Họ thụ thể bắt cặp với protein g và ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới

hình 4 Hình 4: Cấu trúc của thụ thể liên kết với protein G Tín hiệu signal truyền từ thụ thể trên 7-helix receptor đến một protein nội bào được gọi là G-protein, do vậy nhóm thụ thể nà

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH HOÀNG CƯỜNG

HỌ THỤ THỂ BẮT CẶP VỚI PROTEIN

G VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THUỐC MỚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI – 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRỊNH HOÀNG CƯỜNG

HỌ THỤ THỂ BẮT CẶP VỚI PROTEIN

G VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN

CỨU PHÁT TRIỂN THUỐC MỚI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này,

tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lới cảm ơn chân thành tới:

Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Bộ môn Hóa Đại cương – Vô cơ trường

ĐH Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Phó giáo sư- Tiến sĩ khoa học Lê Thành Phước, người thầy kính mến

đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Thạc sĩ Lê Đình Quang, người thầy đáng kính trong công việc cũng

như trong cuộc sống Thầy đã động viện giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi rất nhiều

để tôi có thể hoàn thành được khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm khóa luận đã cho tôi những đóng góp quý báu để hoàn chỉnh khóa luận này

Do thời gian có hạn nên khóa luận của em không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong có được sự góp ý quý báu và sự giúp đỡ của các thầy

cô và các bạn sinh viên

Sinh viên

Trịnh Hoàng Cường

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 0

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC HÌNH 6

ĐẶT VẤN ĐỀ 8

Phần 1: Họ thụ thể bắt cặp với protein G 9

và các quá trình truyền tín hiệu trong tế bào 9

1.Protein G 9

1.1.Sự phát hiện ra protein G 9

1.2.Cấu trúc của G-protein 11

1.3 Vai trò của protein G 13

2 Họ thụ thể bắt cặp với protein G ( GPCRs) 14

2.1 Tổng quan 14

2.2.Phân loại 18

2.3.Vai trò sinh lý 20

2.4 Cấu trúc GPCR 21

2.5 Tương quan giữa cấu trúc và chức năng 24

3 Mô hình phức hệ ba thành phần 27

3.1 Các phối tử 28

3.2 Sự thay đổi trạng thái của GPCR 30

3.3 Trình tự các sự kiện xảy ra khi hormone kích hoạt tín hiệu cAMP: 33

3.4 Sự ngắt tín hiệu (turn off of the signal) và sự khuếch đại tín hiệu (signal amplification) : 33

3.5 Sự xáo trộn của chu trình G-Protein 36

3.6 Sự điều hòa tín hiệu G-protein 38

4.Chi tiết 2 con đường truyền tín hiệu AMPc và PIP2 41

4.1 Con đường truyền tín hiệu AMPc 42

 Lộ trình tín hiệu của AMPc 42

 Sự hình thành AMPc 44

 Adenylyl cycase ( AC) 45

 Các chất tác hiệu thông qua AMPc 46

 Protein kinase A (PKA) 47

 Sự phân giải AMPc 50

4.2 Lộ trình tín hiệu Phosphoinositide 50

 DAG 51

 IP3 52

Phần 3: Định hướng nghiên cứu thuốc mới 53

1 Ứng dụng trong sản xuất thuốc mới 53

2 Trong điều trị ung thư 56

3 Trong điều trị bệnh tim 59

4 Trong điều trị bệnh do virut 60

5 Định hướng nghiên cứu ứng dụng thuốc tác động vào protein G 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Giα protein G bất hoạt

IP3 Inositol 1, 4, 5 triphosphat

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Sự hoạt hóa protein G bởi GPCR ( bị kích hoạt bằng

cách liên kết với phối tử)

9

Hình 2: Mô tả cấu trúc G-protein 11 Hình 3: Minh họa rút gọn quá trình hoạt động của G-protein 12 Hình 4: Cấu trúc của thụ thể liên kết với protein G 16

Hình 11: Mô tả sự ADP-ribosyl hóa 35

Hình 12: Minh họa một số cấu trúc 37

Hình 13: Minh họa một số vai trò của RGS protein 39

Hình 14: Mô phỏng sơ khai hoạt động thông qua AMPc 42

Hình 15: AC từ 1 đến 9 được phân bố rộng rãi 44 44

Hình 16: Cấu trúc domain của AC 45

Hình 17: Tổ chức và chức năng của lộ trình tín hiệu AMPc 46

Hình 18: Sơ lược sự hoạt hóa PKA 48

Hình 19: mô phỏng sơ khai hoạt động của 1, 4, 5-triphosphate

và DAG

50

Hình 20: Tác dụng của các loại protein G 58

Hình 21: Vai trò của GPCR với điều hòa Ca 59

Hình 22: Cấu trúc tinh thể của receptor Beta- adrenergic

(βAR) ở trạng thái hoạt động

82

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong cơ thể con người có hàng chục ngàn tỷ tế bào tương tác với nhau Hầu hết trong số chúng được phát triển để đảm nhận các vai trò, chức năng khác nhau Để thực hiện tốt vai trò của mình, điều quan trọng nhất là các

tế bào làm việc cùng một lúc, phối hợp hài hòa với nhau, chúng có thể cảm nhận môi trường và biết những gì đang xảy ra xung quanh chúng

Yếu tố giúp các tế bào có thể làm được việc này đó chính là các thụ thể

ở trên bề mặt tế bào Robert J Lefkowitz và Brian K Kobilka được trao giải thưởng Giải Nobel Hóa học 2012 vì đã giải thích được một họ các thụ thể liên kết với Protein G (GPCRs) hoạt động như thế nào Trong họ thụ thể này, có các thụ thể đáp ứng với adrenalin (còn được gọi là epinephrine), dopamine, serotonin, ánh sáng, hương vị và mùi vị Phần lớn các quá trình sinh lý trong

cơ thể phụ thuộc vào hoạt động của GPCRs Khoảng một nửa các loại thuốc hiện nay hoạt động thông qua các thụ thể này, trong đó có thuốc chẹn beta, thuốc kháng histamin và các loại thuốc tâm thần Kiến thức về GPCRs giúp đem lại lợi ích lớn cho nhân loại Tuy nhiên, các thụ thể hoạt động ra sao, cấu tạo của chúng như thế nào đã là 1 bí ẩn với các nhà khoa học suốt một thời gian dài trước khi các công trình của Robert J Lefkowitz và Brian K Kobilka được công bố

