Thu nhận enzym protease từ vi sinh vật và ứng dụng trong lên men nước mắm ngắn ngày

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ MỸ PHƢƠNG THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN NƢỚC MẮM NGẮN NGÀY Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60 42 301 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Đồng Thị Thanh Thu Thành phố Hồ Chí Minh- 2011 Trang ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục từ viết tắt trong luận văn v Danh mục các bảng vii Danh mục đồ thị viii Danh mục biểu đồ viii Danh mục hình và sơ đồ ix Mở đầu x Chương 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.TỔNG QUAN VỀ NƢỚC MẮM VÀ PHƢƠNG PHÁP SẢN XUẤT NƢỚC MẮM 1.1.1. Giới thiệu 1 1.1.2. Nguồn gốc 1 1.1.3.Giá trị dinh dưỡng và thành phần hóa học của nước mắm 2 1.1.4. Nguyên lý chung của quá trình sản xuất nước mắm 3 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chế biến nước mắm 4 1.1.6. Nguồn nguyên liệu sản xuất nước mắm 5 1.1.7. Các phương pháp sản xuất nước mắm 7 1.1.8. Các nghiên cứu và cải tiến trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 13 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE: 1.2.1. Định nghĩa 17 Trang iii 1.2.2. Phân loại protease 17 1.2.3. Nguồn thu nhận enzym protease 20 1.2.4.Ứng dụng của enzym protease 28 1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP THỦY PHÂN PROTEIN 1.3.1. Phương pháp hóa học 32 1.3.2. Phương pháp sinh học 34 Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU: 2.1.1. Nguồn thu nhận enzym protease 37 2.1.2. Nguyên liệu cá để sản xuất nước mắm 37 2.1.3 Môi trường 37 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Phương pháp cấy chuyền giữ giống và nuôi cấy bề mặt Aspergillus oryzae thu nhận enzym protease 38 2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu protease 39 2.2.3. Phương pháp lên men nước mắm sử dụng trong nghiên cứu 41 2.2.4. Phương pháp xác định ảnh hưởng của tỷ lệ CPE ứng dụng trong quá trình chế biến nước mắm 42 2.2.5.Các phương pháp phân tích 43 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu 49 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ ẨM CỦA CANH TRƢỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC Asp. Oryzae 05 CANH TRƢỜNG NUÔI CẤY Bac. Subtilis 50 3.2. XÁC ĐỊNH HIỆU SUẤT THU NHẬN CPE PROTEASE TỪ CANH TRƢỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE CỦA CPE 50 3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA pH ĐỐI VỚI HOẠT ĐỘ CỦA CPE PROTEASE 51 Trang iv 3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐỐI VỚI HOẠT ĐỘ CỦA CPE PROTEASE 53 3.5. NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CÁ PHÈN BẰNG CPE A VÀ CPE B TRONG LÊN MEN NƢỚC MẮM 3.5.1. Ảnh hưởng kích thước cá phèn đối với quá trình lên men nước mắm 56 3.5.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ CPE A/NL đối với quá trình lên men nước mắm 61 3.5.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ CPE B/ NL đối với quá trình lên men nước mắm 67 3.5.4. Thử nghiệm lên men nước mắm với CPE A và CPE B 74 Chương 4- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 Chương 5- PHỤ LỤC 85 Trang vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang 1 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loài cá nước ngọt 6 2 Bảng 1.2. Thành phần hóa học một số loài cá biển 6 3 Bảng 1.3. Tính chất của proteinase kiềm và trung tính 25 4 Bảng 1.4. Tính chất proteinase từ nấm sợi 26 5 Bảng 1.5. Các các chế phẩm protease vi sinh vật và hãng sản xuất 27 6 Bảng 1.6. Danh sách enzym protease của Novozyme được sản xuất bởi các vi sinh vật biến đổi gen. 28 7 Bảng 3.1. Độ ẩm canh trường nuôi cấy Asp. oryzae và Bac.subtilis 50 8 Bảng 3.2. Hoạt độ và hiệu