Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo quản thịt​

Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiềuphương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,việc bảo quản bằng các chất hóa học

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện

MSSV: 105111082

: Phạm Khánh Hưng Lớp: 10DSH01

làm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cáchlàm việc một mình cũng như trong tập thể Tuy có những thành công và cũng khôngtránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều.Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths PhạmMinh Nhựt Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đãgiúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học Những lời khuyên, kinhnghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp

em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống Em cảm ơn thầy!

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang Chính lòngnhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của mộtngười làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quátrình làm đồ án Em cảm ơn chị rất nhiều!

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinhhọc – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths Huỳnh Văn Thành đã tạo điềukiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thí nghiệm

Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thờigian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn

Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quátrình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua Xin gửi lời cảm ơn đếnhai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viêntrong suốt quá trình làm đồ án

Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánhbên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gianqua Con xin chân thành cảm ơn mọi người!

Phạm Khánh Hưng

quả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ côngtrình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu củamình.

Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014

Sinh viên,

Phạm Khánh Hưng

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ngày nay, hòa mình vào xu thế phát triển chung của xã hội, cuộc sống của conngười ngày càng được nâng cao, nhu cầu càng ngày được cải thiện, trong đó nhucầu ăn uống của con người cũng được nâng cao Cũng từ đó, công tác bảo quản thựcphẩm luôn là mối bận tâm của các nước trên thế giới nói chung và Việt Nam nóiriêng Đặc biệt là các nhu cầu bảo quản các sản phẩm tươi sống tránh khỏi sự xâmnhiễm của các vi sinh vật gây bệnh cho người

Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiềuphương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến Tuy nhiên, do sựthiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng cáchóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định Trong khi

đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu,đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian.Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằngphương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môitrường

Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảoquản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thìhướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn vàđặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm Do đó, việcnghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thựcphẩm ngày được quan tâm phát triển

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm.Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quảnthực phẩm Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cũng không xa lạ với

dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay Bacteriocin là hợp chấtkháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩnGram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh

mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác Ngoài bacteriocin,các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môitrường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic,acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng

và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thựcphẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừngkhẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao

Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sátyếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vikhuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống Kết quả đã phân lập

được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền

thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định đượcthành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng

khuẩn của L plantarum SC01 Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L.

plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính

kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa đượcxác định Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

các hợp chất kháng khuẩn từ L plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể

làm tiền đề cho các ứng dụng sau này

Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt” Nghiên cứu

này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chấtbảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực

phẩm Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Côngnghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ ChíMinh.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả

bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum

SC01

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất

L plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang

- Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus

plantarum SC01 đối với thịt heo.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

1.1.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic

Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thíchđược quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên táchđược acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002).Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng củachuỗi phản ứng của quá trình lên men

Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạtđộng của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt

tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt,

2001)

Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu.Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881(Nguyễn Lân Dũng, 2002)

Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn Do đó, cácchủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao Trong

đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và

Streptococcus.

Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩmchính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat

Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trên bề mặt rau,

củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạcmiệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm Đặc biệt, trong sản các sảnphẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi

khuẩn lactic Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998).

Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau:

- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L bulgarius, L helviticus, L.

casei, L ferment, L brevis Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải tổng hợp

được ATP từ cơ chất lactose

- Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau

quả, trái cây: L plantarum, L delnikii, L ferment, L brevis.

- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L acidophilus, S

faecalis, S bovis, S salivanius, S pyogenes.

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài rahình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường,điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi

- Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính

khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài

Hình 1.1 Tế bào Streptococcus

- Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu

Hình 1.2 Tế bào Pediococcus

- Giống Bifidobacterium có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình que, có lúc

lại có hình ovan

Hình 1.3 Tế bào Bifidobacterium

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5

– 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung

Hình 1.4 Tế bào Leuconostoc

- Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que

ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm) Các

tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biến nhất

Hình 1.5 Tế bào

Lactobacillus 1.1.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thốngnhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm

này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử

Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên menđược saccharose và một số khác không lên men được maltose Một số vi khuẩnlactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài

L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột).

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổnghợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase

Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thànhphần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP Các LAB chỉ có thể tạo

ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn

cacbon Vi khuẩn lactic thích hợp phát triển trong điều kiện yếm khí, nhưng cũng cóthể phát triển trong điều kiện hiếu khí.

Hai con đường lên men chính có thể phân biệt giữa các vi khuẩn lactic là conđường Embden – Meyerhoff – Parnas (EMP) và con đường Pentose phosphate Conđường EMP tạo ra sản phẩm cuối cùng hầu như là acid lactic, trong khi đó conđường pentose phosphate tạo ra sản phẩm cuối cùng là acid lactic, khí CO2, ethanol,acetate… (Khalid, 2011)

1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển đượctrong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+ Vi khuẩn lacticcần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn(glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến cácpolysaccarit (tinh bột, dextrin) Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbonkhác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau

Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic làmonosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào

và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic (Tortora và Funke, 1992)

Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợpđược các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng vàphát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ cómột số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ

Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm(Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994):

- Nhóm cần phức hợp các acid amin

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duynhất

Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton, peptit, cazein

Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng Các vi

khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai

trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khảnăng sinh tổng hợp được vitamin Vitamin thường được bổ sung vào môi trườngbằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men

Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acidpantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin Các acid nicotinic và acid pantotenicđặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998).Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ,

độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy

Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng cóảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩnnày Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng:

- Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin

- Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin

- Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic

Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic Chúng vừa có vai tròcung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với cácacid amin tự do

Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người tathường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vaitrò là chất đệm Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạttính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch.Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt làmagiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic.Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi

yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme Magiê còn có tác dụng làm tăng khảnăng hấp thu đường của vi khuẩn lactic Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụnglàm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần ThanhThủy, 2003).

