Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ rỉ đƣờng, pH, nhiệt độ, nồng độ giống đến quá trình loại protein và khoáng bằng L. platarum NCDN4. Tiêu chí đánh giá là hàm lƣợng protein và hàm lƣợng khoáng còn lại trong bã chitin và thời gian xử lí. Xác định chất lƣợng chitin thu đƣợc: hàm lƣợng tro, protein dƣ và độ ẩm.
2.3.14 Phương pháp thu nhận chitosan
Chitin thu đƣợc theo phƣơng pháp sinh học đƣợc xử lí với NaOH 40%, tỷ lệ chitin: dịch NaOH 1:10 (w/v) tại nhiệt độ khảo sát 30, 50, 70oC. Chitosan thu đƣợc đem sấy 8h tại nhiệt độ 60o
C và đánh giá chất lƣợng (độ nhớt và mức độ deacetyl hóa). Các quy trình deacetyl sau đó đƣợc tiến hành 2 lần nhƣ sau:
Qui trình 1: deaxetyl chitin tại 30oC trong 4 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70oC trong 24h
63 Qui trình 2: deaxetyl chitin tại 50oC trong 1 ngày sau đó sấy khô và tiến hành deaxetyl lần 2 tại 70oC trong 24h
Qui trình 3: deaxetyl chitin tại 70oC trong 1 ngày và định mức lại bằng NaOH bù chỗ bay hơi và tiến hành deaxetyl tiếp trong 24h
Độ nhớt và mức độ deacetyl hóa của sản phẩm sẽ đƣợc kiểm tra
2.3.15 Phương pháp thủy phân chitosan
Quá trình thủy phân chitosan đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trên hình 2.1. Các ảnh hƣởng của yếu tố nhiệt độ, pH, tỉ lệ E/S đến hiệu suất thủy phân và phổ sản phẩm tạo thành đƣợc nghiên cứu.
Hình 2.3. Qui trình thủy phân chitosan
2.3.16 Kiểm tra phổ sản phẩm bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
Sản phẩm của quá trình thủy phân chitosan bằng enzym đem phân tích dùng phƣơng pháp sắc kí bản mỏng TLC tráng Silica G60 đã đƣợc mô tả bởi Chen và cộng sự [90].
64
Dung môi dùng cho phân tách COS là hỗn hợp với tỷ lệ n-propanol: NH3 (30%) = 1:2. Sử dụng chất hiện màu là dung dịch ninhydrin 0,5 – 1% trong
cồn etanol nguyên chất.
2.3.17 Khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm
Chitosan và COS đƣợc hòa tan trong đệm axetat (0.2 M axetat natri và axit axetic 0.5M, pH 4.5). Xác định độ nhớt của chitosan và COS dùng nhớt kế Oswald. Khối lƣợng phân tử trung bình đƣợc tính toán dựa trên phƣơng trình Mark–Houwink
[] = K.Mva
Trong đó là độ nhớt, K = 3.5 x 10-4 và a=0.76, Mv là khối lƣợng phân tử trung bình của sản phẩm COS [91].
2.3.18 Ứng dụng chitosan thu được để bảo quản thịt
Dung dịch chitosan đƣợc chuẩn bị bằng cách hòa tan chitosan với nồng độ khác nhau, tối đa 1% trong axit axetic 1%. Tiến hành bảo quản nguyên liệu thịt bằng 2 phƣơng pháp nhƣ sau:
+ Phun sƣơng lên bề mặt miếng thịt :
Sử dụng thiết bị máy nén và hệ thống phun sƣơng với áp lực phun là 4 kG/cm2 và 5,4kG/cm2, lƣu lƣợng phun 20ml dịch/kg sản phẩm tƣơng ứng 0,09m2
bề mặt, phun đều lên bề mặt miếng thịt
+ Nhúng trong dung dịch bảo quản trên với tỷ lệ 1 kg/1 lít dung dịch cho ngập miếng thịt, sau đó vớt ra để ráo.
