn và trọng lƣợng phân tử của chitosan. Tuy nhiên hoa ̣t tính này giảm so với một trọng lƣợng phân tƣ̉ cao nhất đi ̣nh. Sƣ̣ khác biê ̣t giƣ̃a kết quả của các nghiên cƣ́u có thể là so độ deacetyl và trọng lƣợng phân tử khác nhau của chitosan . Viê ̣c đánh giá sƣ̣ phu ̣ thuô ̣c đòi hỏi phải khảo sát p hạm vi trọng lƣợng phân tử chitosan rộng với đô ̣ deacetyl là nhƣ nhau , điều này gă ̣p phải khó khăn vì chitosan là mô ̣t polymer tƣ̣ nhiên . Nhƣ vâ ̣y, khó có thể xác định trọng lƣợng phân tử tối ƣu nhất cho hoa ̣t tính kháng khuẩn tố t nhất . Viê ̣c lƣ̣a cho ̣n tro ̣ng lƣơng phân tƣ̉ của chitosan phu ̣ thuô ̣c vào ƣ́ng du ̣ng của nó.

24

 Độ deacetyl (DD)

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan tỷ lê ̣ thuâ ̣n với DD của chitosan[33-35]. Sƣ̣ gia tăng DD có nghĩa là số lƣợng các nhóm amin trên chitosan tăng lên , kết quả là trong môi trƣờng có tính axit làm gia tăng sự tƣơng tác giữa chitosan và các điện tích âm trên màng tế bào vi sinh vật [36]. Simpson và các cô ̣ng sƣ̣ [34] báo cáo rằng chitosan với DD là 92,5% hiệu q uả hơn so với chitosan có DD 85%.

 Độ pH

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan bị ảnh hƣơng mạnh mẽ bở i pH [33, 37- 38]. pH thấp hơn làm tăng hoạt tính kháng khuẩn đƣợc giải thích bới nhiều lí do, ngoài hiệu ứng ức chế vi sinh vật mục tiêu của các axit . Tsai và Su [38] kiểm tra hoạt đô ̣ng kháng khuẩn của chitosan (DD 98%) đối với E.coli ở giá trị pH khác nhau là 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0. Các hoạt động kháng khuẩn tốt nhất quan sát đƣợc ở pH = 5,0 và chitosan có rất ít hoạt tính kháng khuẩn ở pH = 9,0. Các nhà nghiên cƣ́u khác [33, 37] kết luâ ̣n rằng chitosan không có hoa ̣t tính kháng khuẩn ở pH = 7,0 do nhóm amin và đô ̣ hòa tan của chitosan ở pH này rất kém. Điều này cho thấy hoa ̣t tính kháng khuẩn còn phu ̣ thuô ̣c bản chất cation của chitosan.

 Nhiê ̣t đô ̣

Nhiệt đô ̣ cũng có ảnh hƣởng đến hoa ̣t tính kháng khuẩn củ a chitosan. Nhiê ̣t đô ̣ cao hơn 370

C làm tăng cƣờng hoa ̣t tính kháng khuẩn của chitosan so với nhiê ̣t đô ̣ la ̣nh. Tuy nhiên, ảnh hƣởng lớn nhất về hoạt động kháng khuẩn là môi trƣờng xung quanh. Tsai và Su [38] kiểm tra tác đô ̣ng của nhiê ̣t đô ̣ đến hoa ̣t đô ̣ng kháng

E.coli của chitosan . Huyền phù tế bào trong đê ̣m phosphat (pH = 6) có chứa chitosan với nồng đô ̣ 150ppm đƣợc nuôi ở 4, 15, 25, 370

25 gian khác nhau và đi ̣nh lƣợng số tế bào còn sống sót . Các hoạt tính kháng khuẩn đƣợc tìm thấy tỷ lê ̣ thuâ ̣n với nhiê ̣t đô ̣ . Ở nhiệt độ 25 và 37o

C, các tế bào E.coli

đã hoàn toàn bi ̣ giết chết trong vòng 1 giờ. Tuy nhiên, ở nhiệt độ thấp hơn (4 và 150C) số lƣợng E.coli giảm trong vòng 5h đầu tiên và sau đó ổn đi ̣nh. Các tác giả kết luâ ̣n rằng hoa ̣t đô ̣ng chống vi khuẩn giảm do giảm tỷ lê ̣ tƣơng tác giƣ̃a

chitosan và các tế bào ở nhiê ̣t đô ̣ thấp hơn.

