Trên cơ sở khoa học và các thực nghiệm đã được tiến hành, phân tích khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen (đv, TV và VSV) sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi

Nội dung I Mở đầu II Cơ sở khoa học việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật người vật nuôi Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) 1.1: Khái niệm 1.2: Lịch sử phát chuyển gen ngang Cơ chế HGT 2.1: Biến nạp 2.2: Tải nạp 2.3: Tiếp hợp Bằng chứng chứng minh HGT xảy tự nhiên III Khả chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển gen vào hệ vi sinh người đông vật DNA tái tổ hợp Nguy việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO sang hệ vi sinh người động vật Các rào cản trình chuyển đoạn DNA tái tổ hợp vào hệ vi sinh vật người động vật Phương pháp để phát đọan DNA tái tổ hợp chuyển nạp thành công vào vi sinh vật Ví dụ kiểm tra khả chuyển gene ngang IV Kết luận I Mở đầu Như biết, dân số giới ngày tăng, diện tích đất lại ngày giảm, bệnh tật ngày nhiều phong phú hơn… Bởi vậy, người phải đối mặt với nhiều vấn đề cấp bách : an ninh lương thực-thực phẩm, bệnh tật, nguyên-nhiên liệu… Để giải vấn đề này, khoa học-kỹ thuật ngày phát triển, đặc biệt, kỷ XXI, kỷ công nghệ sinh học hiên đại Ngày nay, công nghệ sinh học ứng dụng vào nhiều lĩnh vực sống: công nghiệp, nông nghiệp, y học Bằng kiến thức sinh học thực vật, động vật, nấm, vi khuẩn, sử dụng "công nghệ DNA tái tổ hợp" nhà khoa học cố gắng tạo trồng, vật ni có suất, chất lượng cao, loại thực phẩm, dược phẩm phục vụ cho việc chữa bệnh cho người Công nghệ DNA tái tổ hợp đáp ứng nhiều nhu cầu nhân loại, đến nhiều điều chưa chắn chắn nguy mà đem lại, đặc biệt tượng chuyển gen ngang Nhưng mặt khác, chưa có thí nghiệm cụ thể việc chuyển gen ngang từ sinh vật biến đổi gen (GMO) sang hệ vi sinh người động vật, GMO đánh giá an toàn Trong báo cáo tổng kết 10 năm nghiên cứu an toàn sinh học trồng CNSH EU kết luận: Các loại trồng sản phẩm công nghệ sinh học chí cịn an tồn so với trồng sản phẩm tạo phương pháp truyền thống thông thường GMO tổ chức Hội đồng khoa học quốc tế (ICSU) Tổ chức Y tế giới (WHO) thường xuyên giám sát kiểm chứng Khoa học gắn liền với thực tiễn, nguy ln bắt đầu tự nhiên, tượng chuyển gen ngang Người ta suy nghĩ đến vấn đề thực tế, tượng chuyển gen ngang xảy nhiều Vậy, lý từ đâu mà nhà khoa học cho rằng, cơng nghệ DNA tái tổ hợp an toàn chuyển gen ngang từ GMO sang hệ vi sinh người động vât, phần đây, nhóm xin phép tìm hiểu vấn đề II Cơ sở khoa học việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật người vật ni Đây ngun nhân bắt nguồn cho việc nghi ngờ DNA tái tổ hợp có khả chuyển từ GMO sang hệ vi sinh vật người động vật Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) 1.1: Khái niệm Chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) hay trao đổi gen theo hàng ngang chuyển gen sinh vật họ hàng không thông qua giao phối Trao đổi gen hàng ngang khác với trao đổi gen hàng dọc (vertical gene transfer), tức tiếp nhận gen từ hệ cha mẹ (hay gọi di truyền) Chuyển gen ngang phổ biến loài vi sinh vật HGT chứng minh yếu tố quan trọng phát triển nhiều sinh vật, đặc biệt vi khuẩn Chúng có khả tiếp nhận gen từ sinh vật khác để thích nghi với mơi trường thay đổi nhanh chóng xung quanh Sự thay đổi nhanh chóng vi khuẩn tạo cho chúng khả gây bệnh mới, tái phát bệnh cũ 1.2 Lịch sử phát chuyển gene ngang Chuyển gen ngang mô tả Seattle vào năm 1951: chuyển giao gen virus vào Corynebacterium diphtheriae tạo mối nguy hiểm từ chủng không độc hại Chuyển gen vi khuẩn mô tả lần Nhật Bản năm 1959 công bố chứng minh việc chuyển gen kháng kháng sinh loài vi khuẩn vi khuẩn Vào năm 1980, Syvanen dự đốn chuyển gen ngang tồn tại, có ý nghĩa sinh học, tham gia vào việc định hình lịch sử tiến hóa từ bắt đầu sống Trái đất Như Jain, Rivera and Lake (1999) nói: "Ngày có nhiều nghiên cứu gen chúng chuyển gene ngang xảy đáng kể prokaryote" (Lake Rivera, 2007) Có số chứng cho thấy thực vật động vật bậc cao bị ảnh hưởng điều dấy lên lo ngại an toàn (Richardson Palmer (2007)) Do số lượng ngày tăng chứng cho thấy tầm quan trọng tượng tiến hóa Peter Gogarten mơ tả chuyển gen ngang "một mơ hình cho Sinh học" -> Q trình mối nguy hiểm tiềm ẩn kỹ thuật di truyền cho phép chuyển gen DNA để lây lan từ loài sang loài khác Cơ chế HGT Trong tự nhiên, HGT xảy theo chế chính: Biến nạp, tải nạp tiếp hợp a) Biến nạp Biến nạp tượng tiếp nhận DNA từ bên vào tế bào vi khuẩn Từ nghiên cứu Griffiths Avery tế bào vi khuẩn phải trạng thái sinh lý đặc biệt có khả hấp thu DNA, “trạng thái khả nạp” Khả nạp tự nhiên khả hấp thu DNA tự nhiên có sẵn mơi trường sống Nguồn DNA có từ tế bào chết hay tế bào bị phân hủy Kết thu vi khuẩn thể vài tính trạng mới, tính trạng ổn định có khả di truyền Trong tự nhiên, nồng độ chất dinh dưỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hưởng đến sống vi khuẩn, lúc tế bào bị thay đổi cấu trúc đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến hình thành kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA theo kênh vào nhờ việc tiếp xúc với màng nhận hỗ trợ hệ thống vận chuyển bên tế bào Hệ thống vận chuyển hình thành sở enzym gây biến tính số protein màng + Enzym ComC có chất peptidase phân cắt protein ComG màng tế bào làm cho khơng cịn tính trọn vẹn protein màng, từ chúng hoạt hố Có protein dạng với ComG, tất chúng tạo cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA + ComEA thể nhận để DNA vào tế bào + ComEC tạo kênh vận chuyển dạng dịch qua DNA vào tế bào + ComFA dạng helycase có chức phối hợp với ComEA ComEC để đưa sợi DNA mạch đơn vào tế bào Trong trình chuyển nạp, sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl ComEA phân thành đoạn tác động endonuclease (hiện xác định NucA), phần đầu cuối cắt đưa tới ComEC ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào Sự phiên mã gen “late competence” mã hoá cho máy gắn kết hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) yếu tố cần cho tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi yếu tố có khả kích hoạt phiên mã ComK yếu tố hoạt hoá phiên mã Sự biểu ComK quy định mạng lưới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR MecAB ComK điều hoà âm bám vào AbrB CodY, hoạt hoá dương AbrB, sinR, DegU b) Tải nạp Tải nạp q trình DNA vi khuẩn chuyển từ vi khuẩn sang vi khuẩn khác nhờ virus vi khuẩn (thực khuẩn thể, bacteriophage, thường gọi phage) Nó đề cập đến q trình theo DNA ngoại lai đưa vào tế bào khác thông qua vector virus Tải nạp không cần tiếp xúc vật lý tế bào DNA tế bào nhận DNA Thực khuẩn thể thường có phổ ký chủ tương đối hẹp, cịn virus mà lây nhiễm cho thực vật vi khuẩn chưa xác định nên khả làm trung gian chuyển gen ngang thực vật vi khuẩn tương đối thấp Khi thực khuẩn thể xâm nhiễm tế bào vi khuẩn, lợi dụng máy chép DNA vi khuẩn chủ để tạo nhiều DNA hay RNA Những DNA hay RNA thực khuẩn thể sau "đóng gói" vào vỏ virus tổng hợp nhờ tế bào chủ Tuy nhiên, q trình đóng gói DNA thực khuẩn thể, tần suất thấp, số mảnh DNA vi khuẩn chủ bị đóng gói vào vỏ thực khuẩn thể Khi ly giải tế bào, virion bị đóng gói nhầm gắn vào vi khuẩn khác bơm phần DNA đóng gói vào tế bào, vơ tình chuyển DNA vi khuẩn từ tế bào sang tế bào khác c) Tiếp hợp Tiếp hợp chuyển giao DNA qua trung gian plasmid transposon , đòi hỏi tiếp xúc tế bào với tế bào Tuy nhiên, tiếp hợp xảy vi khuẩn có quan hệ xa hay chí vi khuẩn với tế bào Eukaryotic, phương pháp chuyển đoạn DNA dài Tuy nhiên, trình tự di động mà hỗ trợ cho việc chuyển gen từ thực vật bậc cao sang vi khuẩn lại chưa biết đến transposons có chức thực vật vi sinh vật chưa xác định nên khả chuyển gen ngang từ thực vật sang vi sinh vật xem thấp Trong tế bào cho, ADN plasmid mở bung điểm mầm oriV, sau sợi ADN (sợi dương) chuyển giao