Vì vậy, kiến thức về GPCRs là hết sức quan trọng giúp chúng ta vận dụng cho các công trình nghiên cứu sản xuất thuốc mới: các thuốc trị bệnh tim, Parkinson và chứng đau nửa đầu Luận văn tốt nghiệp của tôi thực hiện với hai mục tiêu sau đây:

1 Tổng quan kiến thức về GPCRs: cấu tạo, vai trò, cách thức hoạt động

2 Ứng dụng trong nghiên cứu phát triển thuốc mới

G- protein được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin Rodbell năm 1971

về sự kích hoạt cAMP bởi glucagon Nhờ thí nghiệm này Martin Rodbell đã

phát hiện ra sự hiện diện của GTP là rất quan trọng trong phản ứng này Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide, sau này đổi tên là N-protein, hoạt động như bộ chuyển đổi trung gian giữa discriminator (receptor) and amplifier (effector; i.e., adenylate cyclase)

Sau đó, ông thấy rằng adenylatecyclase đã được kích hoạt mạnh mẽ và không thể đảo ngược bởi một analog GTP,5'-guanylylimidophosphate, hoặc[GPP (NH)-p]’ Vì GPP (NH)-p có khả năng chống thủy phân nên Rodbell cho rằng GTP là"chất thủy phân tại vùng tác hoạt", có nghĩa là, bộ chuyển đổi giống như GTPase Điều này sau đó đã được thể hiện rõ hơn bởi Cassell và Selinger vào năm 1976 Sự có mặt của protein bám GTP riêng lẽ, khác biệt với các enzyme adenylate cyclase, được xác định bởi Alfred Gilman và đồng nghiệp người đã tái thiết lại GPP (NH)-p-, 1 chất kích thích hoạt động adenylate cyclase trong màng từ dòng đột biến tế bào ung thư hạch (cyc-) - có adenylate cyclase nhưng thiếu G-protein bằng cách bổ sung thêm yếu tố 40kDa GTP bám riêng biệt

Năm 1980, Howlett và Gilman cho rằng sự kích hoạt lâu dài của G-protein kích hoạt cyclase làm giảm lượng phân tử protein, nhấn mạnh rằng G-protein được tạo thành bởi những tiểu đơn vị có thể li giải được Cấu trúc tam thể (3 thành phần) của G-protein được phát hiện bởi Stryer và cộng sự Họ đã chứng

tỏ được rằng sự kích hoạt Gt bởi Gpp(NH)-p và ánh sáng dẫn đến sự phân ly của phức hợp trimeric αβγ, tạo nên Gpp(NH)-p bám αt và βγ (αt có vai trò kích hoạt sự khử phosphoryl hóa) Năm 1985, α-transducin được tạo thành bởi 4 nhóm với các trưởng nhóm là Numa, Boume, Khorana, và Simon; Năm

1986, cấu trúc của tiểu đơn vị α được xác định đầy đủ bởi nhóm của Gilman

Rodbell và Gilman được trao giải Nobel vào năm 1994 [1]

1.2.Cấu trúc của G-protein

G-protein được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45 kDa, tiểu đơn vị β có KLPT ~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa Có khoảng 20 gen mã hóa nhiều loại tiểu đơn vị α, 6 gen đối với tiểu đơn vị β và 12 gen cho tiểu đơn vị γ Ở trạng thái trimer hóa, G-protein bám vào mặt trong của màng

tế bào thông qua đuôi kị nước của tiểu đơn vị α và γ (myristoyl và palmitoyl trên α, farnesyl hoặc geranylgeranyl trên γ) Tiểu đơn vị β và γ được nối lại với nhau bởi liên kết giữ lõi với lõi để tạo nên βγ-dimer; tiểu đơn vị β của βγ-dimer này sẽ bám vào tiểu đơn vị α bằng theo kiểu bổ sung ở vùng liên kết peptide trên 2 protein và sự tương tác với đuôi kị nước Khi G-protein được kích hoạt, liên kết giữa tiểu đơn vị α và β bị đứt, trimer bị phân ly thành tiều đơn vị monomeric α và tiểu đơn vị dimeri βγ Tiểu đơn vị α và βγ đều bám

vào màng tế bào nhưng cũng dễ dàng tách khỏi màng khi cần.[59]

Hình 2: Mô tả cấu trúc G-protein

Tiểu đơn vị α có 2 vùng chức năng quan trọng khác ngoài vùng để nối kết với tiểu đơn vị β Một là, tiểu đơn vị α tác động với thụ thể ở vị trí 5 amino acid cuối của đầu C tận Hai là nó mang vùng gắn kết với guanine nucleotide để thực hiện chức năng GTPase của G-protein Mặc khác, cả 2 tiểu đơn vị α và

βγ đều có thể tác động đến bề mặt tác động của G-protein

Tiểu đơn vị α và γ có liên kết cộng hóa trị với neo lipid , do vậy bám dính và

cố định G-protein vào mặt trong màng tế bào Sau khi tách ra khỏi protein G, tiểu đơn vị α sẽ hoạt hóa enzym Adenylate cyclase (AC)

Adenylate cyclase (AC) là một protein xuyên màng, vùng hướng về phía bào tương được gọi là vùng thủy phân (catalytic site) Enzym AC sẽ giúp chuyển ATP thành AMPc

Hình 3: Minh họa rút gọn quá trình hoạt động của G-protein

1.3 Vai trò của protein G [1] [2]

 Protein G trong 1 số quá trình sinh lý

Sau này, người ta tìm ra nhiều loại protein khác nhau, mỗi loại được hoạt hóa bởi 1 receptor riêng và nó kích hoạt hệ thống khuếch đại riêng Dẫn đến những thay đổi khác nhau trong tế bào Ví dụ như trong võng mạc mắt, protein G chuyển đổi tín hiệu ánh sáng để kích hoạt lên những sợi dây thần kinh mà truyền đạt kích thích thị giác lên não Nhận biết về mùi cũng phụ thuộc vào protein G trong các tế bào olfactory ( tế bào khứu giác) Và cảm giác hương vị còn liên quan đến những protein G khác