1.1.3 Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic Tùytheo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lênmen đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic

và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng,2002)

Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên menlactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phươngthức trên

1.1.3.1 Lên men lactic đồng hình

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acid

lactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB(Embden – Meyerhof – Parnas) Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân

tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớntrong công nghiệp thực phẩm

Hình 1.6 Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình

Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.

acidophilus, L plantarum, L bulgaricus, L casei, Streptococus, S cremoris, S thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

1.1.3.2 Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acidlactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành cácsản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997)

Phương trình tóm tắt:

2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + QTrong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%

Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat).Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase vàtrizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo conđường PP Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ratương tự như lên men đồng hình Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật,

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides,

L oenos, L cremoris, Lactobacillus brevis, L fermentum, Bifidobacterium bifidum.

Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2

như sự lên men lactic dị hình thông thường

Hình 1.7 Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình 1.2. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

1.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

L plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 –

1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic

và đã được giải mã hoàn toàn Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năngchịu nồng độ NaCl 5,5 %

Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng

- Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2

Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa

của con người L plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải… L.

plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như

một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến

L plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid Chúng không có

khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine Có đến 6 con đườngkhác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid Việc sinh ra NO giúp ngăn

chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E coli, Shigella, Helicobacter

pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011).

L plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy Khi có oxy, L plantarum

có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide Khi không có oxy, L plantarum sẽ

lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình)

L plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng Mangan giúp cho L plantarum

chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2

H O được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O và nước bởi manganese

L plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều

kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non Kí

sinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởng tích cực đến tế bào vật chủ

L plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên

men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn (Molin,2010)

1.2.3 Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum

Cũng như các chủng LAB khác, L plantarum đều trải qua quá trình lên men

lactic Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo rachiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic,ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic,acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển củanhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm

Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ conđường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí vàdiacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate

Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L plantarum,

plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh

tổng hợp protein nhờ ribosome Trong tế bào L plantarum có mang các gene mã

hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins Qua quá trìnhphiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo raplantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn

1.3. Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L plantarum sản sinh ra

1.3.1 Plantaricin

Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L plantarum sản xuất ra ít nhất 6

bacteriocins khác biệt Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền

chất có chứa glycine L plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen

PlnE và PlnF Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và

PlnH Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt(PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai

vùng điều hòa PlnC và PlnD Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L.

plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với

L plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và Propionobacteria.

Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau Chúng gồm 30hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương tựnhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau Các bacteriocins hoạt độngvới tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻhoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả

Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide

phân lập từ L plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh Các gen cấu trúc chỉ

ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motifđôi Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino Plantaricin S được coi là kiểmsoát quá trình lên men và bảo quản ô liu Một bacteriocin gồm hai peptide khác làplantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb Các thành phầnlantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự(Zacharof và Lovitt, 2012)

1.3.2 Các hợp chất kháng khuẩn khác

Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L.

plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản

sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus…

Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acidbên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bàogiảm Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho

vi khuẩn bị mất năng lượng Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đườngphân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt Ngoài ra, các

anion của acid còn gây rối loạn sự thẩm thấu của màng tế bào làm gây bệnh bị ứcchế sinh trưởng hoặc có thể chết.

Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ conđường lên men dị hình, hydrogen peroxide được tạo ra trong quá trình tăng trưởng

hiếu khí của L plantarum Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác

động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát

triển Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các

vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị

khuẩn E coli.

Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ởriboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương Bacteriocin có hoạt tínhkìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số

vi khuẩn khác Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính khángsinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật.Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác độngcủa môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống…Cácbacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp Đặc tính diệtkhuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởicác dung môi hữu cơ Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷphân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính Do có bản chất protein nên

bacteriocin không gây tác dụng phụ, không gây ra phản ứng dị ứng trong cơ thểngười và các vấn đề sức khoẻ khác.

Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên, việcphân loại chúng vẫn chưa được xác định rõ ràng Bacteriocin được phân loại vớinhiều tiêu chí khác nhau như: họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng phân tử của chúng

và trình tự chuỗi amino acid Bacteriocin được chia thành 3 lớp:

- Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (<5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào Lantibiotic bacteriocinlớp I được chia thành 2 lớp phụ:

+ Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất Nisin thuộc nhóm này

+ Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện

âm hoặc không tích điện Đại điện: Meracidin

Hình 1.8 Bacteriocin lớp I

- Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên,

ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường Nhóm này được chia thành 3lớp nhỏ:

+ Lớp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại

diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P Các bacteriocinnhóm này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp

+ Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, nhữngpeptid này ít hoặc không hoạt động Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là:

Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK

+ Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin không đồngnhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau Đại diện: Divergicin A

và Acidocin B

- Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, khôngbền nhiệt Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khả năngbắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin Đại diện gồm có Acidofilicin A vàLactacins A, B

- Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thànhphần lipid và cacbohydrate Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chức

năng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch

1.4.2 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus,

Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram

âm kém vì màng ngoài của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin.Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàmlượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm

Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng.Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngoài tế bào Không gây nguy hiểm sinh lý tế bào

- Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong

tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin

- Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào

1.4.3 Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn

Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm Đặcbiệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiệnsản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp Lợi thế của việc sản xuất invitro là

do không có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế,bất hoạt bởi protease Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm soát các quy trình lên men thì

sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến

các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon vàPhumkhachorn, 2010).

Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tửbacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học Ngoài ra, nhiệt

độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trò quan trọngtrong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làmgiảm khả năng sản xuất Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đếnsản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối.Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộcvào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và quá trình chuyển hóacủa LAB

Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thểđược phân biệt:

- Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammoniumsulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao áp

- Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủaammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược pha lỏngcao áp

- Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cô lập thông qua một quy trìnhduy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độ

hấp thụ bacteriocin có sẵn thông qua điều chỉnh pH của môi trường lên men thô.Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phươngpháp đầu tiên

Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh

sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus

amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium

RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi

Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007).

1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn

a pH

Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0 Hoạt tính kháng khuẩncủa bacteriocin vẫn hoạt động trong môi trường có tính acid hoặc trung tính Sự ổnđịnh của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thựcphẩm Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốt trong

pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong môi trường có pH 8,0 - 12,0

Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phòng, hoạt tính kháng khuẩncủa bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ đượchoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạtđộng yếu ở nhiệt độ thấp

c Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme

Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tínhkháng khuẩn của bacteriocin Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin vàtrypsin không gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ cácchủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001)

d Các chất hoạt động bề mặt

Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khảnăng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau Đối với hợp chất

kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS,

Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5

mM vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv,2011) Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lạilàm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA

và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất

từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013).

1.5 Một số phương pháp bảo quản thực phẩm và tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật

1.5.1 Một số phương pháp bảo quản thực phẩm

Thực phẩm không được bảo quản thường bị biến đổi dẫn đến mất giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan Những biến đổi đó do những nguyên nhân sau:

- Do vi sinh vật: vi sinh vật có sẵn trong thực phẩm hoặc nhiễm từ bên ngoàivào

- Do enzyme: enzyme có sẵn trong tế bào vi khuẩn có trong nguyên liệu thựcphẩm

- Do phản ứng giữa các chất bên trong thực phẩm với nhau và chất bên trong thực phẩm với bao bì

 Phương pháp sấy tự nhiên (phơi nắng)

- Là phương pháp sử dụng nhiệt của ánh sáng mặt trời để làm khô sản phẩm

- Thích hợp cho các loại hạt ngũ cốc, các loại thủy sản ướp muối (cá, tôm,mực…)

- Hong khô rau quả mà không cần nắng

 Phương pháp sấy nhân tạo

- Sấy khô: dùng lò sấy than, củi… để làm bay hơi nước trong thực phẩm Chất lượng sản phẩm không cao (chất dinh dưỡng, vitamin bị ảnh hưởng)

- Sấy phun: đặc thù của phương pháp này là cô đặc sản phẩm bằng cách dùngvòi phun cao áp dạng sương mù trong buồng sấy có nhiệt 950C để diệt các vi sinh vậtđồng thời tạo ra sản phẩm khô

- Sấy thăng hoa: nước trong thực phẩm (thể lỏng) chuyển sang dạng hơi nước

và tạo thành thể rắn

- Sấy bằng bức xạ: làm sản phẩm nóng bằng cách dùng các đèn hồng ngoại

có công suất 250-500W, chiếu tia hồng ngoại (0,75 - 4µm) vào sản phẩm

- Sấy bằng điện cao tần: là phương pháp đặt sản phẩm sấy vào điện trường xoay chiều có tần số dao động cao (500kHz) giúp cho sản phẩm khô đều và nhanh

Để giữ sản phẩm được trong thời gian dài thì các sản phẩm sau khi làm khô phải được làm nguội ngay, bao gói tốt, tránh hút ẩm trở lại, giữ nơi khô mát

b Phương pháp sử dụng nhiệt

 Phương pháp nhiệt độ thấp

- Làm lạnh: chủ yếu được áp dụng để bảo quản rau quả tươi

Nhiệt độ hạ xuống gần 00C, tinh thể nước đá chưa xuất hiện, hệ thống men(trong nguyên liệu và trong VSV) hoạt động yếu đi dẫn đến kìm hãm những biếnđổi về lý, hóa, sinh; hoạt động vi sinh vật

- Làm lạnh đông (đông lạnh): là phương pháp giúp giữ thực phẩm vài thángđến vài năm

Nhiệt độ của thực phẩm được hạ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của các dungdịch nước trong thực phẩm giúp phần lớn nước trong thực phẩm bị đóng băng,màng tế bào của vi sinh vật bị nén mạnh Các quá trình sống của vi sinh vật và hoạtđộng của các hệ thống men bị kiềm chế