 Cation và polyanion

Các nhà nghiên cứu đề xuất rằng các cation tạo phức hợp với chitosan và làm giảm số nhóm amin dẫn đến giảm hiệu quả diệt khuẩn của chitosan.

1.1.4 Sản xuất Chitin và Chitosan

Chitosan nhƣ đã đề cập ở trên đƣợc chiết xuất từ chất thải giáp xác vỏ nhƣ cua, ghẹ, tôm, tôm hùm. Vỏ tôm chứa khoảng 30-40% protein, 30-50% canxi cacbonat, và chitin từ 20-30% hàm lƣợng chất khô [39]. Tỷ lệ phần trăm khác nhau với các loài giáp xác và theo từng mùa [40]. Phân tách của chitosan từ vỏ tôm thực hiện qua 4 bƣớc cơ bản: khử khoáng (DM), khử protein (DP), khử màu (DC), và deacetyl hóa (DA). Tuy nhiên, sự phân tách của chitin cụ thể gồm chỉ có hai bƣớc: khử khoáng (DM) và khử protein (DP), tƣơng ứng với việc loại canxi cacbonat bằng 1,0 N HCl và loại bỏ các protein bằng NaOH 3%.

Tuy nhiên trình tự khử khoáng và khử protein có thể đƣợc đảo ngƣợc. Các quá trình này thƣờng sử dụng hai phƣơng pháp: phƣơng pháp hóa học dùng axit, kiềm và phƣơng pháp sinh học sử dụng các enzyme protease.

Sau quá trình khử khoáng và protein của vỏ tôm ta thu đƣợc chitin có màu hồng là do sự có mặt của sắc tố astaxanthin. Sắc tố này có thể đƣợc loại bỏ trong bƣớc khử màu (DC). Sau khi khử màu chitin có màu trắng sáng. Chitin thu đƣợc

26 không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiên dẫn xuất của nó là chitosan có khả năng hòa tan trong hầu hết các axit yếu [4].

Một số phương pháp thu nhận chitin và chitosan hiện nay

Có ba phƣơng pháp chính để thu chitin hiện nay là phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp sinh học và phƣơng pháp hóa học kết hợp sinh học.

1.1.4.1 Phương pháp hóa hoc

Qui trình thu nhận chitin từ vỏ tôm bằng phƣơng pháp hóa học cho đến nay có nhiều nhƣng tựu chung lại đều chia 3 giai đoạn: loại bỏ khoáng bằng axit, loại bỏ protein bằng kiềm và tẩy màu loại sắc tố và chất béo. Trên hình 1.1 là một ví dụ qui trình thu nhận chitin bằng phƣơng pháp hóa học.

Chitin sản xuất bằng phƣơng pháp hóa học thƣờng bị deaxetyl hóa và thủy phân một phần. Qui trình sản xuất hóa học sẽ thải ra ngoài môi trƣờng một lƣợng lớn nƣớc thải độc hại gồm axit, kiềm và protein và dịch thủy phân protein làm ô nhiễm môi trƣờng cần phải xử lí trƣớc khi thải ra môi trƣờng [41]. Chất lƣợng của dịch thủy phân protein do phản ứng của axit amin với dung dịch kiềm cũng vì thế mà giảm [41].

27

Hình 1.4. Qui trình thu nhận chitin bằng phương pháp hóa học [4] 1.1.4.2 Phương pháp sinh học

Do nhƣợc điểm của phƣơng pháp hóa học, cho đến nay có khá nhiều các nghiên cứu đi theo hƣớng ứng dụng sinh học để xử lí phế liệu tôm. Trong phƣơng pháp sinh học ngƣời ta sử dụng vi khuẩn sinh protease [42-47] hay chế phẩm protease [48-52] để loại protein, vi khuẩn lactic [53-55] hay Bacillus [45, 47] để loại khoáng.