suất thu nhân CPE từ canh trường Asp. oryzae và Bac.subtilis bằng tác nhân tủa ethanol 96 o và muối tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 50 9 Bảng 3.3. Ảnh hưởng pH đối với hoạt độ của CPE A và CPE B 51 10 Bảng 3.4. Ảnh hưởng nhiệt độ đối với hoạt độ của CPE A và CPE B 53 11 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kích thước cá phèn tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu ĐCN và ĐC 57 12 Bảng 3.6. Ảnh hưởng kích thước cá phèn tới sự thay đổi hàm lượng N T , N NH3 và N aa của các mẫu ĐCN và ĐC 57 13 Bảng 3.7. Ảnh hưởng tới tỉ lệ CPE A/NL sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu. 61 14 Bảng 3.8.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N T (g/lít) của các mẫu . 62 15 Bảng 3.9.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N NH3 (g/lít) của các mẫu 63 Trang viii 16 Bảng 3.10.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N aa (g/lít) của các mẫu 64 17 Bảng 3.11. Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/ NL tới sự thay đổi trạng thái cảm quan của các mẫu 67 18 Bảng 3.12.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/ NL tới sự thay đổi hàm lượng N T (g/lít) của các mẫu 69 19 Bảng 3.13.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/NL tới sự thay đổi hàm lượng N NH3 (g/lít) của các mẫu 70 20 Bảng 3.14.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/ NL tới sự thay đổi hàm lượng N aa (g/lít) của các mẫu 71 21 Bảng 3.15. So sánh kết quả lên men nước mắm với CPE A, CPE B 75 22 Bảng 3.16 . Thành phần acid amin trong nước mắm cá phèn được lên men với CPE A và CPE B 77 DANH MỤC ĐỒ THỊ STT TÊN ĐỒ THỊ Trang 1 Đồ thị 3.1: Ảnh hưởng pH đối với hoạt độ CPE A và CPE B. 52 2 Đồ thị 3.2.Ảnh hưởng kích thước cá phèn tới sự thay đổi hàm lượng N T của các mẫu ĐCN và ĐC. 58 3 Đồ thị 3.3.Ảnh hưởng kích thước cá phèn tới sự thay đổi hàm lượng N NH3 của các mẫu ĐCN và ĐC. 58 4 Đồ thị 3.4.Ảnh hưởng kích thước cá phèn tới sự thay đổi hàm lượng N aa của các mẫu ĐCN và ĐC. 59 5 Đồ thị 3.5.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N T (g/lít) 63 6 Đồ thị 3.6.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N NH3 (g/lít) 64 7 Đồ thị 3.7.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE A/NL tới sự thay đổi hàm lượng N aa (g/lít) 65 Trang ix 8 Đồ thị 3.8.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/NL tới sự thay đổi hàm lượng N T (g/lít) 70 9 Đồ thị 3.9.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/ NL tới sự thay đổi hàm lượng N NH3 (g/lít) 71 10 Đồ thị 3.10.Ảnh hưởng tỉ lệ CPE B/ NL tới sự thay đổi hàm lượng N aa (g/lít) 72 DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT TÊN BIỂU ĐỒ Trang 1 Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của CPE Asp. oryzae 54 2 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của CPE Bac. subtilis 55 DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ STT TÊN HÌNH, SƠ ĐỒ Trang 1 Hình 1.1: Cá phèn một sọc (Upeneus mollucensis) 7 2 Sơ đồ 1.1. Quy trình sản xuất nước mắm truyền thống 8 3 Sơ đồ 1.2. Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin 4 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 38 5 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ nghiên cứu protease 39 Trang v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN CPE: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease vi sinh vật ra khỏi dịch chiết enzym và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CPE A: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Asp. oryzae ra khỏi dịch chiết enzym và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CPE.AE: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Asp. oryzae ra khỏi dịch