 Phương pháp nhiệt độ cao: là phương pháp diệt vi sinh vật và cả bào tử củachúng

- Thanh trùng Pasteur (gián đoạn và liên tục)

Thanh trùng gián đoạn: phương pháp này dùng một lò hấp Pasteur, bên trong

có một thùng chứa được bao quanh bởi hơi nước lưu thông Trong thùng chứa này,sữa được làm nóng và được khuấy đều trong suốt thời gian khử trùng Sau đó sữa cóthể được làm nguội trong thùng chứa Ngoài ra, người ta có thể làm nóng sữa mộtphần trong một lò hình ống trước khi đưa vào thùng chứa Phương pháp này ít dùng

Thanh trùng liên tục: trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấpPasteur tiệt khuẩn nhanh ở nhiệt độ cao Môi trường làm nóng sản phẩm có thể chứahơi nước hoặc nước nóng ở chân không Sữa thô ở 40C được cho chảy qua các thíết

bị của lò hấp Pasteur này, nó dược làm nóng đến nhiệt độ khử trùng khoảng

720C/16 giây Sau khi khử trùng, sữa được chảy vào một thiết bị làm nguội đến 40Choặc thấp hơn Sau cùng, sữa được chuyển vào một hệ thống đóng gói sản phẩm

- Phương pháp UHT (Ultra-high temperature)

Phương pháp UHT thanh trùng thực phẩm ở nhiệt độ lớn hơn 100oC, thựcphẩm được thanh trùng trước khi đóng gói, rồi được cho vào các đồ chứa đã đượckhử thanh trong điều kiện vô trùng

Phương pháp UHT tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và bào tử, kể cả vi sinh vậtchịu nhiệt có bào tử Thực phẩm dược xử lí bằng phương pháp UHT có thể để đượcđến 6 tháng mà không cần làm lạnh

c Phương pháp sử dụng tia bức xạ

Trong phương pháp này, người ta sử dụng một lò hấp Pasteur tiệt khuẩn nhanh

ở nhiệt độ cao Tuy nhiên việc chiếu xạ lại gây nguy hiểm cho con người khi ăn cácloại thực phẩm này

d Phương pháp hút chân không

Ở phương pháp này, người ta đặt các sản phẩm thực phẩm trong những bao bì không thấm khí và hút không khí ở trong ra, tạo ra một môi trường chân không

Trong trường hợp này những quá trình oxi hoá thường xảy ra dưới tác dụngcủa không khí bị kìm hãm mạnh, lớp bề mặt của sản phẩm không bị khô, giữ đượcmàu sắc và tính chất ban đầu của sản phẩm

e Phương pháp dùng dòng điện cao tần

Sản phẩm được đặt trong điện trường của dòng điện xoay chiều có tần số cao

để thanh trùng

Các phân tử tích điện trong sản phẩm (ion, điện tử) sẽ dao động do tác dụngcủa điện năng, chuyển điện năng được hấp thụ thành nhiệt năng để làm chết vi sinhvật

f Phương pháp siêu âm

Siêu âm là sóng âm có tần số dao động cao mà con người không cảm thụ được Dưới tác dụng của siêu âm, môi trường lỏng (sản phẩm) truyền âm bị xô đi đẩy lại, bị ép và tạo chân không liên tiếp sinh ra nhiều khoảng trống Lúc đó, các chất hòa tan và hơi của chất lỏng lập tức dồn vào các khoảng trống ấy, gây ra tác dụng cơ học làm chết vi sinh vật ở trong môi trường g Phương pháp lọc thanh trùng

Kỹ thuật màng lọc góp phần bảo quản thực phẩm bằng cách giữ lại vi sinh vật trên màng và do đó dịch lỏng thấm qua sẽ vô khuẩn h Phương pháp đóng gói bằng thay đổi khí quyển

Tính năng của công nghệ bảo quản bằng cách bao gói sản phẩm trong khíquyển thay đổi (MAP) nhằm kéo dài tuổi thọ của thực phẩm đã được nhận biết cáchđây nhiều năm Ngày nay thực phẩm đóng gói trong MA bao gồm thịt tươi và nấuchín, thịt gia cầm và cá, rau quả, mì sợi, phomat, các loại bánh nướng từ bột mì,khoai tây chiên, cà phê và trà

i Bảo quản bằng áp lực thủy tĩnh cao

Dựa trên nguyên tắc thủy tĩnh, áp lực thủy tĩnh tại một điểm cho trước bằngnhau ở mọi hướng và áp lực được truyền đi lập tức và giống nhau qua môi trườngtruyền áp lực

Sử dụng phương pháp vật lí có thể bảo quản thực phẩm tốt nhưng gây tốnkém, quá trình phức tạp và gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng khi sửsụng các tia chiếu xạ

thay đổi trạng thái lý, hóa học của chất nguyên sinh Khí SO2 dùng trong bảo quảnrau quả Không dùng các hợp chất SO2 để bảo quản thịt, ngũ cốc, đậu đỗ, sữa.

- NO3 (nitrate): NaNO3, KNO3 Nitrit được ứng dụng trong công nghiệp chếbiến thịt với mục đích giữ màu đỏ cho thịt muối mặn, làm thuốc sát khuẩn trong bảoquản cá, thịt và các chế phẩm từ cá, thịt (cá, thịt muối hoặc ướp lạnh) Sử dụng làmchất sát khuẩn và giữ màu cho thịt, các sản phẩm thịt, cá và phomat Khi ăn phảithức ăn chứa nhiều nitrit có thể gây ngộ độc

- Acid benzoic, muối benzoat: ức chế mạnh nấm men và nấm mốc, có tácdụng yếu đối với vi khuẩn Tác động lên màng tế bào nấm, ức chế quá trình hô hấp của tếbào, ức chế quá trình oxy hóa glucose và pyruvate, ức chế quá trình biến

dưỡng các hợp chất đa lượng (N, P,…) của sinh vật Acid benzoic được sử dụngnhiều trong bảo quản trái cây và rau quả

Nếu sử dụng ở nồng độ cao sẽ làm thay đổi mùi vị sản phẩm, ảnh hưởng tớithận của người sử dụng

Dùng benzoic hoặc benzoat trong bảo quản sản phẩm có thể làm cho sản phẩm

bị thâm đen, và dễ nhận biết dư vị, làm giảm chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm

Acid benzoic có thể tác động hệ hô hấp và hệ thần kinh trung ương, gây kíchứng mắt

- Ester diethyl của acid pyrocarbonic : ethylpyrocarbonat hoàn toàn không độcđối với người, khi tiếp xúc với nước sẽ phân hủy dần dần thành ethanol và

CO2.Dùng trong bảo quản nước quả, quả tươi Sử dụng ethylpyrocarbonat để thaythế phương pháp sulfite hoá trong bảo quản rượu nho và nước quả

- Carbonic (CO2): Khí carbonic tác động tới quá trình trao đổi chất của visinh vật, ức chế một vài quá trình biến dưỡng của vi sinh vật Nấm mốc nhạy cảm

hơn đối với khí carbonic, còn vi khuẩn thí ít nhạy cảm hơn Nồng độ khí carbonic cao ức chế sự phát triển của những vi khuẩn hiếu khí và cả vi khuẩn yếm khí

- Ozon (O3): Ozon có tính oxi hóa rất mạnh, tác động trực tiếp tới các chấtsống gây biến đổi và bất hoạt các đại phân tử sinh học, gây rối loạn các hoạt động sốngcủa vi sinh vật

- Chất gia tăng áp suất thẩm thấu : Sử dụng đường hay muối trong bảo quảnthực phẩm làm gia tăng áp xuất thẩm thấu của môi trường, tạo áp suất thẩm thấu cao nênnước trong tế bào thấm ra khỏi màng tế bào chất và gây ra hiện tượng co nguyên sinh,đồng thời tế bào vi sinh vật không thể hấp thu được các chất dinh

dưỡng, làm ức chế hoạt động và sự phát triển của vi sinh vật

- Acid acetic (ngâm dấm): acid acetic làm giảm pH của sản phẩm, làm cho quátrình trao đổi ion của vi sinh vật không thực hiện được Sự thay đổi quá lớn củanồng độ ion trong và ngoài màng tế bào làm rối loạn các quá trình trao đổi chất của

vi sinh vật, ức chế sự phát triển của vi sinh vật trong thực phẩm

- Kháng sinh được sản xuất theo phương pháp hóa học: các chất kháng sinh

có tác dụng chủ yếu với vi khuẩn, tác động yếu đối với nấm mốc, nấm men Tác dụng là

là làm ngưng tổng hợp thành tế bào vi khuẩn; phá vỡ tính thẩm thấu của màng tế bào, ảnhhưởng tới quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn, ảnh hưởng đối với acid nucleic Cácchất kháng sinh được phép dùng: biomixin (clotetraxyclin),

teramixin, oreomixin,…

- Chất chống oxy hóa: các chất chống oxy hóa có đặc tính dễ bị oxi hóa hơn sovới các chất béo có trong thực phẩm Sự oxi hóa các hợp chất chống oxi hóa sẽ làmgiảm sự oxi hóa của các chất béo trong thực phẩm Các chất chống oxy hóa có haidạng như sau:

Acid (hoặc muối hay ester của chúng) như acid citric, acid ascorbic, Hợpchất phenol làm chậm khả năng oxy hóa chất béo và dầu có trong thực phẩm

Phương pháp hóa học làm thực phẩm dễ bị nhiễm và tích lũy các chất hóc họcgây độc trong thực phẩm, gây tác dụng xấu cho con người

Sử dụng các vi sinh vật lên men tạo ra acid làm thay đổi pH môi trường ức chế

sự phát triển của vi sinh vật gây hại thực phẩm và kéo dài thời gian bảo quản thựcphẩm Điển hình là vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men, các vi khuẩn này tiết ra acid lactic và acid acetic làmacid hóa môi trường, kiềm hãm và tiêu diệt vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm Ngoài

ra, vi khuẩn lactic còn tiết ra bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao

- Phương pháp sử dụng bacteriocin

Bacteriocin là các protein có tính kháng một số vi sinh vật gây hư hỏng và gâyngộ độc thực phẩm, nó được các vi sinh vật chủ yếu là nhóm vi khuẩn sinh lactictiết ra trong quá trình sinh trưởng và phát triển Nisin là một bacteriocin được sinh

ra bởi Lactococcus lactis và Streptococcus lactis Nisin liên kết với anion

phospholipid sau đó chúng di chuyển vào tế bào gây rối loạn quá trình trao đổi ion

và làm chết vi sinh vật Bacteriocin dùng rộng rãi trong công nghiệp chế biếnphomat, bảo quản đồ hộp, nước ép quả đóng hộp…

1.5.2.1 Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật trên thế giới

Sản phẩm công nghệ sinh học nói chung và sản phẩm từ vi sinh vật nói riêng

đã được ứng dụng vào nhiều trong công nghiệp, nông nghiệp, y dược, môi trường,trong chế biến và bảo quản thực phẩm

a Trong công nghiệp sản xuất acid lactic

Từ năm 1881, con người đã bắt đầu ứng dụng lên men lactic để sản xuất acidlactic ở quy mô công nghiệp

Từ các nguyên liệu như rỉ đường, tinh bột, dịch thải công nghiệp sản xuấtđường và bánh kẹo, dịch thủy phân từ cám gạo, cám ngô, người ta sản xuất mộtlượng lớn acid lactic đáp ứng cho nhu cầu của nhiều ngành công nghiệp: dược, dệt,

da, nhuộm, chất dẻo, mỹ phẩm, sơn và vật liệu cao cấp…

Vi khuẩn lactic được sử dụng cho mục đích này thuộc loại lên men đồng hình,

có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu từ 45 – 480C, có lợi thế để ngăn ngừa sự gây nhiễm,

như: Lactobacillus delbruckii, L bulgaricus, L leichmanii Nguồn đạm cần cho sự

lên men tạo acid lactic thường là dịch chiết ngô hay sunphat amon Gần đây, người

ta sử dụng vi khuẩn lactic cố định trong alginate natri để lên men liên tục ở 430C,

pH = 5,7 với hiệu suất lên men đạt 97% (Nguyễn Thành Đạt, 2001) Acid lacticđược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt, trong in ấn,chế tạo chất dẻo, sơn, dược phẩm và mỹ phẩm

Lactate natri, lactate canxi và một số muối lactic khác được dùng làm chất giữ

ẩm, chất nhủ hóa, chất làm đông trong ngành mỹ phẩm… Lactate sắt được dùng để

bổ sung sắt cho sữa mẹ và bệnh nhân thiếu máu

Acid lactic còn được dùng làm nguyên liệu để chế các sản phẩm dưỡng tóc vàlàm giảm sự lão hóa của tóc Lactate canxi cũng được dùng làm nguyên liệu trongsản xuất kem đánh răng

b Trong công nghiệp chế biến thực phẩm

Việc sử dụng quá trình lên men lactic để chế biến các sản phẩm rau, thịt, cá,trứng, sữa không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà con nhằm đưa ra thị trường cótính chất và hương vị mong muốn Đây là một trong những phương pháp bảo quảnthực phẩm phổ biến hiện nay

Có thể thực hiện quá trình lên men thực phẩm theo 2 cách:

- Sử dụng các vi sinh vật tự nhiên có sẵn trong nguyên liệu hoặc có sẵn trongkhông khí Theo cách này, người ta thường áp dụng để chế biến các thực phẩm lên men ởquy mô nhỏ, thủ công, trang thiết bị đơn giản.

- Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic thuẩn chủng bổ sung vào nguyên liệu đểđiều khiển quá trình lên men Phương pháp này được áp dụng ở quy mô công nghiệp nhưsản xuất sữa chua, phomat, váng sữa, bơ

- Ngoài việc sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến và bảo quản thực phẩm,người ta còn dùng chúng để sản xuất một lượng acid lactic và muối lactate dùng làm phụgia thực phẩm Các vi khuẩn lactic cũng đóng vai trò rất quan trọng trong sản xuất bánh

mì đen (Tortora và Funke, 1992)

Gần đây người ta phát hiện ra vài trò to lớn của vi khuẩn lactic với sức khỏecủa người và động vật Khu hệ vi khuẩn lactic trong đường ruột người và động vật

có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh, tăng cường tiêu hóa, bảo vệ đườngruột Các nghiên cứu về vấn đề này làm cơ sở tạo ra các chế phẩm sống (probiotic)giúp cân bằng hệ VSV đường ruột, giảm cholesteron trong máu, bệnh không dungnạp lactoza, viêm dạ dày cấp Các chế phẩm này còn tạo ra các thức ăn có bổ sungkhoáng, vitamin cho người bệnh, người ăn kiêng và gia súc, gia cầm (Vũ HồngThắng, 1998)

Nhờ giá trị đặc biệt của các thực phẩm lên men lactic đối với sức khỏe conngười mà đến nay các sản phẩm lên men ngày càng được sử dụng rộng rãi và đượctiêu thụ với khối lượng rất lớn

c Trong nông nghiệp

Trong tự nhiên, các vi khuẩn lactic có sẵn trong đất đã phân giải dường vàcacbon hydrat tạo thành acid lactic Acid này có tác dụng như:

- Kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi, đặc biệt là hệ vi sinh vậtphân giải đường, tạo điều kiện phân giải nhanh các đại phân tử hữu cơ trong đó có cácchất khó phân gải như lignin, cenlulose, tinh bột mà không gây hại cho đất

- Ức chế sự phát triển của các vi nấm có hại như Fusarium, giun tròn và các

đối tượng chuyên phá hại mùa màng

Trong chăn nuôi, vi khuẩn lactic tham gia vào quá trình ủ chua thức ăn giasúc Nhờ ủ chua, thức ăn có thể giữ được khá lâu ở trạng thái tươi, phần lớn cácchất dinh dưỡng như vitamin, chất thơm, chất kháng sinh… được bảo đảm góp phầntăng năng suất trong chăn nuôi, đồng thời góp phần hạ giá thành sản phẩm.

Nhiều loại thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn, virus, nấm đã được sảnxuất, ứng dụng đại trà Chỉ riêng chế phẩm thuốc trừ sâu Bt, hàng năm đã mang lạilợi nhận hàng trăm triệu đô la Mỹ Sản xuất thuốc BVTV sinh học không chỉ pháttriển mạnh ở các nước phương Tây, mà còn phát triển ở cả Trung Quốc, Thái Lan

Phân bón sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn (Rhizobium, Azotobacter,

Bacillus…), xạ khuẩn (Frankia), nấm (Mycorhiza), tảo lam đã được các nước trên

thế giới nghiên cứu, sản xuất và áp dụng rộng rãi Phân vi sinh làm tăng năng suấtcây trồng 7-15% và tiết kiệm 20% phân khoáng Riêng phân vi khuẩn nốt sần,doanh số thế giới hàng năm đạt 25 triệu USD, trong đó riêng Mỹ chiếm 19 triệuUSD

d Trong y học

Acid lactic được sử dụng rộng rãi để điều chế một số loại thuốc sát trùng, một

số loại thuốc dưới dạng muối canxi

Các vi khuẩn lactic sinh kháng sinh được sử dụng làm chế phẩm “men tiêu hóasống” dùng để chữa một số bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy và phục hồi cân bằng

hệ VSV đường ruột Trong đó nỗi bật là L acilophilus khi bổ sung vào đường tiêuhóa, tại ruột già chúng phát triển ức chế một số bệnh đường ruột khác Chúng tiết racác chất diệt khuẩn, kháng sinh, chất kháng độc tố kháng hệ miễn dịch kích thích sựtạo thành interferon làm giảm quá trình hình thành các khối u Đặc biệt trong quátrình sinh trưởng các vi khuẩn này thường sử dụng cholesterol nên có vai trò làmgiảm lượng cholesterol được hấp thu vào cơ thể (Salmien và Deighton, 1998)

e Ứng dụng trong bảo vệ và xử lý môi trường

Xử lý các chất thải, phế liệu trong nông nghiệp - nông thôn bằng công nghệ

cơ… phục vụ dân sinh và nông nghiệp Những nước có công nghệ phát triển trong lĩnh vực này là Nhật Bản, Mỹ, EU và Canada.

1.5.2.2 Tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hệ vi khuẩn lactic xuất hiện chủ yếu trong sản phẩm lên mentruyền thống như dưa cải muối chua, sữa chua, cơm mẻ, nem chua và một số sản phẩmmen tiêu hoá đông khô Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu bước đầu phân lập

và tuyển chọn nguồn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn từ các nguồn sảnphẩm lên men và các sản phẩm men tiêu hoá đông khô có sẵn trên thị trường Qua đó cóthể tiến hành định danh và tiếp tục nghiên cứu điều kiện sinh chất kháng khuẩn cao để cóthể ứng dụng vào sản xuất chất bảo quản thực phẩm tự nhiên

Ngoài ra còn rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng của vi khuẩn lactic vào cácsản phẩm thực phẩm làm cho thực phẩm có tính ổn định và về mặt cảm quan cónhiều ưu việt hơn là sản phẩm thực phẩm lên men lactic tự nhiên Có được ưu điểmnày là do ngoài những tính chất ưu việt vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổnghợp bacteriocin Bên cạnh đó, ở nước ta đã sử dụng bacteriocin trong quá trình làmnem chua Kết quả đã kéo thời gian bảo quản tránh tình trạng bị chảy nước và gópphần tạo hương vị cho nem chua

Việt Nam đã nghiên cứu hoàn thiện một số công nghệ sản xuất phân vi sinhvật, thức ăn bổ sung cho gia cầm, chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật và bả diệt chuộtsinh học; ứng dụng thành công công nghệ biogas để xử lý chất thải hữu cơ…

Sử dụng vi sinh vật để làm phân bón (phân VSV cố định Nitơ tự do hoặc hộisinh; phân VSV phân giải phot phat khó tan từ vi khuẩn hoặc nấm mốc; phân VSV

có nguồn gốc từ nấm Mycorhiza, vi khuẩn Rhizobium, xạ khuẩn Frankia cho cây

lâm nghiệp: Thông, Keo, Phi lao, Sao đen), chế phẩm VSV bổ sung thức ăn giacầm

Chế phẩm thuốc BVTV sinh học được ứng dụng rộng rãi như NPV, V-Bt đểtrừ sâu khoang, sâu xanh hại rau, màu, bông, đay, thuốc lá; chế phẩm vi khuẩn

huỳnh quang (Pseudomonas fluorescens) phòng trừ bệnh hại rễ cà phê, vải thiều,

lạc

Nhiều kết quả nghiên cứu sử dụng nấm có ích diệt côn trùng đã đạt được kếtquả tốt như: Metarhizium flovoviridae trừ mối, châu chấu hại mía (hiệu quả phòngtrừ đạt 76%), Beauveria bassiana trừ sâu róm hại thông (hiệu quả phòng trừ đạt93,6%), hay Beauveria bassiana và Metarhizium aníopliae phòng trừ sâu hại dừa đạthiệu quả từ 56-97%; nấm đối kháng Trichoderma trừ bệnh khô vằn trên ngô đạt hiệuquả 45-50%, hạn chế bệnh lở cổ rễ đậu tương 51-58% Hiện nay, các nhà khoa họcđang hoàn thiện qui trình sử dụng nấm Exserohilum monoceras để trừ cỏ lồng vực

Trong lĩnh vực xử lý môi trường: đã ứng dụng thành công công nghệ Biogas

để chuyển các chất thải hữu cơ thành khí đốt Đã xử lý rác thải, than bùn làm phânbón Những nghiên cứu trong ứng dụng công nghệ vi sinh để xử lý nước thải,chuyển đổi sinh học các nguồn phụ, phế thải nông, lâm nghiệp cũng đang được tiếnhành

1.6 Yêu cầu đối với việc sử dụng chất bảo quản sinh học trong thực phẩm

- Chất bảo quản sinh học được sử dụng không có tính độc và kích thích sự kháng thuốc của vi sinh vật khác

- Được cơ quan thẩm quyền công nhận và cho phép sử dụng

- Phải được sử dụng một cách hợp kinh tế trong công nghiệp

- Sản phẩm có bổ sung chất bảo quản sinh học phải không bị ảnh hưởng

Ví dụ: chất bảo quản sinh học không gây tác động xấu đối với đánh giá cảm quan của sản phẩm

- Vẫn tỏ ra hiệu quả khi được dùng ở nồng độ tương đối thấp

- Chất bảo quản sinh học phải đủ bền khi được cất trữ

- Không được sử dụng trong chữa bệnh hoặc dùng làm phụ gia thực phẩm cho động vật hay bổ sung vào thức ăn giúp tăng sự phát triển của động vật

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học –Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp HCM

2.1.2 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2014 đến tháng 06/2014

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Vi khuẩn Lactobacillus plantarum được sử dụng trong nghiên cứu được cung

cấp bởi Lê Ngọc Thùy Trang (2013)

2.2.2 Vi khuẩn chỉ thị

Vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu là vi khuẩn Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella, Listeria monocytogenes được

cung cấp bởi Phòng Thí Nghiệm Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi

trường, Trường Đại Học Công nghệ Tp HCM.

2.2.3 Nguồn mẫu khảo sát khả năng bảo quản thực phẩm của hợp chất kháng khuẩn vi khuẩn L plantarum

Nguồn mẫu là thịt nạc đùi tươi được mua từ cửa hàng Vissan Quận Bình

Thạnh

2.2.4 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.4.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MRS OPTSC01 (Lê Ngọc Thùy Trang, 2013)

Môi trường Tryptone Soya Borth (HiMedia - Ấn Độ)

Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

Môi trường Saline Pepton Water (SPW)

Môi trường Plate Count Agar (PCA)

Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB)

Môi trường Briliant Green Bile Lactose borth (BGBL)

Môi trường Eosine Methylene Blue Agar (EMB)

Môi trường Tryptone

Môi trường Baird Parker (BP)

Môi trường canh Rappaport Vassiliadis Soya (RV)

Môi trường Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar)

Môi trường TSI

Môi trường Mannitol Phenol Red both

Môi trường Urea broth

Dây cấy ria, dây cấy thẳng, que cấy trang

Đũa thủy tinhGiấy đo pHỐng FalconCác loại đầu típĐèn cồn

Micropipette 100µl, 1000µlDao cắt mẫu

Kẹp gắp mẫu

Bông y tế và bông không thấm nước

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp pha loãng mẫu

Nguyên tắc: pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rấtquan trọng trong quá trình phân tích vi sinh Việc pha loãng mẫu ở các nồng độthích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích.Phương pháp pha loãng mẫu (mẫu lỏng và mẫu rắn) chỉ được sử dụng trong trườnghợp vi sinh vật phân bố trong mẫu nhiều và để định lượng vi sinh vật trong mẫu.Đối với mẫu lỏng: dùng micropipette hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9

ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch phaloãng ta được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục tiến hành như vậy cho đến khi đến nồng

độ cần thiết

Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10g mẫu cho vào 90 ml dung dịch pha loãng tađược nồng độ pha loãng 10-1 Sau đó tiến hành đồng nhất mẫu rồi hút 1ml dịch phaloãng ở nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng

ta được nồng độ pha loãng 10-2 Và tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu lỏng(Phạm Minh Nhựt, 2014)