Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt

Bacteriocin là hợp chấtkháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩnGram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Phạm Minh Nhựt Sinh viên thực hiện : Phạm Khánh Hưng MSSV: 105111082 Lớp: 10DSH01

TP Hồ Chí Minh, 2014

LỜI CẢM ƠN

Qua hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được rất nhiều điều trong việclàm một người nghiên cứu khoa học, trong cách giao tiếp ứng xử hằng ngày, cáchlàm việc một mình cũng như trong tập thể Tuy có những thành công và cũng khôngtránh khỏi những thất bại nhưng điều đó đã giúp em trưởng thành hơn rất nhiều.Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy Ths PhạmMinh Nhựt Chính sự quan tâm, động viên, chỉ bảo hướng dẫn tận tình của thầy đãgiúp em rất nhiều trong bước đầu nghiên cứu khoa học Những lời khuyên, kinhnghiêm của thầy không chỉ giúp em trong học tập, trong nghiêng cứu mà còn giúp

em ngày càng hoàn thiện mình hơn trong cuộc sống Em cảm ơn thầy!

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến chị Lê Ngọc Thùy Trang Chính lòngnhiệt tình và sự tận tâm của chị đã giúp em hiểu nhiều hơn về công việc của mộtngười làm nghiên cứu, cũng như là người động viên, giúp đỡ em trong suốt quátrình làm đồ án Em cảm ơn chị rất nhiều!

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy, cô khoa Công nghệ Sinhhọc – Thực phẩm – Môi trường, đặc biệt là thầy Ths Huỳnh Văn Thành đã tạo điềukiện cho em nghiên cứu, giúp đỡ em trong quá trình làm đồ án tại phòng thínghiệm

Em xin cảm ơn Hội đồng bảo về đồ án và quý thầy cô phản biện đã dành thờigian đọc, nhận xét và góp ý cho đồ án của em được hoàn chỉnh hơn

Cảm ơn tập thể lớp 10DSH1 đã luôn bên cạnh, giúp đỡ và động viên trong quátrình thực hiện đồ án cũng như trong suốt 4 năm học qua Xin gửi lời cảm ơn đếnhai em Nguyễn Thị Bích Thưởng và Nguyễn Thị Dung đã phụ giúp và động viêntrong suốt quá trình làm đồ án

Đặc biệt, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người đã luôn sát cánhbên con, luôn quan tâm, ủng hộ, tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gianqua Con xin chân thành cảm ơn mọi người!

Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014

Sinh viên

Phạm Khánh Hưng

LỜI CAM ĐOAN

Đồ án tốt nghiệp

Tôi xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu do tôi thực hiện Các số liệu và kếtquả nghiên cứu trình bày trong đồ án này chưa từng được công bố trong bất kỳ côngtrình nghiên cứu nào khác Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về nghiên cứu củamình

Tp, Hồ Chí Minh, ngày…, tháng…, năm 2014

Sinh viên,

Phạm Khánh Hưng

Hiện nay, thực phẩm tiêu thụ trên thị trường đang được bảo quản bằng nhiềuphương pháp khác nhau như: phương pháp vật lý, phương pháp hóa học… trong đó,việc bảo quản bằng các chất hóa học được sử dụng khá phổ biến Tuy nhiên, do sựthiếu hiểu biết cũng như lạm dụng vì mục đích kinh tế, nhiều nơi đã sử dụng cáchóa chất không được phép sử dụng hoặc dùng quá liều lượng quy định Trong khi

đó, các phương pháp vật lý thường không mang lại mùi vị, chất lượng như ban đầu,đồng thời trạng thái cũng có phần thay đổi và đòi hỏi quy trình cần nhiều thời gian.Các phương pháp bảo quản này còn rất nhiều hạn chế, đặc biệt bảo quản bằngphương pháp hóa học có thể làm ảnh hưởng dài lâu tới sức khỏe con người và môitrường

Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học có tác dụng bảoquản tốt, ngăn chặn sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe thìhướng nghiên cứu tìm đến những chất bảo quản có nguồn gốc tự nhiên, an toàn vàđặc hiệu đối với từng loại vi sinh vật gây hại đang được quan tâm Do đó, việcnghiên cứu tìm ra và sử dụng các chất có nguồn gốc sinh học để bảo quản các thựcphẩm ngày được quan tâm phát triển

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm.Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản

Đồ án tốt nghiệp

33

dụng phổ biến trong thực phẩm từ hàng ngàn năm nay Bacteriocin là hợp chấtkháng khuẩn có bản chất là các peptide được tổng hợp ở ribosome của vi khuẩnGram âm và vi khuẩn Gram dương, có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh

mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác Ngoài bacteriocin,các chủng LAB trong quá trình sinh trưởng và phát triển, LAB còn sản sinh ra môitrường một số hợp chất thứ cấp như các loại acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic,acid propionic, ethanol, CO2, H2O2… Nhờ giá trị đặc biệt của bacteriocin nói riêng

và các hoạt chất có hoạt tính sinh học nói chung mà các chế phẩm bảo quản thựcphẩm mang hoạt tính sinh học ngày càng được chú trọng phát triển và không ngừngkhẳng định vị thế trên thị trường đem lại lợi ích ngày càng cao