chiết enzym bằng tác nhân tủa là ethanol 96 o và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CPE.AM: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Asp. oryzae ra khỏi dịch chiết enzym bằng tác nhân tủa là (NH 4 ) 2 SO 4 và đã được sấy khô và xay thành bột mịn CPE B: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Bac.subtilis ra khỏi dịch chiết enzym và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CPE.BE: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Bac.subtilisra khỏi dịch chiết enzym bằng tác nhân tủa là ethanol 96 o và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CPE.BM: chế phẩm enzym là chế phẩm thu được từ quá trình kết tủa protease Bac.subtilis ra khỏi dịch chiết enzym bằng tác nhân tủa là (NH 4 ) 2 SO 4 và đã được sấy khô và xay thành bột mịn. CT: Canh trường nuôi cấy vi sinh vật. ddA: dịch chiết enzym từ canh trường nuôi cấy Asp. oryzae ddB: dịch chiết enzym từ canh trường nuôi cấy Bac.subtilis ddE: dịch chiết enzym ĐC: mẫu đối chứng. ĐCN: mẫu đối chứng nguyên, là mẫu lên men nước mắm không sử dụng chế phẩm enzym và nguyên liệu cá không bị cắt nhỏ. Trang vi KC: kiểm chứng NL: nguyên liệu N aa : Nitơ acid amin. N F : Nitơ formol N NH3 : Nitơ NH 3 N T : Nitơ tổng số pH opt : pH tối ưu t opt : nhiệt độ tối ưu TB: trung bình TN: thí nghiệm V: thể tích VSV: vi sinh vật Trang x MỞ ĐẦU Protease là nhóm enzym được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: Công nghiệp nhẹ, công nghiệp da, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… Đặc biệt, nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng protease trong chế biến thủy sản nhằm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Trong chế biến thuỷ sản, protease được sử dụng trong công nghiệp sản xuất nước mắm để rút ngắn thời gian chế biến. Cá Phèn là một nguồn cá tạp có giá trị kinh tế thấp, được sử dụng làm thức ăn gia súc. Việc sử dụng cá phèn làm nước mắm sẽ giúp tăng giá trị kinh tế cho nguồn cá tạp là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa học Việt Nam quan tâm. Vì vậy, đề tài “Thu nhận enzym protease từ vi sinh vật và ứng dụng trong lên men nước mắm ngắn ngày” là cần thiết, góp phần ứng dụng những ưu thế của công nghệ sinh học để hoàn thiện công nghệ sản xuất nước mắm. * Mục đích của luận văn: Thu nhận protease từ canh trường nuôi Asp. oryzae và Bac.subtilis. Sau đó ứng dụng protease này vào trong quá trình lên men nước mắm ngắn ngày từ cá phèn. * Nội dung nghiên cứu: - Thu nhận chế phẩm enzym protease từ canh trường Asp. oryzae và Bac.subtilis, xác định điều kiện thích hợp cho chế phẩm enzym protease. - Ứng dụng chế phẩm enzym protease vào quá trình lên men nước mắm cá phèn để rút ngắn thời gian lên men. [...]... nghiệp và trong y học Protease từ vi sinh vật có những ưu điểm: Hoạt động được trong khoảng pH khá rộng, chúng tổng hợp được cả hai loại enzym endo và exo-peptidase, do vậy thủy phân được đến 80% liên kết peptit của protein Thu nhận protease từ vi sinh vật có nhiều điểm ưu vi t hơn so với thu nhận từ động vật và thực vật: -Hoạt tính enzym vi sinh vật cao - Vi sinh vật sinh sản, phát triển và tổng hợp enzym. .. rút ngắn thời gian thủy phân thịt cá trong chế biến nước mắm từ cá cơm, nước mắm cao đạm sản xuất bằng protease Bac.subtilis có hàm lượng và thành phân acid amin cao hơn nước mắm cốt sản xuất theo phương pháp truyền thống.