- Các mẫu đƣa đi bảo quản trong các túi PE tiệt trùng hút chân không ở 0- 4°C trong tủ lạnh và sau đó đƣợc đánh giá các theo các chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu thịt:
65 + Hóa lý : pH, hàm lƣợng NH3, độ hao hụt trọng lƣợng, khả năng giữ nƣớc. + Vi sinh vật : Tổng số vi sinh vật hiếu khí, Enterobacteriaceae, Staphylococcus aureus
+ Cảm quan
Chitosan cũng đƣợc nghiên cứu phối hợp với các chất khác: Bổ sung natri diaxetat: 0,1-0,4%, natri lactat: 1-3% vào dung dịch chitosan 0,1-1%. Dùng bài toán quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 với phần mềm Design Expert 8.0.6 để tối ƣu hóa nồng độ các chất xử lý chitosan, natri lactat, natri diaxetat. Dịch sử dụng đƣợc bổ sung thêm nisin với nồng độ khác nhau và đánh giá hiệu quả bảo quản thông qua các chỉ tiêu hóa lý, vi sinh và cảm quan nhƣ trên.
2.4 Cách tính hiệu suất loại protein và loại khoáng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hiệu suất thủy phân protein: DP (%) = [ Po x O − (Pr x R)]
(Po x O) x 100
Hiệu suất khử khoáng đƣợc tính theo công thức DM (%) = [ Ao x O − Ar x R ]
(Ao x O) x 100
Po, Pr: Hàm lƣợng protein (g/g) tƣơng ứng của mẫu phế liệu trƣớc và sau khi thủy phân bằng enzyme neutrase
Ao, Ar : Hàm lƣợng khoáng (g/g) tƣơng ứng mẫu PLT trƣớc và sau lên men lactic khử khoáng.
66
2.5 Phương phá p tính toán và xử lý số liê ̣u
Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và đƣợc xƣ̉ lý thống kê theo phần mềm Excel. Sai số trong phép đi ̣nh lƣợng đƣợc tính toán trong Excel , sƣ̉ du ̣ng công thƣ́c tính sai số toàn p hƣơng trung bình . Tối ƣu hóa dùng bài toán quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 với phần mềm Design Expert 8.0.6
67
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Nghiên cứu tạo chế phẩm chitosan và các dẫn xuất COS từ phế liệu nhà máy thủy sản máy thủy sản
3.1.1 Lựa chọn phương án thu hồi chitin từ phế liệu tôm (PLT) bằng phương pháp sinh học
3.1.1.1 Dùng chế phẩm Neutrase 1.5L
Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân tới quá trình khử protein
Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình thủy phân cho thấy tại 50oC cho hiệu suất loại protein cao nhất tƣơng ứng với hàm lƣợng protein dƣ thấp nhất. Dựa vào một số nghiên cứu trƣớc đây và kết quả nghiên cứu thực tế chúng tôi chọn nhiệt độ cho quá trình khử protein là 50oC.
Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình loại protein
Nhiệt độ (o C) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%) 45 89,30 ± 0,52 13,62 ± 1,24 50 90,78 ± 0,78 9,28 ± 1,22 55 89,76 ± 0,39 10,37 ± 1,00 60 87,92 ± 0,39 16,00 ± 1,97
68
Ảnh hưởng của pH dịch thủy phân tới quá trình khử protein
Bảng 3.1.2 đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho enzyme neutraza hoạt động là 8.
Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình khử protein
pH DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%)
6 82.99 ± 1.76 18.26 ± 1.30
7 88.10 ± 0.78 14.66 ± 0.38
8 88.65 ± 2.34 13.76 ± 2.17
9 85.61 ± 0.39 17.42 ± 0.27
Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein
Số liệu ở bảng 3.3 cho thấy DP tăng với khi thời gian thủy phân tăng, từ 81.47% sau 1h lên đến 90.44% sau 5h thủy phân. Thời gian 5h thủy phân, hàm lƣợng protein có giảm so với 4h nhƣng không nhiều. Nhƣ vậy, với thời gian 4h thủy phân là tƣơng đối phù hợp cho việc khử protein trong PLT của enzyme neutraza.