Quá trình khử protein bằng phƣơng pháp sinh học thực chất là quá trình thủy phân protein có trong phế liệu tôm bằng enzym protease hay bằng vi sinh vật sinh protease.

Theo nghiên cứu của Jo, chủng Serratia marcescans FS-3 có thể khử tới 84% protein sau 7 ngày lên men. Trong nghiên cứu khác của Oh [43], chủng

28

Pseudomonas aeruginosa K-187 có thể loại đƣợc 78% protein cũng sau 7 ngày lên men. Nghiên cứu của Sini chỉ ra rằng chủng Bacillus subtilis không những có thể loại đƣợc 84% protein mà còn loại đƣợc tới 72% khoáng sau 12 ngày lên men. Phƣơng pháp dùng vi sinh vật có ƣu điểm là rẻ tiền do chỉ cần thêm nguồn cacbon là glucose hay rỉ đƣờng nhƣng lại có nhƣợc điểm là thời gian thƣờng kéo dài.

Một phƣơng pháp sinh học khác loại protein cũng khá hiệu quả là phƣơng pháp dùng chế phẩm protease. Các chế phẩm enzym sử dụng khá đa dạng nhƣ trypsin, papain, pepsin [48], chymotrysin, pancreatin [49] nhƣng có hiệu quả và hay sử dụng hơn cả là Alcalase [49-52]. Phƣơng pháp enzym có ƣu điểm là thời gian ngắn (trong vài giờ) và có thể thu hồi protein và asthaxatin có chất lƣợng cao làm thức ăn gia súc. Tuy nhiên phƣơng pháp enzym có giá thành cao hơn so với phƣơng pháp vi sinh.

Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp enzym là lƣợng protein còn lại trong chitin thƣờng cao do lƣợng các peptit nhỏ gắn trực tiếp vào phân tử protein chiếm khoảng 4.4-7.9% rất khó loại trong khi bằng phƣơng pháp hóa học có thể giảm đến <1% [41]. Nếu dùng kết hợp protease với sunfat natri và Triton X-100 có thể giảm lƣợng protein còn lại xuống còn 3% [51].

Việc sử dụng vi khuẩn lactic để loại khoáng ra khỏi phế liệu tôm là một xu hƣớng mà hiện nay nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là có thể kết hợp khử protein với khử khóang bằng phƣơng pháp sinh học. Trong quá trình lên men lactic, ở giai đoạn đầu vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác hoạt động, số lƣợng vi khuẩn lactic chiếm đa số. Đồng thời với số lƣợng vƣợt trội vi khuẩn lactic sẽ hấp thụ cơ chất, sinh trƣởng phát triển và sinh ra axit

29 lactic. Axit lactic sẽ làm hạ pH và ức chế hoạt động của vi khuẩn gây thối rữa. Thành phần canxi cacbonat trong vỏ tôm sẽ tác dụng với axit lactic để tạo ra lactat canxi ở dạng không hòa tan. Phản ứng này tƣơng tự nhƣ quá trình khử khoáng bởi HCl trong phƣơng pháp hóa học.

Trong quá trình lên men, protein bị phân hủy do hệ protease có sẵn trong đầu tôm và có trong vi khuẩn lactic

Phƣơng pháp này là dạng ủ chua ban đầu đƣợc phát triển cho bảo quản phế liệu tôm panda trƣớc quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới. Ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bảo quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã đƣợc ứng dụng cho bảo quản cá trong nhiều năm. Hall và De Silva (1994) đã đề xuất phƣơng pháp khử khoáng đơn giản bằng việc lên men lactic nhƣ một phƣơng pháp bảo quản phế liệu [56]. Quá trình lên men lactic phế liệu tôm để thu hồi chitin đã đƣợc nghiên cứu bổ sung thêm nguồn cacbon nhƣ lactose hay dich chiết sắn [56], rỉ đƣờng [57] …Mục đích của quá trình lên men lactic này ban đầu là khử protein, tuy nhiên qua nghiên cứu nhận thấy quá trình khử khóang cũng đồng thời xảy ra [58]. Các yếu tố nhƣ nồng độ giống hay nồng độ nguồn cacbon có ảnh hƣởng đến quá trình khử khóang [58].