[1] Lê Văn Vi t Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006) đã nghiên cứu đặc tính của enzym protease từ Asp Oryzae và ứng dụng vào quá trình lên men nước mắm đã kết luận: hàm lượng enzym protease. .. nhưng chưa vì thế mà kết luận nước mắm Vi t Nam có nguồn gốc từ các loại nước chấm đó, vì nó có các điểm khác nhau: - Nước chấm Nhật Bản shogu có nguyên liệu là thực vật và sử dụng enzym của nấm mốc để chuyển hóa, nước mắm Vi t Nam có nguyên liệu là động vật và sử dụng enzym tiêu hóa và enzym của hệ vi sinh vật có trong nội tạng cá thủy phân dần dần - Nước chấm sản xuất từ cá của người cổ Hi Lạp có... đường, malic acid, protease, diatase, esterase, lipase, catalase và peroxidase Người ta nhận thấy hoạt tính của enzym ficin cao khi nhựa được thu nhận vào buổi sáng sớm do đó để thu enzym Ficin nhựa sung cần được thu vào sáng sớm, sấy khô để dùng trong công nghiệp thực phẩm Ficin có thể được thu nhận từ lá, quả xanh và từ nhựa thân Tùy thu c vào nguồn thu nhận enzym ficin mà các tính chất vật lý của chúng... cứu thu nhận chế phẩm enzym protease từ ruột cá ba sa (Pangasius bocourti) [11], từ đầu tôm càng xanh (Macrobrachim Rosenbegii) [21] 1.2.3.3 Từ vi sinh vật: [12,25] Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease Các enzym này có thể ở trong tế bào hoặc tiết ra môi trường nuôi cấy Một số protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong. .. trong thời gian ngắn ở đầu thời kỳ của quá trình thủy phân Loại enzym này đóng vai trò thứ yếu trong quá trình sản xuất nước mắm 1.2.3 Nguồn thu nhận enzym protease [8,12,25] Hiện nay người ta thu nhận và khai thác enzym protease từ 3 nguồn khác nhau: 1.2.3.1 Từ thực vật: [12] a/ Bromelin (E.C.3.4.4.24) thu nhận từ cây dứa (Ananas comusus):[12] Bromelin là tên gọi chung của nhóm enzym thực vật chứa nhóm... 3,5 – 5,5 5,0 3,5 – 4,5 3,0 2,9 – 3,3 5,6 3,0 – 5,0 3,8 – 6,5 3,0 – 6,0 Các protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu từ năm 1960 Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong thực tế Có rất nhiều chế phẩm protease từ vi sinh vật được sản xuất trên thế giới được trình bày ở bảng 1.5: ... nước mắm gồm 2 giai đoạn: - Chuyển hóa protein thành acid amin: đây là quá trình chính trong sản xuất nước mắm protease protease Protein poly peptid protease peptid acid amin Quá trình này xảy ra nhờ enzym protease của vi sinh vật và protease có trong tụy tạng của cá Trong điều kiện tự nhiên quá trình này gồm 2 giai đoạn: + Giai đoạn I: từ khi bắt đầu ướp cá đến tháng thứ 3 Trong giai đoạn này hệ enzym. .. protease hoặc các vi sinh vật tổng hợp enzym protease ngoại bào để rút ngắn thời gian thủy phân cá, nâng cao hiệu suất thủy phân thu hồi đạm trong nguyên liệu thủy phân Đã có nhiều loại enzym protease được ứng dụng trong chế biến nước mắm: papain, bromelin, protease từ nấm mốc Asp Oryzae, vi khuẩn Bacillus subtilis Theo hướng này đã có nhiều công trình của các tác giả trong nước và ngoài nước Nguyễn Lân Dũng,... quá trình thủy phân càng mạnh mẽ và hàm lượng acid amin càng cao.[19] Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 16 Ngoài các công trình công bố trong nước, còn nhiều tác giả nước ngoài đã nghiên cứu ứng dụng chế phẩm protease và vi sinh vật trong sản xuất nước mắm và nước chấm Ravipim- Chaveesuk và các cộng sự (1993) đã nghiên cứu ảnh hưởng khi thêm chế phẩm hỗn hợp trypsin và chimotrypsin với lượng là 0,3% . Thu nhận enzym protease từ vi sinh vật và ứng dụng trong lên men nước mắm ngắn ngày là cần thiết, góp phần ứng dụng những ưu thế của công nghệ sinh học để hoàn thiện công nghệ sản xuất nước. THỊ MỸ PHƢƠNG THU NHẬN ENZYM PROTEASE TỪ VI SINH VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG LÊN MEN NƢỚC MẮM NGẮN NGÀY Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 60 42 301 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG. xuất nước mắm. * Mục đích của luận văn: Thu nhận protease từ canh trường nuôi Asp. oryzae và Bac.subtilis. Sau đó ứng dụng protease này vào trong quá trình lên men nước mắm ngắn ngày từ cá phèn.