Năm 2013, Lê Ngọc Thùy Trang thực hiện nghiên cứu “Phân lập và khảo sátyếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum” với mục tiêu chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng

sản sinh các hợp chất kháng khuẩn có tính đối kháng mạnh đối với các chủng vikhuẩn chỉ thị từ các nguồn thực phẩm lên men truyền thống Kết quả đã phân lập

được chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum SC01 từ sữa chua lên men truyền

thống cho khả năng sinh hợp chất kháng khuẩn rất cao, đồng thời xác định đượcthành phần môi trường MRS OPTSC01 là tối ưu cho sự sản sinh hợp chất kháng

khuẩn của L plantarum SC01 Từ nghiên cứu này đã thu được dịch nuôi cấy L.

plantarum SC01 có hoạt tính kháng khuẩn cao Tuy nhiên, việc duy trì hoạt tính

kháng khuẩn cũng như mức độ ứng dụng của dịch kháng khuẩn này vẫn chưa đượcxác định Việc đánh giá hoạt tính cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của

các hợp chất kháng khuẩn từ L plantarum SC01 là điều hết sức cần thiết để có thể

làm tiền đề cho các ứng dụng sau này

Với ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học như vậy, chúng tôi tiến hành thực

hiện đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn

từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum và ứng dụng trong bảo thịt” Nghiên cứu

Đồ án tốt nghiệp

44

này hy vọng sẽ làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc tạo ra các chấtbảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học ứng dụng trong quá trình bảo quản thực

Đồ án tốt nghiệp

phẩm Đề tài mang tính kế thừa và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Khoa Côngnghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường, Trường Đại học Công nghệ Tp Hồ ChíMinh

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và bước đầu đánh giá hiệu quả

bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum

SC01

3 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum SC01.

- Đánh giá hiệu quả bảo quản thịt heo của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn

Lactobacillus plantarum SC01.

4 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu chỉ tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính hợp chất

kháng khuẩn của L plantarum SC01 được phân lập bởi Lê Ngọc Thuỳ Trang

(2013)

- Đánh giá hiệu quả bảo quản của hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn Lactobacillus

plantarum SC01 đối với thịt heo.

Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

1.1.1.1 Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn lactic

Qua nhiều thế kỷ, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập và giải thíchđược quá trình sinh hóa của nhiều chủng vi khuẩn lactic

Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Carl Wilhemlm Scheele lần đầu tiên táchđược acid lactic từ sữa bò lên men và gọi là “acid sữa” (Nguyễn Lân Dũng, 2002).Năm 1874, Blondeau mới công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng củachuỗi phản ứng của quá trình lên men

Năm 1857, Louis Pasteur chứng minh được việc làm chua sữa là kết quả hoạtđộng của một nhóm vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn lactic

Năm 1878, Joseph Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt

tên là Bacterium lactic (nay còn gọi là Streptococcus lactic) (Nguyễn Thành Đạt,

2001)

Từ đó đến nay, nhiều loại vi khuẩn lactic đã được phân lập và nghiên cứu.Công nghiệp lên men để sản xuất acid lactic có thể nói được bắt đầu từ năm 1881(Nguyễn Lân Dũng, 2002)

Ngày nay quá trình lên men lactic được ứng dụng ở quy mô lớn Do đó, cácchủng vi khuẩn lactic được sử dụng phải thuần và có hoạt tính sinh học cao Trong

đó, được sử dụng nhiều nhất là một số loài thuộc chi Lactobacillus và

Streptococcus.

Vi khuẩn lactic là tên gọi của những vi khuẩn sinh ra acid như là sản phẩmchính trong quá trình chuyển hóa cacbon hydrat

Vi khuẩn lactic phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trên bề mặt rau,

củ, quả, thịt, cá, tôm; trong phân, rác, xác động vật và thực vật; trên niêm mạc

Đồ án tốt nghiệp

miệng và niêm mạc ruột của người, gia súc, gia cầm Đặc biệt, trong sản các sảnphẩm muối chua như dưa cà muối, tôm chua, sữa chua, nem chua… có rất nhiều vi

Đồ án tốt nghiệp

khuẩn lactic Ngoài ra, có một số loài vi khuẩn lactic sống kí sinh trên thực vật, hút các chất tiết từ mô cây (Salmen và Deighton, 1998)

Có thể nhắc đến một số loài trong các sản phẩm sau:

- Trong sữa và các sản phẩm từ sữa thường gặp L bulgarius, L helviticus, L.

casei, L ferment, L brevis Để tồn tại trong môi trường này vi khuẩn lactic phải

tổng hợp được ATP từ cơ chất lactose

- Trên bề mặt thực vật, xác thực vật đang bị phân hủy và trên các loại rau

quả, trái cây: L plantarum, L delnikii, L ferment, L brevis.

- Trong ruột và các niêm dịch ở người và động vật có: L acidophilus, S.

faecalis, S bovis, S salivanius, S pyogenes.

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái

Các vi khuẩn lactic khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài rahình dạng và kích thước của tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường,điều kiện nuôi cấy và sự có mặt của oxi

- Giống Streptococcus có dạng tế bào hình tròn hoặc hình ovan đường kính

khoảng 0,5 – 1,0 µm, sắp xếp riêng biệt, theo cặp đôi hoặc chuỗi dài

Hình 1.1 Tế bào Streptococcus

- Giống Pediococcus có dạng cầu khuẩn, dạng bát cầu khuẩn hay tụ cầu

khuẩn

- Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ 0,5

– 0,8 µm, sắp xếp thành chuỗi và không tạo thành đám tập trung

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.4 Tế bào Leuconostoc

Đồ án tốt nghiệp

- Giống Lactobacillus có hình que, hình dạng của chúng thay đổi từ hình que

ngắn cho đến que dài (que ngắn khoảng 0,5 – 0,7 µm và que dài khoảng 3 – 8 µm).Các tế bào có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ, đây là loại vi khuẩn phổ biếnnhất

Hình 1.5 Tế bào Lactobacillus

1.1.1.3 Đặc điểm sinh hóa

Mặc dù không đồng nhất về hình thái nhưng vi khuẩn lactic tương đối thốngnhất về một số đặc điểm sinh hóa như sau:

Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacillaceae Các chủng vi khuẩn thuộc nhóm

này có đặc điểm sinh hóa khác nhau nhưng đặc tính sinh lý tương đối giống nhau

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, thường không di động, không sinh bào tử

Đa số vi khuẩn lactic lên men được mono và disaccharide, một số không lên menđược saccharose và một số khác không lên men được maltose Một số vi khuẩnlactic không có khả năng lên men tinh bột và các polysaccharide khác (chỉ có loài

L.delbruckii là đồng hóa được tinh bột).

Vi khuẩn lactic thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng sinh tổnghợp enzyme peroxydase rất mạnh, không chứa cytochrome, oxydase và catalase

Vi khuẩn lactic không có khả năng tổng hợp cytochrome và porphyrin (thànhphần của chuỗi hô hấp), do đó chúng không thể tạo ra ATP Các LAB chỉ có thể tạo

ra ATP bằng quá trình lên men đường và nguồn năng lượng chính lấy từ nguồn

1.1.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp và không thể phát triển đượctrong môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và NH4+ Vi khuẩn lacticcần vitamin, acid amin và nhiều chất khác cho quá trình sinh trưởng và phát triển

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon từ các đường đơn(glucose, fructose, manose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến cácpolysaccarit (tinh bột, dextrin) Tuy nhiên, khả năng sử dụng các nguồn cacbonkhác nhau còn tùy thuộc vào các vi khuẩn khác nhau

Nguồn cung cấp năng lượng quan trọng nhất với vi khuẩn lactic làmonosaccarit và disaccarit trong việc cung cấp nguyên liệu xây dựng cấu trúc tế bào

và sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid fumaric, acid acetic (Tortora và Funke, 1992)

Về nhu cầu nguồn nitơ, thì hầu hết các vi khuẩn lactic đều không tự tổng hợpđược các hợp chất nitơ hữu cơ phức tạp Do đó, để đảm bảo cho sự sinh trưởng vàphát triển, vi khuẩn lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ cómột số ít loài có khả năng tự tổng hợp từ nguồn nitơ vô cơ

Căn cứ vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ có thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhóm(Lê Thị Châu và Tạ Kim Chính, 1994):

- Nhóm cần phức hợp các acid amin

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có cistein và muối amon

- Nhóm phát triển tốt trên môi trường chỉ có muối amon là nguồn nitơ duy

Đồ án tốt nghiệp

nhất

Đồ án tốt nghiệp

Nguồn nitơ phổ biến là hỗn hợp acid amin, cao thịt, cao nấm men, pepton,peptit, cazein

Đối với nguồn vitamin có vai trò đồng xúc tác trong nhiều phản ứng Các vi

khuẩn đặc biệt là Lactobacillus rất cần vitanim cho sự phát triển vì vitamin đóng vai

trò coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khảnăng sinh tổng hợp được vitamin Vitamin thường được bổ sung vào môi trườngbằng các chất chứa vitamin như nước khoai tây, ngô, cà rốt, cà chua, cao nấm men

Vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như: lactoflavin, thiamin, acidpantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin Các acid nicotinic và acid pantotenicđặc biệt cần cho sự phát triển của tất cả các vi khuẩn lactic (Vũ Hồng Thắng, 1998).Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic chịu ảnh hưởng bởi thành phần, nhiệt độ,

độ pH, nồng độ CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử trong môi trường nuôi cấy

Đối với các hợp chất hữu cơ, vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn vì chúng cóảnh hưởng mạnh đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của các vi khuẩnnày Các hợp chất hữu cơ thường tồn tại dưới các dạng:

- Các bazơ nitơ: adenin, hypoxanthine, guanin, uraxin, thiamin, thimidin

- Các chất amin: L – asparagin, L – glutamin

- Các acid hữu cơ: acid acetic, acid citric, acid oleic

Protein chưa thủy phân cũng cần cho vi khuẩn lactic Chúng vừa có vai tròcung cấp acid amin, vừa kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với cácacid amin tự do

Trong thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập các vi khuẩn lactic người tathường thấy có mặt citrate và Tween 80 với vai trò chất dinh dưỡng, acetat với vaitrò là chất đệm Bên cạnh đó, Tween 80 (một dẫn xuất của acid oleic) còn có hoạttính bề mặt giúp vi khuẩn sinh trưởng và khuếch tán đồng đều trong dung dịch.Các chất khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, đặc biệt làmagiê và mangan rất cần cho sự phát triển bình thường của các vi khuẩn lactic

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó, mangan có vai trò ngăn cản sự tự phân của tế bào, giải độc cho tế bào khi

có mặt oxy và tham gia duy trì sự ổn định của riboxom Mangan và magiê còn là

Đồ án tốt nghiệp

yếu tố cấu trúc và hoạt động của các emzyme Magiê còn có tác dụng làm tăng khảnăng hấp thu đường của vi khuẩn lactic Phức hợp các chất khoáng còn có tác dụnglàm giảm độ acid trong môi trường nuôi cấy của các vi khuẩn lactic (Trần ThanhThủy, 2003)

1.1.3 Cơ chế trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic có khả năng phân giải carbohydrat để tạo ra acid lactic Tùytheo cách phân giải đường, vi khuẩn lactic được chia thành 2 nhóm: vi khuẩn lênmen đồng hình và vi khuẩn lên men dị hình

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa sinh học kị khí đường thành acid lactic

và một số sản phẩm khác với sự tham gia của vi khuẩn lactic (Nguyễn Lân Dũng,2002)

Tùy từng loài, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên menlactic xảy ra theo phương thức đồng hình hay dị hình hoặc kết hợp cả hai phươngthức trên

1.1.3.1 Lên men lactic đồng hình

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men cho sản phẩm chính là acidlactic (90 – 98%) và một lượng nhỏ acid acetic, aceton, di-acetyl…

Vi khuẩn lactic lên men đồng hình phân giải đường theo con đường EMB(Embden – Meyerhof – Parnas) Mặc dù chỉ tạo thành 2 ATP khi phân giải 1 phân

tử glucose thành 2 phân tử acid lactic nhưng các vi khuẩn này lại có ý nghĩa lớntrong công nghiệp thực phẩm

Phương trình tóm tắt:

Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.6 Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic đồng hình

Các vi khuẩn lactic đồng hình thường gặp: Lactobacillus cremoris, L.

acidophilus, L plantarum, L bulgaricus, L casei, Streptococus, S cremoris, S thermophilus (Nguyễn Lân Dũng, 2002).

1.1.3.2 Lên men lactic dị hình

Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm acidlactic thì chúng còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như acid acetic,etanol, acid xucxinic, CO2… Thông thường, 50% đường được chuyển hóa thành cácsản phẩm phụ này (Jong Won Jun, Sun Chul Kang và Seung Koo, 1997)

Phương trình tóm tắt:

2C6H6O6 2C3H6O3 + C2H4O2 + C2H5OH + C4H6O4 + CO2 + QTrong đó, tỷ lệ các sản phẩm tạo ra là: acid lactic 40%, acid cucinic và etanol20%, acid acetic 10%, các chất khí còn lại 20%

Quá trình lên men dị hình diễn ra theo tru chình PP (Pentose - photphat).Nguyên nhân do thiếu 2 enzyme chủ yếu của con đường EMP là aldolase vàtrizophotphat – isomeraza nên giai đoạn đầu của quá trình phân giải diễn ra theo conđường PP Sau đó, quá trình chuyển hóa từ trizophotphat thành acid lactic xảy ra

Đồ án tốt nghiệp

tương tự như lên men đồng hình Sản phẩm sinh ra phụ thuộc vào giống vi sinh vật,môi trường dinh dưỡng và ngoại cảnh (Phạm Ngọc Lan và ctv, 1999)

Đồ án tốt nghiệp

Các vi khuẩn lên men lactic dị hình thường gặp: Leuconostoc mesenteroides,

L oenos, L cremoris, Lactobacillus brevis, L fermentum, Bifidobacterium bifidum.

Lên men lactic dị hình bởi Bifidobacterium đặc biệt ở chỗ không tạo ra CO2như sự lên men lactic dị hình thông thường

Hình 1.7 Sơ đồ chuyển hóa năng lượng lên men lactic dị hình

1.2 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum

Đồ án tốt nghiệp

Loài: Lactobacillus plantarum

Đồ án tốt nghiệp

1.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum

L plantarum là vi khuẩn gram dương, có hình que, kích thước tế bào từ 0,7 –

1,0 µm đến 3,0 – 8,0 µm Chúng có hệ gen lớn nhất trong tất cả các vi khuẩn lactic

và đã được giải mã hoàn toàn Nhiệt độ phát triển tối ưu là 300C và có khả năngchịu nồng độ NaCl 5,5 %

Lactobacillus spp được phân chia thành 3 nhóm chính tùy thuộc vào khả năng

- Nhóm III lên men hexose thành axid lactic, axid axetic, ethanol và CO2

Là vi khuẩn không gây bệnh, tồn tại trong tuyến nước bọt và đường tiêu hóa

của con người L plantarum là một trong những vi khuẩn lactic được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm như sữa chua, phô mai, kim chi, dưa cải… L.

plantarum có khả năng lên men được nhiều nguồn carbohydrate, được dùng như

một probiotic và có nhiều ứng dụng ngày càng phổ biến

L plantarum có khả năng dị hóa arginine sinh ra nitrite ocid Chúng không có

khả năng phân giải amino acid ngoại trừ tyrosine và arginine Có đến 6 con đườngkhác nhau chuyển hóa arginin, đều sinh ra nitric ocid Việc sinh ra NO giúp ngăn

chặn các vi sinh vật gây bệnh như Candida albicans, E coli, Shigella, Helicobacter

pylory, các amip và kí sinh trùng (Phạm Thị Nga, 2011).

L plantarum là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi chịu oxy Khi có oxy, L plantarum

có thể chuyển oxygen thành hydrogen peroxide Khi không có oxy, L plantarum sẽ

lên men và biến đổi đường thành acid lactic, ethanol (quá trình lên men dị hình)

L plantarum cần mangan cho sự tăng trưởng Mangan giúp cho L plantarum

chống lại độc tính của oxy bằng cách giảm các gốc hydrogen peroxide như H2O2

Đồ án tốt nghiệp

H2O2 được tạo ra sau đó có thể được chuyển đổi thành O2 và nước bởi manganesecofactored pseudocatalase (Kono và Fridovich, 1983)

Đồ án tốt nghiệp

L plantarum có khả năng chịu được pH thấp, có khả năng sống trong các điều

kiện acid của dạ dày người và chịu được tác động của acid mật trong ruột non Kísinh trong đường tiêu hóa bằng cách gắn vào niêm mạc và đại tràng, có ảnh hưởngtích cực đến tế bào vật chủ

L plantarum có trong các thực phẩm lên men, đặc biệt là trong thực phẩm lên

men từ nguyên liệu thực vật như trong ôliu, bạch quả, bắp cải, dưa chuột và sắn(Molin, 2010)

1.2.3 Khả năng sản sinh các hợp chất kháng khuẩn của vi khuẩn L plantarum

Cũng như các chủng LAB khác, L plantarum đều trải qua quá trình lên men

lactic Trong quá trình lên men lacti đồng hình và dị hình, lượng acid lactic tạo rachiếm khá lớn, chỉ một lượng nhỏ pyruvate bị khử carbon tạo thành acid acetic,ethanol, CO2… Acid hữu cơ được sản xuất trong quá trình lên men như acid lactic,acid acetic và acid propionic tạo môi trường không thuận lợi cho sự phát triển củanhiều loại vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng thực phẩm

Ngoài các acid hữu cơ, các hợp chất kháng khuẩn khác như ethanol từ conđường lên men dị hình, H2O2 được tạo ra trong quá trình tăng trưởng hiếu khí vàdiacetyl được hình thành từ sự phân hủy pyruvate

Plantaricin là một hợp chất kháng khuẩn được sản xuất từ L plantarum,

plantaricin có bản chất là polypeptide nên chúng sinh tổng hợp theo cơ chế sinh

tổng hợp protein nhờ ribosome Trong tế bào L plantarum có mang các gene mã

hóa cho các protein tham gia vào quá trình sinh tổng hợp plantaricins Qua quá trìnhphiên mã, dịch mã sẽ tạo ra các protein và đi vào các giai đoạn khác tạo raplantaricins hoàn chỉnh sau đó được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn

1.3 Một số hợp chất kháng khuẩn do vi khuẩn L plantarum sản sinh ra

1.3.1 Plantaricin

Đến nay, theo các nhà nghiêng cứu thì L plantarum sản xuất ra ít nhất 6

bacteriocins khác biệt Tất cả các peptide này chủ yếu được tổng hợp từ các tiền

Đồ án tốt nghiệp

chất có chứa glycine L plantarum tổng hợp các bacteriocins thông qua các gen

PlnE và PlnF Các peptide này sau đó được xử lý bởi các protein PlnG và

Đồ án tốt nghiệp

PlnH Pheromone peptide của hệ thống này được mã hóa bởi một gen riêng biệt(PlnA) và phát hiện bởi protein histidine kinase PlnB bằng cách phosphoryl hóa hai

vùng điều hòa PlnC và PlnD Plantaricins là hợp chất được sản xuất bởi L.

plantarum chúng ức chế một loạt các LAB bao gồm cả các vi khuẩn cạnh tranh với

L plantarum và các vi khuẩn khác như Pediococcus, Carnobacteria, Clostiridia và Propionobacteria.

Plantaricins JK, EF: các bacteriocins hoạt động hổ trợ lẫn nhau Chúng gồm

30 hoặc 40 gốc tự do trong một đoạn và biểu hiện thành nhiều chuỗi nối tiếp tương

tự nhau tạo thành những hợp chất plantaricin khác nhau Các bacteriocins hoạt độngvới tính đặc hiệu và kết hợp chặt chẽ Plantaricin JK và EF có thể hoạt động riêng lẻhoặc chúng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau một cách rất hiệu quả

Plantaricin S và Plantaricin W: Plantaricin S là một hệ thống hai gồm peptide

phân lập từ L plantarum được sử dụng để lên men ô liu xanh Các gen cấu trúc chỉ

ra rằng mỗi peptide ban đầu được sản xuất dựa trên một gốc có chứa glycine motifđôi Các peptide này gồm 26 và 27 gốc tự do amino Plantaricin S được coi là kiểmsoát quá trình lên men và bảo quản ô liu Một bacteriocin gồm hai peptide khác làplantaricin W bao gồm các phân tử protein Plwa và Plwb Các thành phầnlantibiotic bao gồm 29 và 32 đơn vị amino acid được sắp xếp theo trình tự(Zacharof và Lovitt, 2012)