So với loại protein, phƣơng pháp sinh học loại khoáng dùng vi khuẩn lactic đạt hiệu quả khá cao, thƣờng loại >90% khoáng [53] thậm chí có thể loại đƣợc đến 99.7% khoáng chỉ trong thời gian 2-3 ngày [59]. So với loại khoáng bằng phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp lên men lactic ngoài việc cho chitin có chất lƣợng cao, thân thiện môi trƣờng còn cho phép tận thu dịch lên men dùng làm thức ăn cho gia súc có giá trị. Tuy vậy nhƣợc điểm của phƣơng pháp là thời gian lên men kéo dài.

30 Trong đa số các nghiên cứu, quá trình sinh học thƣờng chỉ áp dụng cho 1 trong 2 quá trình khử protein hay khử khoáng. Tuy vậy một số các tác giả đã tìm cách dùng phƣơng pháp sinh học hoàn toàn để lên men đồng thời vi khuẩn sinh protease và vi khuẩn tạo axit lactic để loại protein và khoáng đồng thời và đã cho hiệu quả khá cao [59-60]. Nghiên cứu của Rao và Stevens (2006) [61] đã cho thấy dùng Lactobacillus có thể khử 81.6% protein và 59.8% khoáng. Dùng kết hợp 2 loại vi sinh vật Lactobacillus paracasei subsp. tolerans KCTC-3074 và

Serratia marcescens FS-3 có thể khử khóang tới 97% nhƣng lƣợng protein khử đƣợc chỉ đạt 53% . Đã có rất nhiều nghiên cứu về protease sinh tổng hợp bới

Bacillus subtilis. Hầu hết các nghiên cứu đều công bố về khả năng tổng hợp protease kiềm tính và trung tính của Bacillus subtilis [62-65]. Wang đã thu đƣợc protease kiềm tính từ chủng Bacillus subtilis TKU007 lên men trên phế liệu tôm [65]. Trong nghiên cứu của Yang và cộng sự, lên men vỏ tôm với Bacillus subtilis trong 7 ngày có thể loại 88% protein. Nghiên cứu của Sini và cộng sự (2007) [45] đã chỉ ra rằng Bacillus subtilis có thể sản sinh ra axit để loại khoáng ngoài protease. Theo kết quả công bố 84% protein và 72% khoáng bị loại khỏi vỏ tôm sau quá trình lên men bởi Bacillus subtilis. Để thu chitin đạt đƣợc tiêu chuẩn, chitin thu đƣợc sau lên men phải xử lí tiếp bằng NaOH và HCl.

Lƣợng protein và khóang còn lại trong chitin sau khi khử protein bằng enzym thƣờng cao hơn bằng phƣơng pháp kiềm. Lƣợng protein và khóang còn lại tƣơng ứng với phƣơng pháp sinh học và hóa học là 4,5% so với 2,4% và 2,1-2,9% so với 1,6% [52].Để khử khóang triệt để sau quá trình lên men lactic có thể cần đến bƣớc khử khóang tiếp theo bằng axit HCl với nồng độ thấp nhƣ 0.5 M [61]. Do phƣơng pháp sinh học thƣờng loại protein và khoáng không triệt để lại đòi hỏi thời gian dài, các nghiên cứu xử lí vỏ tôm bằng phƣơng pháp sinh học

31 thƣờng kết hợp với phƣơng pháp hóa học nhƣ loại protein bằng sinh học và loại khoáng bằng hóa học (hình 1.5) hay ngƣợc lại.

Hình 1.5. Quy trình thu chitin từ phế liệu vỏ giáp xác

1.1.4.3 Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa