3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1.1.2 Dùng chế phẩm Alcalse 2.4L
Căn cứ vào đặc tính của enzym alcalase, lựa chọn miền khảo sát nhƣ trên bảng 3.1.5.
Bảng 3.1.5. Giá trị mã hóa và thực nghiệm của các yếu tố khảo sát
Yếu tố Ký hiệu Đơn vị Mức - -1 0 +1 + pH A 7.79289 8 8.5 9 9.20711 Nhiệt độ B 0C 46.8934 50 57.5 65 68.1066 Lƣợng enzym C ml 0.792893 1 1.5 2 2.20711 Thời gian D phút 58.934 90 165 240 271.066 Khả năng khử protein đƣợc đánh giá bằng hàm lƣợng protein còn lại sau khi thủy phân và rửa trung tính. Kết quả thực nghiệm khử protein theo quy hoạch trực giao bậc hai, bốn yếu tố.
Kiểm tra sự có nghĩa của các hệ số và sự tƣơng thích của mô hình đƣợc tiến hành bằng phân tích hồi quy:
- Chuẩn F của mô hình bằng: 32.90 cho thấy mô hình hoàn toàn có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 99.99% (p<0.0001).
71 - Hệ số tƣơng quan bội của mô hình là R2 = 0.9705 và Adj R2 = 0.9410 cho thấy mô hình hoàn toàn tƣơng thích với thực nghiệm.
- Kết quả kiểm tra sự không có nghĩa của mô hình là “not significant” cũng cho thấy mô hình hoàn toàn có nghĩa.
Hàm mục tiêu hàm lƣợng protein còn lại dạng thực là: R1 = +219.04183- 21.21000 * pH-3.60167 * Nhiet do-3.39883 * Luong enzim+0.014933 * thoi gian +0.38200 * pH * Nhiet do-0.99000 * pH * Luong enzim+0.19767* Nhiet do * Luong enzim-0.015633 * Luong enzim * Thoi gian
Trên hình 3.1 biểu diễn bề mặt đáp ứng hàm lƣợng protein dƣ khi thay đổi các thông số pH và nhiệt độ (A) hay thời gian và lƣợng enzym (B).
Hình 3.1.1. Bề mặt đáp ứng của quá trình khử protein.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH thủy phân (A) và Ảnh hƣởng của thời gian và lƣợng enzym (B) đến quá trình khử protein bằng Alcalse
Kết quả tối ƣu của quá trình khử protein bằng enzym alcalase là nhiệt độ 50oC, pH 9 và thời gian 165 phút với lƣợng enzym là 2 mL/100g protein (1ml Alcalase tƣơng ứng với 3 AU) tức là 60 AU/kg protein .
72 Tiến hành thực nghiệm theo điều kiện tối ƣu cho thấy hàm lƣợng protein còn lại trong vỏ tôm là 10.42% thấp hơn so với Neutrase là 11.31%. Tuy nhiên so với kết quả nghiên cứu của Holanda thì vẫn cao hơn [9] (Hàm lƣợng protein còn lại sau khi khử protein bằng enzym alcalase là 9.19 ±0.1 %). Sự khác nhau có thể do trong nghiên cứu của Holanda dùng PLT từ loại Xiphopenaeus kroyeri khác với PLT sú sử dụng trong nghiên cứu này. Hơn nữa lƣợng enzym sử dụng trong nghiên cứu của Holanda là 90 AU/kg protein (so với 60 AU trong nghiên cứu này).
Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lƣợng protein trong bã chitin không phụ thuộc chế phẩm Neutrase, Alcalase còn lại trong bã chitin đều >10%, cao hơn so với yêu cầu (<5%). Để đáp ứng yêu cầu chỉ tiêu chất lƣợng của chitin (hàm lƣợng tro < 5%, hàm lƣợng protein < 5%) cần thiết phải tiến hành quá trình khử protein lần 2.
Hình 3.1.2. Phế liệu tôm trước và sau khi khử protein lần 1 bằng Alcalase
(A)Trƣớc khi loại protein (B) Sau khi loại protein
Tiến hành khử protein lần 2 theo 2 hƣớng: bằng enzym alcalase hoặc Khử protein bằng NaOH 1%.
73
Bảng 3.1.6. So sánh 2 phương pháp hóa học và enzym
Phƣơng pháp Tỉ lệ PLT/nƣớc Thời gian (phút) Nhiệt độ Hàm lƣợng protein dƣ (%) NaOH 1% 1:10 240 50oC 2.29 Alcalase 2.4L tỉ lệ E/S 30 AU/kg protein, pH 9 1:10 165 50oC 3.30
Nhƣ vậy việc loại protein lần 2 có thể tiến hành theo 2 cách đều cho hàm lƣợng protein dƣ <5%. Với yêu cầu thu nhận chitin bằng phƣơng pháp sinh học có thể áp dụng khử protein lần 2. Việc loại protein lần 2 tuy vậy mất thời gian, giá thành cao mà không loại khoáng đƣợc. Do vậy tiến hành nghiên cứu lên men bã chitin sau xử lí khử protein bằng Alcalase lần 1. Kết quả ứng dụng vi khuẩn lactic cho loại khoáng bã chitin sau khi loại protein bằng Alcalase đƣợc trình bày phần 3.1.16.
3.1.1.3 Phương pháp thu nhận chitin ứng dụng B. subtilis
B. subtilis là vi khuẩn sinh protease mạnh nên có thể loại protein PLT. Đồng thời các nghiên cứu trƣớc đã chỉ ra rằng B. subtilis sử dụng các loại đƣờng để tăng trƣởng và đồng thời sản xuất ra axit. Axit tạo thành sẽ đóng vai trò trong quá trình khử khoáng. Đến cuối giai đoạn lên men pH tăng lại do nguồn đƣờng cạn kiệt và do vậy quá trình sản xuất axit bị ngừng lại.
Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dịch lên men ban đầu
pH có ảnh hƣởng lớn đến động học sinh trƣởng của chủng Bacillus subtilis, việc sinh enzyme proteaza và hiệu suất khử protein, hiệu suất khử khoáng.
74
Hình 3.1.3. Sự thay đổi pH trong quá trình lên men.
Các biểu tƣợng trên hình vẽ pH 6.5 (), pH 7 (∆) và pH 7.5 ()
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.4 cho thấy pH sau 12h giảm nhiều nhất không phụ thuộc pH ban đầu. Tuy nhiên tại pH 7 thì giá trị pH giảm nhiều nhất xuống tận 5.2, thấp hơn so với các giá trị pH ban đầu khác và đến tận 48h sau lên men mới tăng trở lại giá trị ban đầu. Tại pH 6.5 và 7.5 chỉ sau 24h pH đã tăng đến 7.5. Dựa vào giá trị pH có thể thấy tại pH 7 B. subtilis CH36 sinh trƣởng tốt nhất và do vậy đã sử dụng đƣờng và sản sinh ra axit làm pH giảm mạnh.
Kết quả xác định hiệu suất khử khoáng và protein cũng nhƣ hàm lƣợng khoáng và protein dƣ đƣợc biểu diễn trên bảng 3.1.7. Hiệu suất loại protein tăng khi pH tăng từ 6.5 đến 7.5 tuy nhiên sự tăng là không đáng kể. Hiệu suất loại khoáng cao nhất tại pH 7 đạt 71.19% ứng với giá trị pH thấp nhất, tiếp đó là tại pH 6.5 và kém nhất tại pH 7.5 (hình 3.4). Để có hiệu suất loại protein và khoáng tốt chúng tôi lựa chọn pH= 7 cho các quá trình tiếp theo.
75
Bảng 3.1.7. Ảnh hƣởng của pH ban đầu tới hiệu suất loại protein và loại khoáng
pH ban đầu Hiệu suất loại protein (%) Hiệu suất loại khoáng (%)
6.5 91.06 68.40
7 92.21 71.19
7.5 92.29 67.46
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng ban đầu
Ở nồng độ đƣờng bằng 7.5% pH thay đổi rất ít trong quá trình lên men. Ở nồng độ đƣờng 12.5- 15% sau 12- 24h lên men pH giảm mạnh so với pH ban đầu, tƣơng ứng với quá trình khử khoáng rất tốt (Bảng 3.1.8). Sự giảm pH mạnh tuy vậy có ảnh hƣởng đến quá trình loại protein. Hiệu suất loại protein tại nồng độ đƣờng 12.5-15% đƣờng giảm khá nhiều so với tại nồng độ đƣờng 7.5-10%. Để dung hòa giữa hiệu suất loại protein và loại khoáng chọn nồng độ đƣờng 12.5%.
Hình 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung đến sự thay đổi pH của quá trình lên men.
76
Bảng 3.1.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ đường tới hiệu quả loại protein và khoáng
Nồng độ đƣờng (%) DP (%) DM (%)
7,5 89.94 61.83
10 89.88 70.12
12,5 87.23 73.42
15 84.40 87.12
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Kết quả thu đƣợc thể hiện ở hình 3.6 và bảng 3.9 cho thấy pH sau 12h lên men bắt đầu giảm nhiều so với pH ban đầu và giữ suốt cho tới kết thúc quá trình lên men. Tƣơng ứng với giá trị pH thấp, hiệu suất loại khoáng đều đạt cao trên 84%. Kết quả ở bảng 3.1. 9 đã chỉ ra rằng tỷ lệ tiếp giống ở 7.5% (v/v) là thích hợp cho cả quá trình khử protein và khử khoáng. Ở tỷ lệ này hiệu quả khử protein đạt 90.85% và khoáng đạt 92.16%. Ở tỷ lệ tiếp giống thấp hoặc cao hơn hiệu quả khử protein và khử khoáng đều giảm. Vì vậy tiếp giống ở 7.5% sẽ đƣợc chọn cho thí nghiệm tiếp theo.
77
Hình 3.1.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến sự thay đổi pH trong quá trình lên men.
Tỉ lệ giống 10% (), 7.5% (∆), 5% () và 2.5% ().
Bảng 3.1.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống tới hiệu quả loại protein và khoáng
Tỉ lệ tiếp giống (%) DP (%) DM (%)
2.5 87.59 86.63
5 87.37 84.49
7.5 90.85 92.16
10 88.85 87.96
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men
Kết quả từ bảng 3.10 cho thấy thời gian lên men càng lâu thì hiệu quả khử protein càng tốt. Hiệu suất loại khoáng tuy vậy giảm mạnh khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 60h.
78
Bảng 3.1.10. Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hiệu quả loại protein và khoáng
Thời gian lên men (h)
pH Hiệu suất loại
protein (%)
Hiệu suất loại khoáng (%)
24 5.24 80.76 92.32
36 4.81 83.35 91.56
48 5.02 88.85 91.36
60 7.01 92.17 79.5
pH tăng đã làm cho khoáng đã bị loại ra có xu hƣớng bám lại vào PLT. Bởi vậy 48h lên men là phù hợp cho sự khử protein và khử khoáng. Hiệu suất loại protein và khoáng tƣơng ứng 88.85% và 91.36%. Hàm lƣợng protein và khoáng dƣ tƣơng ứng là 21.30% và 11.54%.
Nhƣ vậy các yếu tố tối ƣu cho quá trình lên men là pH= 7, nồng độ đƣờng 12,5%, tỷ lệ tiếp giống 7,5%, thời gian lên men 48h. Hàm lƣợng protein và khoáng dƣ tuy vậy đều còn khá cao nên để thu chitin đạt yêu cầu cần xử lí tiếp. Tuy nhiên do mùi lên men B. sutilis CH36 khó chịu mà hiệu suất loại khoáng và protein không cao nên chứng tôi không nghiên cứu tiếp.
3.1.1.4 Phương pháp thu nhận chitin ứng dụng vi khuẩn lactic Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Trong sản xuất, việc chọn lựa đƣợc các nguồn đƣờng bổ sung có giá thành rẻ, đáp ứng đƣợc yêu cầu kỹ thuật, đem lại hiệu quả cao là ƣu tiên hàng đầu. Kết quả trong bảng 3.1.11 cho thấy, khi sử dụng nguồn rỉ đƣờng hiệu quả xử lý đầu, vỏ tôm không cao, pH sau lên men cao nên không ức chế đƣợc vi sinh vật gây thối rữa phát triển, chitin thu đƣợc có màu sẫm. Khi sử dụng đƣờng glucose pH
79 sau lên men thấp, ức chế đƣợc vi sinh vật tạp nhiễm và gây mùi, hòa tan đƣợc các chất khoáng trong vỏ tôm, dịch lên men màu hồng vàng và có mùi chua đặc trƣng. Ngoài ra sản phẩm chitin thu đƣợc có màu đỏ hồng, mỏng và dai. Do vậy chúng tôi chọn glucose làm nguồn đƣờng bổ sung cho các thí nghiệm tiếp theo.
Bảng 3.1.11. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến pH của dịch nuôi cấy
Nguồn cacbon Thời gian(ngày) pH Rỉ đƣờng Glucose 1 5.55 4.81 2 5.27 4.5 3 5.83 4.02 4 6.1 4.7 5 6.2 5.12
Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống
Kết quả trên hình 3.1.6 cho thấy giá trị pH chỉ giảm trong 3 ngày đầu tƣơng ứng với lƣợng acid tạo thành cũng chỉ tăng trong 3 ngày đầu. Đến ngày thứ 5 lƣợng acid tạo thành đã gần bằng không và pH tăng lên đến giá trị 5.6-6.2 tùy theo tỉ lệ tiếp giống.
80
Hình 3.1.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sự thay đổi pH và nồng độ acid tạo thành
(A)-sự thay đổi pH; (B)-nồng độ acid tạo thành. Ký hiệu ♦15%, ■20%,▲25%
Khi tăng tỷ lệ tiếp giống từ 15% lên 25% thì pH dịch nuôi cấy giảm và lƣợng acid tạo tăng trong 3 ngày đầu. Tuy nhiên trong ngày thứ 4 và thứ 5 thì giá trị pH tại tỷ lệ tiếp giống 20% có xu hƣớng tăng chậm hơn tại tỷ lệ tiếp giống 25% và tƣơng ứng lƣợng acid tạo thành cũng nhiều hơn. Các mẫu thí nghiệm sau 5 ngày lên men đƣợc đem đi xác định hiệu suất loại protein và hiệu suất khử khoáng. Kết quả đƣợc trình bày ở hình 3.8 cho thấy khi tăng tỷ lệ giống thì hiệu suất khử khoáng thay đổi không đáng kể. Hiệu suất khử protein giảm mạnh ở tỷ lệ tiếp giống 25%. Nồng độ tiếp giống cao làm pH giảm mạnh trong những ngày đầu (hình 3.1.7) đã ức chế protease kiềm tính có sẵn trong PLT. Chính vì vậy, tỷ lệ vi khuẩn lactic so với phế liệu tôm là 20% (v/v) đƣợc chọn để tiếp tục các thí nghiệm tiếp theo.
81
Hình 3.1.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới hiệu suất khử khoáng và khử protein
Ký hiệu (□) – hiệu suất khử khoáng; (■) – hiệu suất khử protein
Ảnh hưởng của nồng độ đường glucose
Hình 3.1.8. Ảnh hưởng của nồng độ glucose đến sự thay đổi pH và nồng độ acid tạo thành
(A)-sự thay đổi pH; (B)-nồng độ acid tạo thành Ký hiệu ♦10%, ■12.5%,▲15%
Từ kết quả hình 3.1.8 ta thấy nồng độ glucose càng cao thì pH càng thấp và lƣợng acid tạo thành càng cao. Các mẫu tôm sau 5 ngày lên men đƣợc đem đi xác định hiệu suất loại protein và hiệu suất khử khoáng.
82
Hình 3.1.9. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hiệu suất khử khoáng và khử protein
Ký hiệu (□) – hiệu suất khử khoáng; (■) – hiệu suất khử protein
Kết quả trên hình 3.1.9 cho ta thấy khi nồng độ glucose tăng từ 10% đến 15% thì hiệu suất loại khoáng tăng từ 87.71% lên tới 97.39%. Kết quả này cũng phù hợp với lƣợng axit tạo thành và giá trị pH ở đồ thị 3.1.9. Tuy vậy quá trình loại protein ngƣợc lại với quá trình loại khoáng giảm dần khi tăng nồng độ đƣờng. Nhận thấy khi tăng nồng độ đƣờng từ 12,5 % lên 15% (w/w) thì quá trình khử khoáng không tăng đáng kể chỉ khoảng 3.4% nhƣng hiệu suất loại protein giảm đi nhiều gần 14%. Quá trình loại protein giảm do lƣợng acid tạo thành nhiều làm giảm pH và do vậy làm giảm hoạt động của các protease kiềm tính có sẵn trong PLT. Vì vậy, để đạt hiệu quả loại cả khoáng và protein thì nồng độ đƣờng là 12.5% (w/w) đƣợc chọn để thực hiện tiếp các thí nghiệm tiếp theo.
Ảnh hưởng của nồng độ NaCl
Vi khuẩn lactic có khả năng phát triển tốt trong môi trƣờng có muối NaCl. Hơn nữa, bổ sung muối có thể ức chế sự phát triển của các vi sinh vật thối rữa. Bởi vì trong môi trƣờng PLT không thanh trùng có nhiều vi khuẩn tạp nhiễm phát triển gây thối rữa. Do vậy, ảnh hƣởng của nồng độ NaCl đã đƣợc nghiên cứu.
83
Hình 3.1.10. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến pH và nồng độ acid tạo thành
(A)-sự thay đổi pH; (B)-nồng độ acid tạo thành Ký hiệu ♦2%, ■4%,▲6
Từ kết quả trên hình 3.1.10 cho thấy khi tăng nồng độ muối NaCl thì pH dịch nuôi cấy cao hơn và lƣợng acid tạo thành giảm. Điều này chứng tỏ NaCl không những chỉ ức chế vi khuẩn gây thối rữa mà ức chế luôn cả vi khuẩn lactic. Sau 5 ngày lên men, các mẫu tôm đƣợc đem đi xác định hiệu suất khử khoáng và khử protein.
Từ hình 3.1.11 ta nhận thấy nồng độ NaCl có ảnh hƣởng tới hiệu suất khử khoáng và khử protein. Khi bổ sung nồng độ NaCl thích hợp 2% (w/w) thì hiệu suất khử khoáng và hiệu suất khử protein đạt giá trị cao nhất ứng là 94.05% và 33.85%, không giảm nhiều so với không dùng NaCl. Tuy nhiên khi tăng nồng độ NaCl lên 4% hay 6% thì hiệu suất khử khoáng và hiệu suất khử protein đều giảm. Vì vậy, quá trình lên men PLT đƣợc bổ sung 2% (w/w) NaCl là thích hợp nhất.
84
Hình 3.1.11. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl tới hiệu suất khử khoáng và khử protein
Ký hiệu (□) – hiệu suất khử khoáng; (■) – hiệu suất khử protein
Ảnh hưởng của pH dịch tôm ban đầu
Hình 3.1.12. Ảnh hưởng của pH dịch ban đầu đến sự thay đổi pH của quá trình lên men và nồng độ acid tạo thành
(A)-sự thay đổi pH; (B)-nồng độ acid tạo thành Ký hiệu ♦pH5,■pH6,▲pH7
85 Kết quả đƣợc trình bày ở đồ thị 3.1.12.
Từ kết quả trên hình 3.1.12 cho thấy khi điều chỉnh pH của dịch tôm ban đầu càng thấp thì pH của dich lên men càng thấp và lƣợng acid tạo thành càng cao. Mặc dù vi khuẩn lactic phát triển tốt ở pH 5.5-6, trong trƣờng hợp này, L.
plantarum NCDN4 vẫn có thể phát triển tại pH ban đầu là 5 và phát triển khá tốt
thể hiện lƣợng acid tạo thành cao hơn pH 6 và 7. Khả năng có thể do pH thấp ban đầu đã đƣợc trung hòa ngay bởi lƣợng CaCO3 có trong vỏ tôm do vậy nâng pH ban đầu lên cao hơn 5. Sau 5 ngày lên men, các mẫu tôm đƣợc đem đi xác định hiệu suất khử khoáng và khử protein. Kết quả đƣợc trình bày trong đồ thị 3.1.13.
Hình 3.1.13. Ảnh hưởng của pH dịch tôm ban đầu tới hiệu suất khử khoángvà khử protein
Ký hiệu (□) – hiệu suất khử khoáng; (■) – hiệu suất khử protein
Khi pH ban đầu càng cao thì hiệu suất khử khoáng càng giảm và hiệu suất khử protein càng tăng. Ở giá trị pH bằng 5 hiệu suất của quá trình khử khoáng đạt giá trị cao nhất là 99.03%, trong khi đó hiệu suất khử protein thấp nhất 17.74 %. Hiệu suất khử khoáng cao tại pH thấp có lẽ cũng do một phần tác dụng của chính