1.3.2 Các hợp chất kháng khuẩn khác

Các acid hữu cơ được sinh ra trong quá trình trao đổi chất bởi vi khuẩn L.

plantarum chủ yếu là acid lactic và acetic, các acid này góp phần giảm pH ngăn cản

sự phát triển của các vi khuẩn có hại như vi khuẩn E coli, Salmonella, S aureus…

Do nội bào vi khuẩn có pH = 7 nên khi có sự chênh lệch pH so với môi trường acidbên ngoài, H+ từ môi trường sẽ đi vào bên trong tế bào vi khuẩn làm pH nội bàogiảm Vi khuẩn phải sử dụng cơ chế bơm ATPase để đẩy H+ ra khỏi tế bào làm cho

vi khuẩn bị mất năng lượng Mặt khác pH giảm thì cũng ức chế quá trình đườngphân làm tế bào vi khuẩn cạn kiệt năng lượng dẫn đến bị tiêu diệt Ngoài ra, các

hiếu khí của L plantarum Hydrogen peroxide tạo các chất oxy hóa mạnh có tác

động diệt vi khuẩn gram âm và tác động kìm hãm các vi khuẩn gram dương phát

triển Một số vi khuẩn như Streptococcus và Lactobacillus sẽ bị ức chế tạm thời, các

vi khuẩn gây bênh như Escherichia coli, Salmonella và Pseudomonas spp có thể bị

khuẩn E coli.

Bacteriocin là hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các peptid được tổng hợp ởriboxom của vi khuẩn Gram âm và vi khuẩn Gram dương Bacteriocin có hoạt tínhkìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển của một số

vi khuẩn khác Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính khángsinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm mà không trực tiếp làm chết vi sinh vật.Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác độngcủa môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian sống…Cácbacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp Đặc tính diệtkhuẩn cao hơn ở pH thấp, tương đối bền ở nhiệt độ cao và không bị ảnh hưởng bởicác dung môi hữu cơ Các enzyme thuỷ phân protein có điện tích âm có thể thuỷphân các peptid này dẫn đến sự mất hoạt tính Do có bản chất protein nên

và trinh tự chuỗi amino acid Bacteriocin được chia thanh 3 lớp:

- Lớp I: Các Lantibiotic là những peptid nhỏ có trọng lượng phân tử (<5kDa), ổn định nhiệt hoạt động theo những cấu trúc màng tế bào Lantibiotic bacteriocin lớp I được chia thành 2 lớp phụ:

+ Lớp phụ Ia: hoạt động bằng việc tạo những lỗ trên màng tế bào chất Nisin thuộc nhóm này

+ Lớp phụ Ib: là những peptid đặc trưng hình cầu, không linh động, tích điện

âm hoặc không tích điện Đại điện: Meracidin

Hình 1.8 Bacteriocin lớp I

- Lớp II: Non - Lantibiotic là những peptid có trọng lượng phân tử biến thiên,

ổn định nhiệt, chứa những amino acid thông thường Nhóm này được chia thanh 3lơp nhỏ:

Đồ án tốt nghiệp

+ Lơp IIa: là lớp lớn nhất gồm những peptid hoạt động kháng lại Listeria, đại

diện đặc trưng cho nhóm này là pediocin PA-1 Leucocin A và Sakacin P Cácbacteriocin nhóm này có nhiều ứng dụng trong công nghiệp

+ Lớp IIb: được hình thành bởi phức hợp của hai peptid riêng biệt, nhữngpeptid này ít hoặc không hoạt động Bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là:Lactococcon G, Plantaricin EF và Plantaricin JK

+ Lớp IIc: là những peptid nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacterocin khôngđồng nhất nên phương pháp hoạt động của chúng cũng khác nhau Đại diện:Divergicin A và Acidocin B

- Lớp III: các peptid có trọng lượng phân tử lớn > 30 kDa, không tan, khôngbền nhiệt Nhóm này bao gồm các enzyme ngoại bào kháng lại các vi khuẩn có khảnăng bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin Đại diện gồm có Acidofilicin

A và Lactacins A, B

- Lớp IV: là những bacteriocin phức hợp, ngoài protein còn có thêm thànhphần lipid và cacbohydrate Hiện nay còn nhiều điều chưa biết về cấu trúc và chứcnăng và bacteriocin của lớp này vì chưa có phân tử nào của lớp này được tinh sạch

1.4.2 Cơ chế hoạt động của bacteriocin

Bacteriocin có khả năng kháng lại vi khuẩn Gram dương như: Bactobaccilus,

Listeria monocytogenes, Salmonella tiphymurium Hiệu quả ức chế vi khuẩn Gram

âm kém vì màng ngoài của chúng của chúng gây cản trở hoạt động của bacteriocin.Hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin phụ phuộc vào một số yếu tố: hàmlượng bacteriocin, độ tinh sạch, vi khuẩn chỉ thị và điều kiện thí nghiệm

Việc xâm nhập của bacteriocin qua màng tế bào phụ thuộc vào điện thế màng.Hoạt động của bacteriocin bao gồm 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: bacteriocin bám lên bên ngoài tế bào Không gây nguy hiểmsinh lý tế bào

- Giai đoạn 2: Vi khuẩn bị tổn thương do sự thay đổi quá trình sinh hóa trong

tế bào từ đó dẫn đến các bệnh lý gây ức chế cũng như gây chết vi khuẩn

Đồ án tốt nghiệp

Đồ án tốt nghiệp

Trong đó:

Hình 1.9 Cơ chế hoạt động của Bacteriocin

- Lớp I (Nisin): Dạng A Lantibiotic gồm những phân tử lưỡng tính dài có thểtiêu diệt các tế bào bằng cách tạo kênh trên màng sinh chất

- Lớp II (Sakasin): mang điện dương trong môi trường trung tính và chứamột vùng kỵ nước hoặc vùng lưỡng cực Dẫn đến làm thay đổi tính thấm của màng

tế bào

- Bacteriolysins (lysostaphin): tác động phá hủy vách tế bào

1.4.3 Một số phương pháp thu nhận, tách chiết và tinh sạch các hợp chất kháng khuẩn

Bacteriocin có thể được sản xuất trong suốt quá trình lên men thực phẩm Đặcbiệt, bacteriocin từ LAB có thể được sản xuất với số lượng cao hơn trong điều kiệnsản xuất invitro dưới điều kiện hóa lý thích hợp Lợi thế của việc sản xuất invitro là

do không có sự hiện diện của các yếu tố gây hạn chế, như sự khuếch tán hạn chế,bất hoạt bởi protease Tuy nhiên, ngay cả có sự kiểm soát các quy trình lên men thì

sự khác biệt trong kết quả thu được và sự ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến

các hoạt động thu bacteriocin vẫn khó có thể được quản lý (Rattanachaikunsopon vàPhumkhachorn, 2010).

Trong trường hợp khi độ pH giảm sẽ làm giảm sự hấp thụ của các phân tửbacteriocin lên các tế bào sản xuất, do đó gia tăng hoạt tính sinh học Ngoài ra, nhiệt

độ và độ pH cũng như chất dinh dưỡng có sẵn cũng đóng một vai trò quan trọngtrong sản xuất bacteriocin và sự hiện diện của của natri clorua cũng thường làmgiảm khả năng sản xuất Nhìn chung, điều kiện nuôi cấy trực tiếp ảnh hưởng đếnsản xuất bacteriocin cũng như gián tiếp ảnh hưởng đến quá trình sản xuất sinh khối.Điều này được giải thích bởi thực tế cho thấy việc sản xuất bacteriocin phụ thuộcvào đặc điểm sinh lý, các yếu tố tăng trưởng, sự phát triển và quá trình chuyển hóacủa LAB

Ba phương pháp chính để tinh chế bacteriocin bởi LAB để đồng nhất có thểđược phân biệt:

- Phương pháp thứ nhất: là phương pháp thông thường, tủa bằng ammoniumsulfate, trao đổi ion, tương tác kỵ nước, lọc gel và giai đoạn sắc ký ngược lỏng cao áp

- Phương pháp thứ hai: thực hiện khá đơn giản với ba bước gồm: tủaammonium sulfate, tách chiết bằng chloroform/methanol và sắc ký đảo ngược phalỏng cao áp

- Phương pháp thứ ba: bacteriocin có thể được cô lập thông qua một quytrình duy nhất bằng cách sử dụng gel tương tác kỵ nước, sau khi tối đa hóa mức độhấp thụ bacteriocin có sẵn thông qua điều chỉnh pH của môi trường lên men thô.Hai phương pháp sau được xem là nhanh hơn so với phương pháp phươngpháp đầu tiên

Một số bacteriocin với tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp đã được tinh

sạch, chẳng hạn như bacteriocins loại II amylovorin L (sản xuất bởi Lactobacillus

amylovorus DCE 471) và một số enterocins (sản xuất bởi Enterococcus faecium

RZS C5, C13 RZS, và chủng FAIR-E 406) và macedocin lantibiotic (sản xuất bởi

Streptococcus donicus ACA-DC 198) (De Vuyst và Leroy, 2007).

1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn

a pH

Bacteriocin hoạt động mạnh nhất ở pH 5,0 và pH 6,0 Hoạt tính kháng khuẩncủa bacteriocin vẫn hoạt động trong môi trường có tính acid hoặc trung tính Sự ổnđịnh của bacteriocin ở các mức pH khác nhau giúp ứng dụng cho nhiều loại thựcphẩm Bacteriocins được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic thường hoạt động tốttrong pH 2,0 - 6,0 và ngừng hoạt động trong môi trường có pH 8,0 - 12,0

b Nhiệt độ

Bacteriocin hoạt động bình thường ở nhiệt độ phòng, hoạt tính kháng khuẩncủa bacteriocin vẫn hoạt động tốt khi nhiệt độ tăng dần, bacteriocin vẫn giữ đượchoạt tính khi nhiệt độ tăng dần đến 1210C trong 20 phút sau và bacteriocin hoạtđộng yếu ở nhiệt độ thấp

c Ảnh hưởng của thủy phân protein enzyme

Các enzym phân giải protein như pepsin và proteinase-K làm giảm hoạt tínhkháng khuẩn của bacteriocin Trong khi đó α-amylase, lipase, α-chymotrypsin vàtrypsin không gây ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin từ cácchủng LAB sản xuất (Ravi và ctv, 2001)

d Các chất hoạt động bề mặt

Hợp chất kháng khuẩn sản sinh ra từ những chủng LAB khác nhau thì có khảnăng chịu ảnh hưởng của các chất hoạt động bề mặt khác nhau Đối với hợp chất

kháng khuẩn sản sinh từ chủng Pediococcus pentosaceus khi có sự hiện diện SDS,

Tween 20, Tween 80, Triton X-100, Urea, NaCl nồng độ 1% (w/v) hoặc EDTA 5

mM vẫn không ảnh hưởng đến hoạt tính của hợp chất kháng khuẩn (Daniel và ctv,2011) Trong khi đó, các hợp chất hoạt động bề mặt như Tween 20, Tween 80 lạilàm giảm khả năng kháng khuẩn, urea làm bất hoạt khả năng kháng khuẩn, EDTA

và SDS lại làm tăng khả năng kháng khuẩn đối với hợp chất kháng khuẩn sản xuất

từ chủng Lactobacillus plantarum (Arifah và ctv, 2013).

1.5 Một số phương pháp bảo quản thực phẩm và tình hình ứng dụng các sản phẩm từ vi sinh vật

1.5.1 Một số phương pháp bảo quản thực phẩm

Thực phẩm không được bảo quản thường bị biến đổi dẫn đến mất giá trị dinh dưỡng và giá trị cảm quan Những biến đổi đó do những nguyên nhân sau:

- Do vi sinh vật: vi sinh vật có sẵn trong thực phẩm hoặc nhiễm từ bên ngoài

 Phương pháp sấy tự nhiên (phơi nắng)

- Là phương pháp sử dụng nhiệt của ánh sáng mặt trời để làm khô sản phẩm

- Thích hợp cho các loại hạt ngũ cốc, các loại thủy sản ướp muối (cá, tôm,mực…)

- Hong khô rau quả mà không cần nắng

 Phương pháp sấy nhân tạo

- Sấy khô: dùng lò sấy than, củi… để làm bay hơi nước trong thực phẩm.Chất lượng sản phẩm không cao (chất dinh dưỡng, vitamin bị ảnh hưởng)

- Sấy phun: đặc thù của phương pháp này là cô đặc sản phẩm bằng cách dùngvòi phun cao áp dạng sương mù trong buồng sấy có nhiệt 950C để diệt các vi sinhvật đồng thời tạo ra sản phẩm khô

- Sấy thăng hoa: nước trong thực phẩm (thể lỏng) chuyển sang dạng hơi nước

và tạo thành thể rắn

- Sấy bằng bức xạ: làm sản phẩm nóng bằng cách dùng các đèn hồng ngoại

có công suất 250-500W, chiếu tia hồng ngoại (0,75 - 4µm) vào sản phẩm

- Sấy bằng điện cao tần: là phương pháp đặt sản phẩm sấy vào điện trườngxoay chiều có tần số dao động cao (500kHz) giúp cho sản phẩm khô đều và nhanh

Để giữ sản phẩm được trong thời gian dài thì các sản phẩm sau khi làm khôphải được làm nguội ngay, bao gói tốt, tránh hút ẩm trở lại, giữ nơi khô mát

b Phương pháp sử dụng nhiệt

 Phương pháp nhiệt độ thấp

- Làm lạnh: chủ yếu được áp dụng để bảo quản rau quả tươi

Nhiệt độ hạ xuống gần 00C, tinh thể nước đá chưa xuất hiện, hệ thống men(trong nguyên liệu và trong VSV) hoạt động yếu đi dẫn đến kìm hãm những biếnđổi về lý, hóa, sinh; hoạt động vi sinh vật

- Làm lạnh đông (đông lạnh): là phương pháp giúp giữ thực phẩm vài thángđến vài năm

Nhiệt độ của thực phẩm được hạ thấp hơn nhiệt độ đóng băng của các dungdịch nước trong thực phẩm giúp phần lớn nước trong thực phẩm bị đóng băng,màng tế bào của vi sinh vật bị nén mạnh Các quá trình sống của vi sinh vật và hoạtđộng của các hệ thống men bị kiềm chế

 Phương pháp nhiệt độ cao: là phương pháp diệt vi sinh vật và cả bào tử củachúng

- Thanh trùng Pasteur (gián đoạn và liên tục)

Thanh trùng gián đoạn: phương pháp này dùng một lò hấp Pasteur, bên trong

có một thùng chứa được bao quanh bởi hơi nước lưu thông Trong thùng chứa này,sữa được làm nóng và được khuấy đều trong suốt thời gian khử trùng Sau đó sữa cóthể được làm nguội trong thùng chứa Ngoài ra, người ta có thể làm nóng sữa mộtphần trong một lò hình ống trước khi đưa vào thùng chứa Phương pháp này ít dùng

để thanh trùng sữa, thường dùng để thanh trùng những sản phẩm từ sữa hơn