Bảng 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới quá trình khử protein (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian (h) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%)
1 81.47 ± 0.39 19.63 ± 0.75
2 84.09 ± 0.59 17.94 ± 1.19
3 86.44 ± 0.39 15.74 ± 1.00
4 88.37 ± 1.56 13.11 ± 1.83
69
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme tới quá trình khử protein
Theo số liệu ở bảng 3.4 cho thấy khi tỉ lệ enzyme tăng dần, hiệu quả khử protein cũng tăng dần. Ở nồng độ E/PLT nghiên cứu tăng dần từ 1% lên đến 4%, DP cũng tăng dần từ 78.29% lên đến 94.47% và hàm lƣợng protein còn lại giảm dần từ 24.85% xuống còn 7.37% (bảng 3.4).
Tuy nhiên, nếu lƣợng enzyme cho vào quá cao sẽ gây lãng phí.
Bảng 3.1.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme tới quá trình khử protein
Tỷ lệ E (%) DP (%) Hàm lƣợng protein còn lại (%) 1 78.29 ± 0.20 24.85 ± 0.33 1.5 85.62 ± 0.52 18.95 ± 0.62 2 86.26 ± 0.39 15.80 ± 0.01 2.5 88.38 ± 0.78 15.23 ± 1.25 3 91.14 ± 0.52 10.94 ± 0.27 3.5 92.34 ± 0.65 8.29 ± 0.19 4 94.47 ± 0.26 7.37 ± 0.23
Khi kết hợp điều kiện thích hợp trên (pH 8, nhiệt độ 50oC, 4h, tỉ lệ enzyme/PLT là 1,0%) với việc sử dụng cánh khuấy hiệu suất khử protein sau 1 h tăng từ 78.29±0.39% lên 87.44% ± 0.32, hàm lƣợng protein còn lại là 11.31% ± 0.25. Khi không khuấy thì khả năng tiếp xúc của enzyme và cơ chất kém nên phản ứng xảy ra chậm và hiệu quả không cao. Khi kết hợp điều kiện khấy thì hàm lƣợng protein giảm rõ rệt so với không khuấy.
70 Sau khi khử protein phế liệu tôm với qui mô lớn hơn 500g bằng enzyme neutraza ở điều kiện pH 8, nhiệt độ 50o
C, thời gian 4h, tỉ lệ enzyme/ PLT là 1% bã chitin có hàm lƣợng khoáng không thay đổi và hàm lƣợng protein giảm từ 45.62% xuống còn 11.31%.
3.1.1.2 Dùng chế phẩm Alcalse 2.4L
Căn cứ vào đặc tính của enzym alcalase, lựa chọn miền khảo sát nhƣ trên bảng 3.1.5.
Bảng 3.1.5. Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát
Yếu tố Ký hiệu Đơn vị Mức - -1 0 +1 + pH A 7.79289 8 8.5 9 9.20711 Nhiệt độ B 0C 46.8934 50 57.5 65 68.1066 Lƣợng enzym C ml 0.792893 1 1.5 2 2.20711 Thời gian D phút 58.934 90 165 240 271.066 Khả năng khử protein đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng protein còn lại sau khi thủy phân và rửa trung tính. Kết quả thực nghiệm khử protein theo quy hoạch trực giao bậc hai, bốn yếu tố.
Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số và sự tƣơng thích của mô hình đƣợc tiến hành bằng phân tích hồi quy:
- Chuẩn F của mô hình bằng: 32.90 cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99.99% (p<0.0001).
71 - Hệ số tƣơng quan bội của mô hình là R2 = 0.9705 và Adj R2 = 0.9410 cho thấy mô hình hoàn toàn tƣơng thích với thực nghiệm.
- Kết quả kiểm tra sự không có nghĩa của mô hình là “not significant” cũng cho thấy mô hình hoàn toàn có nghĩa.
Hàm mục tiêu hàm lƣợng protein còn lại dạng thực là: R1 = +219.04183- 21.21000 * pH-3.60167 * Nhiet do-3.39883 * Luong enzim+0.014933 * thoi gian +0.38200 * pH * Nhiet do-0.99000 * pH * Luong enzim+0.19767* Nhiet do * Luong enzim-0.015633 * Luong enzim * Thoi gian
Trên hình 3.1 biểu diễn bề mặt đáp ứng hàm lƣợng protein dƣ khi thay đổi các thông số pH và nhiệt độ (A) hay thời gian và lƣợng enzym (B).
Hình 3.1.1. Bề mặt đáp ứng của quá trình khử protein.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH thủy phân (A) và Ảnh hƣởng của thời gian và lƣợng enzym (B) đến quá trình khử protein bằng Alcalse
Kết quả tối ƣu của quá trình khử protein bằng enzym alcalase là nhiệt độ 50oC, pH 9 và thời gian 165 phút với lƣợng enzym là 2 mL/100g protein (1ml Alcalase tƣơng ứng với 3 AU) tức là 60 AU/kg protein .
72 Tiến hành thực nghiệm theo điều kiện tối ƣu cho thấy hàm lƣợng protein còn lại trong vỏ tôm là 10.42% thấp hơn so với Neutrase là 11.31%. Tuy nhiên so với kết quả nghiên cứu của Holanda thì vẫn cao hơn [9] (Hàm lƣợng protein còn lại sau khi khử protein bằng enzym alcalase là 9.19 ±0.1 %). Sự khác nhau có thể do trong nghiên cứu của Holanda dùng PLT từ loại Xiphopenaeus kroyeri khác với PLT sú sử dụng trong nghiên cứu này. Hơn nữa lƣợng enzym sử dụng trong nghiên cứu của Holanda là 90 AU/kg protein (so với 60 AU trong nghiên cứu này).
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng protein trong bã chitin không phụ thuộc chế phẩm Neutrase, Alcalase còn lại trong bã chitin đều >10%, cao hơn so với yêu cầu (<5%). Để đáp ứng yêu cầu chỉ tiêu chất lƣợng của chitin (hàm lƣợng tro < 5%, hàm lƣợng protein < 5%) cần thiết phải tiến hành quá trình khử protein lần 2.
Hình 3.1.2. Phế liệu tôm trước và sau khi khử protein lần 1 bằng Alcalase (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(A)Trƣớc khi loại protein (B) Sau khi loại protein
Tiến hành khử protein lần 2 theo 2 hƣớng: bằng enzym alcalase hoặc Khử protein bằng NaOH 1%.
73
Bảng 3.1.6. So sánh 2 phương pháp hóa học và enzym
Phƣơng pháp Tỉ lệ PLT/nƣớc Thời gian (phút) Nhiệt độ Hàm lƣợng protein dƣ (%) NaOH 1% 1:10 240 50oC 2.29 Alcalase 2.4L tỉ lệ E/S 30 AU/kg protein, pH 9 1:10 165 50oC 3.30
Nhƣ vậy việc loại protein lần 2 có thể tiến hành theo 2 cách đều cho hàm lƣợng protein dƣ <5%. Với yêu cầu thu nhận chitin bằng phƣơng pháp sinh học có thể áp dụng khử protein lần 2. Việc loại protein lần 2 tuy vậy mất thời gian, giá thành cao mà không loại khoáng đƣợc. Do vậy tiến hành nghiên cứu lên men bã chitin sau xử lí khử protein bằng Alcalase lần 1. Kết quả ứng dụng vi khuẩn lactic cho loại khoáng bã chitin sau khi loại protein bằng Alcalase đƣợc trình bày phần 3.1.16.
3.1.1.3 Phương pháp thu nhận chitin ứng dụng B. subtilis
B. subtilis là vi khuẩn sinh protease mạnh nên có thể loại protein PLT. Đồng thời các nghiên cứu trƣớc đã chỉ ra rằng B. subtilis sử dụng các loại đƣờng để tăng trƣởng và đồng thời sản xuất ra axit. Axit tạo thành sẽ đóng vai trò trong quá trình khử khoáng. Đến cuối giai đoạn lên men pH tăng lại do nguồn đƣờng cạn kiệt và do vậy quá trình sản xuất axit bị ngừng lại.
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch lên men ban đầu
pH có ảnh hƣởng lớn đến động học sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis, việc sinh enzyme proteaza và hiệu suất khử protein, hiệu suất khử khoáng.
74
Hình 3.1.3. Sự thay đổi pH trong quá trình lên men.
Các biểu tƣợng trên hình vẽ pH 6.5 (), pH 7 (∆) và pH 7.5 ()
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.4 cho thấy pH sau 12h giảm nhiều nhất không phụ thuộc pH ban đầu. Tuy nhiên tại pH 7 thì giá trị pH giảm nhiều nhất xuống tận 5.2, thấp hơn so với các giá trị pH ban đầu khác và đến tận 48h sau lên men mới tăng trở lại giá trị ban đầu. Tại pH 6.5 và 7.5 chỉ sau 24h pH đã tăng đến 7.5. Dựa vào giá trị pH có thể thấy tại pH 7 B. subtilis CH36 sinh trƣởng tốt nhất và do vậy đã sử dụng đƣờng và sản sinh ra axit làm pH giảm mạnh.
Kết quả xác định hiệu suất khử khoáng và protein cũng nhƣ hàm lƣợng khoáng và protein dƣ đƣợc biểu diễn trên bảng 3.1.7. Hiệu suất loại protein tăng khi pH tăng từ 6.5 đến 7.5 tuy nhiên sự tăng là không đáng kể. Hiệu suất loại khoáng cao nhất tại pH 7 đạt 71.19% ứng với giá trị pH thấp nhất, tiếp đó là tại pH 6.5 và kém nhất tại pH 7.5 (hình 3.4). Để có hiệu suất loại protein và khoáng tốt chúng tôi lựa chọn pH= 7 cho các quá trình tiếp theo.
75
Bảng 3.1.7. Ảnh hƣởng của pH ban đầu tới hiệu suất loại protein và loại khoáng
pH ban đầu Hiệu suất loại protein (%) Hiệu suất loại khoáng (%)
6.5 91.06 68.40
7 92.21 71.19
7.5 92.29 67.46
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ban đầu
Ở nồng độ đƣờng bằng 7.5% pH thay đổi rất ít trong quá trình lên men. Ở nồng độ đƣờng 12.5- 15% sau 12- 24h lên men pH giảm mạnh so với pH ban đầu, tƣơng ứng với quá trình khử khoáng rất tốt (Bảng 3.1.8). Sự giảm pH mạnh tuy vậy có ảnh hƣởng đến quá trình loại protein. Hiệu suất loại protein tại nồng độ đƣờng 12.5-15% đƣờng giảm khá nhiều so với tại nồng độ đƣờng 7.5-10%. Để dung hòa giữa hiệu suất loại protein và loại khoáng chọn nồng độ đƣờng 12.5%.
Hình 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung đến sự thay đổi pH của quá trình lên men.
76
Bảng 3.1.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ đường tới hiệu quả loại protein và khoáng
Nồng độ đƣờng (%) DP (%) DM (%)
7,5 89.94 61.83
10 89.88 70.12
12,5 87.23 73.42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15 84.40 87.12
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.9 cho thấy pH sau 12h lên men bắt đầu giảm nhiều so với pH ban đầu và giữ suốt cho tới kết thúc quá trình lên men. Tƣơng ứng với giá trị pH thấp, hiệu suất loại khoáng đều đạt cao trên 84%. Kết quả ở bảng 3.1. 9 đã chỉ ra rằng tỷ lệ tiếp giống ở 7.5% (v/v) là thích hợp cho cả quá trình khử protein và khử khoáng. Ở tỷ lệ này hiệu quả khử protein đạt 90.85% và khoáng đạt 92.16%. Ở tỷ lệ tiếp giống thấp hoặc cao hơn hiệu quả khử protein và khử khoáng đều giảm. Vì vậy tiếp giống ở 7.5% sẽ đƣợc chọn cho thí nghiệm tiếp theo.
77
Hình 3.1.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến sự thay đổi pH trong quá trình lên men.
Tỉ lệ giống 10% (), 7.5% (∆), 5% () và 2.5% ().
Bảng 3.1.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới hiệu quả loại protein và khoáng
Tỉ lệ tiếp giống (%) DP (%) DM (%)
2.5 87.59 86.63
5 87.37 84.49
7.5 90.85 92.16