Một số protein G kích thích hoặc ức chế sự hình thành của AMPc, vì thế có

sự chuyển hóa trong tế bào Protein G làm thay đổi lưu lượng các ion qua màng tế bào và thay đổi hoạt động tế bào Protein G còn ảnh hưởng đến quá trình phosphor hóa protein do đó kiểm soát quá trình phân chia và những quá trình khác của tế bào

 Protein G và bệnh lý

Nhiều triệu chứng của bệnh được giải thích là do sự thay đổi chức năng của Protein G Ví dụ bệnh tả , một bệnh truyền nhiễm đáng lo ngại nhất của đường tiêu hóa Bệnh là do vi khuẩn sản xuất 1 độc tố rất độc Các độc tố đóng vai trò như 1 loại enzym làm thay đổi 1 trong những protein G luôn ở trạng thái hoạt động Điều này ngăn cản sự hấp thu nước và muối ở ruột một cách bình thường Kết quả sự mất nước và muối có thể dẫn đến tử vong

Nhiễm khuẩn E.coli cũng có triệu chứng tương tự

Trong trường hợp bị nhiễm khuẩn ho gà thì độc tố lại ngăn cản sự hoạt động của protein G Do đó hàng rào miễn dịch bị tổn thương

Trong một số bệnh phổ biến, số lượng protein G trong tế bào thay đổi Có thể

có quá nhiều hoặc quá ít Như trong bệnh tiểu đường và nghiện rượu có một

số triệu chứng là do thay đổi tín hiệu của protein G

Người ta thấy rằng biểu hiện suy giảm protein G có thể làm ảnh hưởng tới sự phát triển và rối loạn chuyển hóa Ở những người đột biến và hoạt tính quá mức của protein G có thể là nguyên nhân của một số khối u Tăng hoạt động của protein G còn được tìm thấy trong rối loạn nội tiết di truyền nhưng hiếm gặp như hội chững Mc-cune Albright ( da có các đốm màu cà phê sữa và biến dạng xương) Trong trường hợp này, một sự đột biến của protein G dẫn đến chuyển hóa calci bị gián đoạn , dẫn đến biến dạng xương

Gần đây người ta khám phá ra các protein G nhỏ chỉ có một đơn vị Chúng

có cấu trúc gần giống các sản phẩm của tiền oncogen là những protein chức năng của tế bào như: tham gia vào các quá trình sinh trưởng , phát triển, tình trạng bộ xương tế bào, vận chuyển bên trong tế bào, hoạt động thực bào, bài tiết,… Ví dụ như các protein G nhỏ thuộc họ ras kiểm soát sự phát triển tế bào, điều hòa quá trình oxy hóa thực bào trong bạch cầu Sự đột biến protein

G khiến chúng có thể trở thành siêu hoạt động và do có vai trò chức năng trong quá trình sinh trưởng của tế bào như trên do đó có khả năng gây ung thư

Họ thụ thể bắt cặp với protein G ( GPCRs)

2.1 Tổng quan

 Tại sao cần có thụ thể GPCR trên màng tế bào ?

Mỗi tế bào người đều được bao bọc bởi một lớp màng tế bào Đó là một lớp phospholipid kép Lớp màng này cho phép tế bào duy trì một hỗn hợp nhất định các chất có vai trò hóa sinh, đồng thời ngăn ngừa các hóa chất không

mong muốn ở bên ngoài môi trường có thể xâm nhập tế bào Để có thể thực hiện đầy đủ chức năng của mình, các bộ máy sinh hóa bên trong tế bào cần 1

cơ chế cho phép nó có thể nhận được các thông điệp về môi trường bên ngoài

tế bào

Các thay đổi về lượng hormone bên ngoài tế bào có thể điều khiển những hoạt động của enzyme nội bào Các phân tử có mùi thơm tác động vào các tế bào thuộc lớp biểu mô khứu giác Ngoài ra các chất có trong thức ăn có thể ảnh hưởng đến hoạt động hóa sinh diễn ra bên trong tế bào chồi vị giác sau đó lan truyền dưới dạng các tín hiệu điện tử đến não bộ

Thực tế, các tế bào người đều thường xuyên giao tiếp với nhau và với môi trường xung quanh Để làm được điều này, tế bào cần 1 hệ thống các phân tử

và 1 cơ chế truyền thông tin hiệu quả đi qua màng tế bào Ngoài ra, trong cơ thể quá trình truyền tín hiệu có thể phải diễn ra với 1 khoảng cách khá xa Do

đó, để có thể phản ứng đúng lúc, não bộ cần nhận thông tin rất nhanh từ các giác quan, như thị giác, khứu giác, vị giác v.v Thêm một lần nữa, điều này cũng cần một cơ chế truyền thông tin đi qua màng tế bào GPCRs đóng góp vai trò quan trọng trong hệ thống truyền thông tin tế bào

hoạt động của các phân tử này thông qua các nghiên cứu hóa sinh, sinh lý và cấu trúc

 Thụ thể liên kết G protein

Thụ thể liên kết G protein (GPCRs) đóng vai trò quan trọng trong hệ thống truyền tin tế bào Đó là các protein nằm trên màng tế bào Tên gọi thụ thể liên kết G protein là để nói đến cơ chế truyền tín hiệu phổ biến nhất thông qua thụ thể đó là các protein có thể liên kết với GTP ở bên trong tế bào Bởi vì các chuỗi peptide của GPCR thường gấp khúc 7 lần qua màng tế bào nên trong nhiều trường hợp GPCR cũng được gọi là thụ thể 7 vùng xuyên màng (7-

transmembrane receptors, 7TM) ( hình 4)

Hình 4: Cấu trúc của thụ thể liên kết với protein G

Tín hiệu (signal) truyền từ thụ thể trên (7-helix receptor) đến một protein nội bào được gọi là G-protein, do vậy nhóm thụ thể này còn được gọi là G-

Protein-Coupled Receptors (GPCR) Có khoảng 800 GPCR được tìm thấy ở

người [59]

GPCR được nhị hợp (dimerize) hoặc oligomer hóa để tạo thành một phức hợp nội màng Ligand bám vào thụ thể sẽ truyền tin đi vào cấu trúc này và sinh ra các tác động tương ứng đặc trưng cho từng loại thụ thể

Có nhiều loại GPCR-interacting proteins (GIPs) điều hòa chức năng của thụ thể Những tác động này bao gồm:

- Thay đổi ái lực của ligand

- Điều hòa sự nhị hợp hay oligomer hóa của thụ thể

- Định vị vị trí của thụ thể, bao gồm cả việc vận chuyển hay loại

bỏ chúng từ màng tế bào

- Kiểm soát sự tương giao của các protein thông tin khác

Thụ thể bắt cặp protein G chỉ được tìm thấy trong các sinh vật nhân chuẩn,

bao gồm cả nấm men, trùng đuôi roi dạng phễu (choanoflagella), [23]

và động vật Các phối thể bám vào và kích hoạt thụ thể G bao gồm các hợp chất nhạy cảm với ánh sáng, phân tử mùi hương, pheromone, kích hãm tố,

và chất dẫn truyền thần kinh; các phối thể này rất đa dạng về kích thước từ những phân tử nhỏ cho đến các đoạn peptide hay các protein lớn Thụ thể bắt cặp protein G có liên quan tới nhiều bệnh tật trong cơ thể và cũng là mục tiêu

của khoảng 30 phần trăm số dược phẩm hiện nay [24] [25]

Có hai quá trình dẫn truyền tín hiệu chủ yếu có sự góp mặt của thụ thể GCPR:

quá trình AMP vòng và quá trình phosphatidylinositol [26] Khi một phối thể

bám vào GPCR, nó khiến cấu hình của GPCR thay đổi và điều này cho phép

GPCR hoạt động như một nhân tố trao đổi guanine nucleotide (guanine

nucleotide exchange factor - GEF) Tức là GPCR sẽ hoạt hóa một protein

G đi kèm với nó bằng việc trao đổi GDP của nó cho một GTP Tiểu đơn vị α của protein cùng với GTP đó lúc này có thể tách rời khỏi các tiểu đơn vị β và

γ để tác động đến các protein dẫn truyền tín hiệu nội bào hay các protein chức năng đích; cái này tùy thuộc vào tiểu đơn vị α thuộc vào loại gì (Gαs, Gαi/o, Gαq/11, Gα12/13) [27]

2.2.Phân loại

Số lượng chính xác của đại gia đình GPCR hiện nay vẫn chưa biết hết nhưng

có gần 800 gen người khác nhau (tương ứng với ≈ 4% của toàn bộ bộ gen mã hóa protein) đã được phát hiện ra từ phân tích trình tự bộ gen là mã hóa cho các GPCR [28] Có nhiều hệ thống phân loại đã được đề xuất và hệ thống phân loại cơ bản chia đại gia đình GPCR thành ba nhóm chính (A, B, và C) và

1 nhóm không thể phát hiện được sự tương đồng về trình tự acid amin giữa các GPCR Lớp chiếm số lượng lớn nhất cho đến nay là loại A, chiếm gần 85% các gen GPCR.Trong lớp A thì hơn một nửa trong số này mã hóa thụ thể khứu giác trong khi các thụ thể còn lại sẽ kết hợp với các hợp chất nội sinh đã được biết đến hoặc là không liên kết với phối tử nào Tuy không có sự tương đồng về trình tự sắp xếp acid amin giữa các lớp , nhưng tất cả các GPCRs đều có chung một cấu trúc và cơ chế truyền tín hiệu Tất cả các GPCRs có thể được chia thành 6 lớp học dựa trên trình tự tương đồng acid amin và có chức năng tương tự nhau: [29] [30] [31] [32]

Lớp A (hoặc 1) ( giống Rhodopsin) Lớp B (hoặc 2) ( họ thụ thể secretin) Lớp C (hoặc 3) (glutamate Metabotropic / pheromone) Lớp D (hoặc 4) (thụ thể pheromone sinh sản ở nấm)

Lớp E (hoặc 5) (thụ thể AMP vòng ) Lớp F (hoặc 6) (Frizzled, Smoothened) Lớp A: thụ thể giống Rhodopsin là một lớp có số lượng thụ thể rất lớn Lớp này đã được chia nhỏ hơn nữa thành 19 nhóm (A1-A19) [33]

Gần đây, có một hệ thống phân loại khác được gọi là GRAFS ( glutamate, Rhodopsin, Adhesion, Frizzled/Taste2, secretin) đã được đề xuất [28]

Hệ gen của con người mã hóa hàng ngàn các thụ thể protein-coupled G, [32] khoảng 350 trong số đó phát hiện hormone, yếu tố tăng trưởng, và phối tử nội sinh khác Khoảng 150 của GPCRs tìm thấy trong hệ gen của con người có chức năng không rõ

Một số tổ chức về thông tin sinh học , các nhà phát triển thuốc đã phân loại các GPCRs theo trình tự các acid amin riêng lẻ của GPCRs Ở đây họ sử dụng phương pháp dùng các acid amin không tự nhiên [33] [34] [35]

Hình 5 : Phân loại GPCRs

Lớp A ( giống Rhodopsin), lớp B ( giống secretin), lớp C (giống thụ thể của glutamate), khác ( Adhesion (33), Frizzled (11), taste type 2 (25), chưa được phân lớp (23))

2.3.Vai trò sinh lý

Các thụ thể liên kết với protein G tiếp nhận nhiều loại tín hiệu sinh lý ở bên ngoài tế bào Các tín hiệu có thể là sự thay đổi ở nồng độ peptide, hormone, lipid, chất dẫn truyền thần kinh, ion, chất có mùi, chất có vị hoặc là các chùm photons đến mắt GPCR sau đó chuyển hóa các tín hiệu này vào bên trong tế bào và kích hoạt một chuỗi các phản ứng tương ứng có sự tham gia của nhiều protein, nucleotide hay ion kim loại, và cuối cùng dẫn đến một thông điệp hay

một phản ứng sinh lý tế bào thích ứng

Có rất nhiều các quá trình sinh lý ở tế bào động vật có vú cần các thụ thể 7TM Đồng thời chính những thụ thể này cũng là đích của một lượng lớn các hóa chất dược phẩm Trong bộ gene của người có khoảng 1000 gene mã hóa các loại thụ thể 7TM khác nhau và chúng liên quan đến quá trình cảm ứng với hàng loạt các kích thích đến từ môi trường ngoại bào Ví dụ các thụ thể adrenaline, thụ thể dopamine, thụ thể histamine, thụ thể ánh sáng rhodopsin

và rất nhiều thụ thể liên quan đến khứu giác và vị giác

Một số ví dụ về vai trò sinh lý của GPCR bao gồm:

Vai trò trong thị giác : các opsins sử dụng một phản ứng photoisomerization chuyển bức xạ ánh sáng thành tín hiệu điện để dấn truyền ở tế bàod Ví dụ: Rhodopsin sử dụng việc chuyển đổi 11-cis-retinal thành dạng trans để chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện

[1trang 439-447]

Khứu giác: các thụ thể của biểu mô khứu giác (thụ thể khứu giác) liên kết với các phân tử mùi và pheromone( kích thích tố ) (thụ thể vomeronasal)

Liên quan tới cảm xúc, tâm trạng: các thụ thể ở màng tế bào não liên kết với các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau, bao gồm serotonin, dopamine, GABA, và glutamate

Tham gia vào hoạt động miễn dịch và phản ứng viêm : các thụ thể chemokine liên kết phối tử là các chất dẫn truyền trung gian giữa các tế bào của hệ thống miễn dịch, các thụ thể như thụ thể histamin liên kết với phối tử gây viêm

Tham gia vào hệ thống dẫn truyền thần kinh chủ động : cả hai hệ thống thần kinh giao cảm và phó giao cảm được quy định bởi các GPCR , chịu trách nhiệm kiểm soát nhiều chức năng tự động của cơ thể như huyết áp, nhịp tim, và quá trình tiêu hóa

Cảm ứng mật độ tế bào: Một vai trò mới phát hiện của GPCR là trong việc điều chỉnh cảm ứng mật độ tế bào

Điều chỉnh cân bằng nội môi (ví dụ, cân bằng nước) [38]

Tham gia vào sự phát triển và di căn của một số loại ung thư [39]

2.4 Cấu trúc GPCR

GPCRs là các protein độc lập ở màng tế bào mà có bảy vực xuyên màng hình dạng trải dài hoặc dạng vòng xoắn Các phần ngoại bào của thụ thể có thể được glycosylated Các vòng ngoại bào chứa hai cysteine để hình thành liên kết disulfide để ổn định cấu trúc thụ thể Một số protein GPCRs xoắn bảy

màng tương tự (channelrhodopsin) có thể chứa các kênh ion trong protein của chúng

Có cấu trúc tương tự như GPCRs, các thụ thể adiponectin 1 và 2 (ADIPOR1

và ADIPOR2) cũng có 7 vực xuyên màng Tuy nhiên ADIPOR1 và ADIPOR2 là có hướng trái chiều với GPCRs trong màng tế bào (ví dụ, thụ thể

có đuôi NH2 ở trong tế bào chất , và ở phần ngoại bào thì đầu tận cùng là

nhóm carboxyl) và các thụ thể này không liên kết với protein G [40]

Mô hình cấu trúc đầu tiên của GPCRs người dựa trên sự tương đồng với rhodopsin của vi khuẩn ( sự tương đồng này là rất ít) , cấu trúc rhodopsin của

vi khuẩn được xác định bởi phương pháp nhiễu xạ điện từ (PDB 2BRD,

1AT9) [41] [42]và X quang dựa trên tinh thể (1AP9) [43]

Năm 2000, cấu trúc tinh thể đầu tiên của một GPCR động vật có vú, đó là bò

Rhodopsin (1F88), đã được tìm ra [44] Trong khi các tính năng chính và cấu

trúc 7 vực xoắn tương đồng thì hướng của 7 vòng xoắn khác biệt rất lớn với rhodopsin của vi khuẩn

Trong năm 2007,cấu trúc đầu tiên của một GPCR của con người đã được tìm

ra (2R4R, 2R4S) [45] Ngay sau đó là phát hiện ra cấu trúc có độ phân giải

cao hơn của receptor (2RH1) giống với 2 receptor (2R4R, 2R4S) vừa mới

phát hiện cấu trúc trước đó [46] [47] Cấu trúc thụ thể β2-adrenergic rất

giống với Rhodopsin bò về định hướng tương đối của các vòng xoắn bảy màng Tuy nhiên, cấu tạo của vòng thứ hai ở ngoại bào là hoàn toàn khác nhau giữa hai cấu trúc Từ vị trí vòng này thì vòng ngoại bào cấu tạo lên một cái “nắp” che phủ vị trí liên kết của GPCR với phối tử Sự khác biệt trong cấu trúc này làm nổi bật lên những khó khăn trong việc xây dựng mô hình cấu trúc tương đồng của GPCRs khác chỉ dựa trên cấu trúc Rhodopsin

Các cấu trúc của GPCR lúc bình thường và lúc liên kết với chất chủ GPCRs

cũng đã được xác định [48] [49] [50] [41] Những cấu trúc này cho thấy các

phối tử liên kết ở phía ngoại bào của một thụ thể sẽ dẫn đến những thay đổi cấu trúc ở phần nằm phía tế bào chất của các thụ thể Sự thay đổi lớn nhất khi

có phối tử liên kết là ở 2 xoắn 5 và 6 (TM5 và TM6) Cơ cấu kích hoạt quá trình sinh lý mà cụ thể là hoạt hóa protein G của thụ thể beta-2 adrenergic ở trạng thái Gs ( lúc đang có phối tử liên kết) đã khẳng định Gα liên kết với một

khoang được tạo ra bởi sự thay đổi cấu trúc của 2 xoắn 5 và 6 [52]

Hình 6: Cấu trúc βAR (GPCR)

Ở thể không hoạt động ở bên trái, cấu trúc βAR ở dạng hoạt động khi liên kết phối tử và protein G ở bên phải Khi có phối tử liên kết thì cấu trúc của thụ thể thay đổi nó mở ra giống như một bó hoa Ở hình phía dưới các

nguyên tử như những quả bóng nhỏ Phần thân nước có màu xanh sáng, còn phần kỵ nước có màu xanh đậm hơn Khi có hormone liên kết với GPCR thì phần kỵ nước sẽ mở ra tạo thành khoảng trống cho tiểu đơn vị α của protein G gắn vào

2.5 Tương quan giữa cấu trúc và chức năng

Hình 7: Chi tiết cấu tạo chung của GPCR ở 2 phía so với màng tế bào

Về cấu trúc, GPCRs có đặc điểm là có một đầu NH2 ở phía tận cùng ngoài tế bào, tiếp theo là bảy vực xuyên màng (7-TM) các chuỗi xoắn kiểu α (TM-1 tới TM-7) được kết nối bởi ba vòng phía bên trong tế bào (IL-1 để IL-3) và ba vòng ngoại bào (EL-1 tới EL-3), và đầu tần cùng trong nội bào là nhóm COOH

Các GPCR sắp xếp các phần của nó sao cho tạo cấu trúc giống như một chiếc thùng, với bảy vực xuyên màng tạo thành một khoang bên trong màng tế bào

để phối tử có thể liên kết ở trong khoang này và khoang thường được bao phủ bởi EL-2 Thay vì tương tác với các vòng ngoài tế bào, phối tử cũng có thể kết hợp ở những nơi khác, ví dụ như trường hợp của các phối tử cồng kềnh hơn (ví dụ, protein hoặc peptide lớn), liên kết với thụ thể glutamate Metabotropic của lớp C (mGluRs) ở vị trí là đuôi NH2 Các GPCRs ở lớp C được phân biệt với các GPCRs khác bởi đầu tận cùng NH2 rộng , điều này giúp cho các phối tử có thể liên kết tại vị trí này

Khi glutamate liên kết với một mGluR, đầu tận cùng NH2 phải trải qua một

sự thay đổi cấu trúc dẫn đến sự tương tác của nó sẽ làm thay đổi cấu trúc vòng ngoại bào ( EL 1, EL2, EL3) và các vực TM Hiệu quả cuối cùng của ba loại hoạt chất chủ vận( chất chủ vận, chất chủ vận ngược, chất đối kháng) gây ra một sự thay đổi trong định hướng tương đối của các xoắn TM (ví như một chuyển động xoắn) dẫn đến khoang thụ thể ở trong màng tế bào rộng lớn hơn

và chính sự thay đổi về hình dạng xoắn của các vực TM và các vòng ( EL1, EL2, EL3, IL1, IL2,IL3) sẽ báo hiệu chức năng dẫn truyền thông tin (ví dụ, tạo khớp nối với G-protein, qua đó kích hoạt protein G, và quá trình truyền tin bắt đầu xảy ra) Chất chủ vận ngược và chất đối kháng cũng có thể liên kết với một số địa điểm khác nhau của GPCR, nhưng hiệu quả cuối cùng cũng phải được ngăn ngừa TM xoắn theo định hướng này

Cấu trúc có nhóm NH2 và COOH ở tận cùng của GPCRs cũng có thể phục vụ các chức năng quan trọng ngoài việc liên kết với phối tử Đặc biệt, đầu -COOH tận cùng thường chứa serine (Ser) hoặc threonin (Thr), khi chúng bị phosphoryl hóa, sẽ gây tăng cường ái lực trên bề mặt thụ thể bên trong tế bào tạo điều kiện cho sự kết hợp với các protein khác được gọi là β-arrestins (β-

arr) [33] Một khi liên kết, β-arrestins sẽ thay đổi cấu trúc không gian gây ngăn chặn khớp nối với G-protein và có thể tuyển chọn các protein khác Phản ứng phosphoryl hóa các Ser và Thr thường xảy ra như một kết quả của việc GPCR bị kích hoạt, β-arr với việc làm cho GPCR tách ra khỏi protein G

và làm bất hoạt GPCR là cơ chế quan trọng của sự giải mẫn cảm [53]

qua một cơ chế là G-protein liên kết khớp vào GPCR Điều này có thể được thực hiện nhờ một yếu tố trao đổi guanine nucleotide (GEF) Miền gắn với protein G chủ yếu được hình thành bởi sự kết hợp của IL-2 và IL-3 cùng với tín hiện xoắn các vực TM khi GPCR liên kết với phối tử

Mô hình phức hệ ba thành phần

Ba thành phần đó là (17)

1 phối tử ngoại bào,

2 Sự thay đổi trạng thái của GPCR

3 G protein đóng vai trò hoạt hóa tín hiệu Các phối tử (có thể là hormone, chất truyền xung thần kinh, hợp chất có mùi v.v) bám lên phần ngoại bào của thụ thể trong khi đó G-protein liên kết với phần nội bào của thụ thể

Hình 9: Mô hình phức hệ ba thành phần

Bên trái: mô hình phức hệ ba thành phần [19] Một chu kỳ nhiệt động lực học

phức tạp mô tả sự hình thành liên kết của các phối tử (màu vàng), thụ thể (màu xanh) và G-protein (màu đỏ)

Bên phải: Cấu trúc tinh thể phức hệ 3 thành phần ở trạng thái liên kết với nhau Mô hình các vòng xoắn giống như dải duy băng được tạo lên bằng cách

căn cứ vào các tọa độ các phân tử từ tập tin 3sn6.pdb [21]bằng cách sử dụng phần mềm Molmol [22]

G thụ thể protein-coupled được kích hoạt bởi một tín hiệu từ bên ngoài (một phối tử ) Điều này tạo ra một sự thay đổi cấu trong các thụ thể, làm kích hoạt một loại protein G Hiệu quả sau khi phối tử kích hoạt GPCR phụ thuộc vào loại protein G mà GPCR đó gắn kết

3.1 Các phối tử

Phân tử tín hiệu ( phối tử) là những phân tử hóa học được tiết ra từ một tế bào

có khả năng khởi động một chuỗi phản ứng sinh học nội bào qua trung gian thụ thể Do vậy có thể xem nó như một phương tiện liên lạc của tế bào, được gọi là SM (signaling molecule) Các SM được tạo ra để tế bào kiểm soát hoạt động của chính nó (autocrine) hoặc lân cận (paracrine) hay phóng thích vào máu để đến kiểm soát hoạt động của tế bào khác (endocrine) Sự khác biệt cơ bản giữa các hình thức này là thời gian, paracrine và autocrine cho đáp ứng tức thì, còn endocrine cho đáp ứng sinh học chậm hơn nhiều

Có thể xem đây như một ligand Có 2 đặc tính cơ bản sau: [59]

- Các ligand có thể gắn kết với nhiều loại thụ thể khác nhau để sinh ra các đáp ứng thuộc các loại khác nhau Ví dụ: SM như NE

có thể gắn với thụ thể α1 để thực hiện phương thức cận tiết hoặc α2 để thực hiện phương thức tự tiết

- Nhiều ligand có thể gắn kết với cùng một loại thụ thể để sinh ra các đáp ứng giống nhau Ví dụ ligand gắn vào thụ thể α1, ET (thụ thể endothelin) và AT1 (thụ thể của angiotensin II) đều hoạt hóa PLC (Phospholipase C) qua protein Gq rồi biến đổi PIP (phosphatidyl inositol biphosphate thành phosphatidyl inositol triphosphate (PI3) một mặt giải phóng Ca2+ ở lưới nội bào, mặc khác hoạt hóa PKC (phospho kinase C) phosphoryl hóa kênh calcium loại L làm mở kênh này

Ngoài ra còn một hình thức khác trong phân loại về sự tương quan giữa các phân tử tín hiệu và cơ quan đích được làm rõ qua ví dụ sau Ở dạ dày, gastrin được phóng thích vào máu hoạt hóa tế bào ECL (enterochromaphil-like cell) tiết ra histamine, sau đó histamine kích thích bơm proton ở thành tế bào phóng thích ion H+, như thế sự liên lạc giữa tế bào G với tế bào ECL là endocrine trong khi ECL với tế bào thành là paracrine

GPCRs gồm có các thụ thể với phối tử trung gian là các tín hiệu giác quan (ví

dụ, các phân tử kích thích ánh sáng và khứu giác), adenosine, bombesin, bradykinin, endothelin, axit γ-aminobutyric (GABA), yếu tố tăng trưởng tế bào gan (HGF), melanocortins, neuropeptide Y, peptide opioid, opsins, somatostatin, GH, tachykinins, các thành viên của gia đình peptide ruột non

có tác dụng vận mạch, và vasopressin, các amin sinh hóa (ví dụ, dopamine, epinephrine, norepinephrine, histamine, glutamate (tác dụng metabotropic), glucagon, acetylcholine (tác dụng muscarinic), và serotonin); chemokine; các lipid trung gian của quá trình viêm (ví dụ, prostaglandin, prostanoids, yếu tố kích hoạt tiểu cầu, và leukotrienes) và hormon peptide (ví dụ, calcitonin, C5a anaphylatoxin, hormone kích thích nang trứng (FSH), gonadotropin-releasing

hormone (GnRH), neurokinin, thyrotropin -releasing hormone (TRH), cannabinoids , và oxytocin)

Ngoài ra còn có GPCRs mà bị kích hoạt động bởi tác nhân kích thích chưa được xác định được gọi là thụ thể mồ côi

Trong khi đó, trong các loại của các thụ thể đã được nghiên cứu, phối tử liên kết với GPCRs từ bên ngoài màng tế bào Các phối tử của GPCRs thường liên kết trong với các vực xuyên màng (TM) Tuy nhiên, các thụ thể kích hoạt bởi protease thì được kích hoạt bởi sự phân tách một phần của miền ngoại bào

của GPCR( EL1, EL2, EL3) [54]

3.2 Sự thay đổi trạng thái của GPCR

Việc dẫn truyền các tín hiệu thông qua các màng tế bào bởi các thụ thể trước khi giải Nobel Hóa học 2012 công bố thì vẫn chưa hoàn toàn hiểu rõ 2 nhà khoa học nhận giải Nobel 2012 đã giải thích được cơ chế truyền tin của GPCR là sự thay đổi cấu trúc dị lập thể Khi các GPCR ở trạng thái hoạt động thì chúng sẽ liên kết với các protein G không hoạt động Một khi các phối tử liên kết với thụ thể , GPCR sẽ thay đổi hình dạng, do đó kích hoạt các protein G, protein G sau khi bị kích hoạt sẽ tách ra từ các thụ thể Các thụ thể thể bây giờ có thể hoặc kích hoạt một protein G khác hoặc chuyển trở lại trạng thái ban đầu của nó

Một phân tử thụ thể tồn tại trong một trạng thái cân bằng cấu dạng ( conformational ) giữa các trạng thái sinh học hoạt động và không hoạt động

[55]Liên kết của các phối tử với các thụ thể có thể thay đổi sự cân bằng đối

với các trạng thái này [56].Ba loại phối tử tồn tại: chất chủ vận là phối tử mà

làm thay đổi sự cân bằng của thụ thể sang trạng thái hoạt động, chất chủ vận nghịch đảo là phối tử mà thay đổi sự cân bằng của thụ thể sang trạng thái

không hoạt động và chất đối kháng trung tính là phối tử mà không ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng

Cơ chế conformational-coupling (sự gắn kết có biến đổi cấu dạng)

Thông tin có thể được chuyển từ một nguyên tố tín hiệu đến một nguyên tố tín hiệu tiếp theo nhờ vào quá trình conformational – coupling Nếu những thành phần thường là protein này đã liên kết với thành phần khác thì cơ chế truyền tin sẽ xảy ra rất nhanh Một ví dụ kinh điển cho cơ chế conformational – coupling là sự

co giãn cơ bám xương – nơi mà kênh Ca tuýp L sẵn sàng nối kết với thụ thể ryanodine ( RYR1) Một ví dụ khác là sự kết hợp giữa kệnh Ca 2+ phụ thuộc điện thế với protein để đáp ứng với hiện tượng xuất bào các túi synaptic

Sự conformational – coupling cũng được dùng khi thông tin được chuyển đi bởi sự khuyếch tán của các nguyên tố tín hiệu Những phân tử truyền tin thứ hai có khối lượng phân tử thấp (Ca

2+

, AMPc, GMPc, và Ros) hoặc các protein như ERK ½ hay nhiều yếu tố phiên mã được hoạt hóa khác di chuyển từ tế bào chất vào nhân mang theo thông tin trong suốt quá trình di chuyển trong tế bào chất của chúng Trong quá trình chuyển giao thông tin này, những nguyên tố có khả năng khuếch tán này sử dụng cơ chế conformational – coupling để truyền thông tin khi nó gắn vào cac yếu thố thuận dòng khác

Hình 10: Mô hình mô tả sự biến đổi trạng thái cân bằng cấu dạng

3.3 Trình tự các sự kiện xảy ra khi hormone kích hoạt tín hiệu cAMP:

- Lúc đầu, tiểu đơn vị α của G-protein nối kết với GDP và ba tiểu đơn vị α,β

và γ thống nhất với nhau và 2 tiểu đơn vị β và γ ức chế Gα

- Khi hormone bám dính vào thụ thể GPCR, sẽ có một sự biến đổi lập thể xảy

ra và thông tin sẽ truyền tới G-protein Vùng kết nối nucleotide binding site) ở tiểu đơn vị α trở nên nhạy cảm hơn với bào tương và vì nồng

(nucleotide-độ GTP của bào tương tao hơn hẳn GDP nên nó giải phóng GDP để nối kết với GTP Quá trình này gọi là GDP-GTP exchange

- Sự thay đổi diễn ra ở trên dẫn đến sự biến đổi cấu trúc của Gα và nó rời phức hợp αβγ để liên kết với Adenylate cyclase

- Adenylate cyclase được hoạt hóa bởi Gα-GTP sau đó thực hiện phản ứng tổng hợp thủy phân để tạo ra cAMP

- Protein kinase A (cAMP-Dependent protein kinase) thủy phân và chuyển nhóm phosphate của ATP đến nhóm serine hoặc nhóm threonine của một vài protein nội bào và kích hoạt hoạt động của chúng

3.4 Sự ngắt tín hiệu (turn off of the signal) và sự khuếch đại tín hiệu (signal amplification) :

 Sự ngắt tín hiệu

- Gα thủy phân GTP thành GDP và Pi (GTPase) Sự tồn tại của GDP trên Gα khiến nó tái nối kết với tiểu phân βγ và bất hoạt do vậy adenylate cyclase không còn hoạt động nữa

- Phosphodiesterase thủy phân cAMP thành AMP

- Thụ thể tê liệt (receptor desensitization) biến đổi cấu trúc khác với cấu hình của hormone Trong một số trường hợp, receptor hoạt hóa được phosphoryl hóa thông qua G-protein receptor kinase Thụ thể được phosphoryl hóa sẽ nối

kết với β-arrestin Sau đó, β-arrestn điều hành quá trình loại bỏ receptor từ màng tế bào vào bào tương bởi hiện tượng nhập bào nhờ tác động gián tiếp của clathrin (clathrin-mediated) β-arrestin cũng nối kết với phosphodiesterase nội bào, mang enzyme này đến gần nơi sản xuất cAMP, góp phần làm ngưng dòng phân tử tín hiệu

- Protein phosphatase thủy phân loại nhóm phosphate của nó (trước đó nó được phosphate hóa bởi protein kinase A)

 Sự khuếch đại tín hiệu

Là một công đoạn rất quan trọng trong dòng thác tín hiệu Cụ thể:

- Một phân tử hormone có thể dẫn đến quá trình tạo thành nhiều phân

Hình 11: Mô tả sự ADP-ribosyl hóa

Phức hợp Gβγ được giải phóng khi Gα nối kết với GTP dẫn đến việc hoạt hóa hay ức chế một vài loại protein khác Ví dụ, Gβγ ức chế một vài thể đồng phân của adenylate cyclase (isoform) góp phần ngắt dòng tín hiệu vào tế bào, ngưng biểu hiện enzyme

Độc tố tả (cholera toxin) xúc tác đồng hóa trị sự biến thể của Gsα ribose được chuyển từ NAD+ thành arginine tại vùng hoạt động của GTPase

ADP-của Gsα Sự ADP-ribosyl hóa ngăn sự thủy phân ADP-của GTP (prevents GTP hydrolysis) bởi Gsα Do vậy stimulatory G-protein được hoạt hóa lâu dài Pertussis toxin (whooping cough disease) xúc tác sự ADP-ribosyl tại cysteine của Giα làm nó không thể chuyển GDP thành GTP Con đường inhibitory bị khóa (The inhibitory pathway is blocked)

Sự ADP-ribosyl là cơ chế chung để điều hòa hoạt động của protein, từ sinh vật nhân sơ (prokaryotes) đến sinh vật nhân thực (eukaryotes), kể cả động vật

có vú

3.5 Sự xáo trộn của chu trình G-Protein

 [59]

Chu trình của G-protein có thể bị xáo trộn bởi những con đường sau:

1 Sự đảo của chu trình dựa vào sự thủy phân của γ-phosphate của GTP Điều này xảy ra khi một dẫn xuất của GTP nối kết vào thụ thể nhưng không có khả năng thủy phân hay thủy phân chậm nối kết với tiểu đơn vị Ví dụ, 5′-guanylylimidophosphate (Gpp(NH)-p) hay guanosine 5′-O-(3-thiotriphosphate) (GTPγS),hay thêm vào AlF4, tạo các triphosphate giả (pseudo phosphate) trên GDP trong Gα-

GDP Trong những điều kiện này, sự hoạt hóa các chất tác hiệu trở thành không thuận nghịch Thụ thể được kích hoạt sẽ xúc tác chu trình G-protein, về bản chất cũng giống như khi có ligand kết nối nhưng chậm hơn từ 100 đến 1000 lần Khi thiếu sự kích hoạt thụ thể bởi ligand, chu trình cơ bản chậm sẽ xảy ra Nguyên nhân có thể là vì phần nhỏ của thụ thể hiện diện trong thể hoạt động ngay cả khi thiếu ligand Kết quả là, sự thay đổi Gpp(NH)-p hay GTPγS bởi GTP hay sự có mặt của AlF4 đóng vai trò tạo ra các đáp ứng tác hiệu (effector response)

trong khi thiếu ligand thụ thể Tuy vậy, sự kích hoạt vẫn chậm hơn khi

có sự hiện diện của ligand

Hình 12: Minh họa một số cấu trúc

[59]

2 Chu trình có thể chậm lại khi thêm vào những GDP dư thừa hay, guanosine 5′-O-(2-thiodiphosphate) (GDPβS) – một dẫn xuất ổn định hơn Không giống GTPγS, GDPβS có liên kết thuận nghịch nên nó chỉ cạnh tranh với GTP Do vậy nó sẽ chỉ hoạt động ở nồng độ cao hơn tiêu chuẩn từ 10 lần trở lên

3.Khi có sự hiện diện của NAD+, tiểu đơn vị α của G-protein có thể bị ADP-ribosylated bởi 2 loại Protein vi khuẩn Độc tố của vi khuẩn Ho

gà (whooping-cough) (PTx) ADP-ribosylates cysteine ở đầu C tận của G-protein của nhóm Gi và Go ngăn cản sự bắt gặp của G-protein thụ