qua cầu tiếp hợp sang tế bào nhận theo chiều kim đồng hồ (sợi 5’ luồn qua trước) Cùng với thời điểm chuyển giao sợi dương, vi khuẩn cho, sợi ADN lại (sợi âm) chịu trách nhiệm làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung cho (tổng hợp sợi dương) để tạo nên vòng plasmid Trong tế bào nhận, sợi ADN vừa chuyển sang (sợi dương), làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung (tổng hợp sợi âm) để hình thành vòng ADN plasmid cho tế bào nhận ADN tổng hợp theo chế bổ sung tế bào theo chiều trượt 5´ >3´ Bằng chứng chứng minh HGT xảy tự nhiên Trong thiên nhiên, việc hoán chuyển gen sinh vật loài hay khác loài, vi khuẩn, động vật thực vật xảy tiến trình sinh vật tiến hóa tỉ năm qua Chẳng hạn, gen kháng thuốc trụ sinh hoán chuyển nhanh cá thể vi khuẩn để chúng trở thành vi khuẩn kháng trụ sinh Gen chuyển từ giống qua loài khác qua trung gian vi khuẩn, virus để tạo nhiều loài, giống mới, chưa kể qua thụ phấn thiên nhiên Trong kết nghiên cứu đăng tải tạp chí Nature, nhà sinh vật học Mỹ Đại học Texas phát chuyển giao ngang nguyên liệu gen (transporon) từ loài bọ hút máu Nam Mỹ vật chủ ký sinh ốc sên Loài ký sinh Rafflesia cantleyi Malaysia đánh cắp gen từ Tetrastigma rafflesiae ký chủ => cải thiện khả ký sinh để trích xuất chất dinh dưỡng từ ký chủ, giúp trốn tránh đề kháng ký chủ III Khả chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển gen vào hệ vi sinh người đơng vật Vậy, DNA tái tổ hợp gì? Nếu chuyển vào hệ vi sinh người động vật điều xảy ra? Có rào cản ngăn cản q trình hay khơng? DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp phân tử DNA tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA loài sinh vật khác Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường tạo thành từ việc gắn đoạn DNA có nguồn gốc khác vào vectơ tách dòng Về mặt lý thuyết, kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép đưa gen từ sinh vật vào sinh vật khác Vấn đề quan trọng để gen ngoại lai biểu thể vật chủ Để biểu gen ngoại lai, DNA tái tổ hợp phải có đầy đủ cấu trúc cần thiết sau: + Gen thị: để xem gen chuyển vào chưa + Promoter: kiểm sốt q trình phiên mã, cho phép sản xuất lượng lớn mRNA từ gen tạo dịng + Polylinker (vị trí cắt enzyme giới hạn): đưa gen ngoại lai vào theo hướng xác với promoter ( đoạn gên ngoại lai khơng nằm trình tự promoter trình tự kết thúc gen khơng phiên mã) Nguy việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO sang hệ vi sinh người động vật Về lý thuyết, trình thành cơng gây nhiều hậu quả: Thứ 1: Nếu gen thị gen kháng kháng sinh => tạo loại vi sinh vật kháng kháng sinh Thứ 2: Tăng khả gây bệnh hoạt hóa gây bệnh vi sinh vật Ví dụ: Một bộc phát nhiễm trùng thức ăn bên Đức (Germany) cho thấy khả kết hợp hai loại gen vào vi khuẩn E Coli: Một loại gen tạo chất độc loại khác giúp cho vi khuẩn có khả bám chặt vào ruột bệnh nhân, kích thích bệnh nhân tiếp thu chất độc nhanh Kết nhiễm độc nguy hiểm lần nhiễm độc khác, dẫn tới suy thận Thứ 3: Tăng khả vượt qua rào cản lồi => mở rộng phạm vi gây bệnh Ví dụ virus lợn nhiễm vào lợn không nhiễm vào người được, virus súp-lơ công vào cà chua Tuy nhiên, công nghệ di truyền sản xuất vector nhân tạo (mang gen ngoại lai) thiết kế lại để khắc phục rào cản, vector sau gắn vào gen người để chuyển vào tế bào tất động vật có vú khác, tế bào thực vật… Tuy nhiên, thực tế, nguy chưa nghiên cứu chứng minh có xảy mà dừng lại mức độ giả thuyết Nguyên nhân đặt có rào cản suốt trình từ lúc GMO đưa vào người động vật qua đường tiêu hóa biểu thể vi sinh vật có đường tiêu hóa Các rào cản trình chuyển đoạn DNA tái tổ hợp vào hệ vi sinh vật người động vật * Rào cản thứ 1: Sự phá vỡ cấu trúc DNA suốt trình biến đổi thức ăn trước tiêu hóa q trình vận chuyển chúng hệ thống tiêu hóa Con người thường tiêu thụ tối tiểu 0,1 đến 1g DNA/ngày chế độ ăn uống (Doerfler,2000) Các gene chuyển có CNSH lại loại vật liệu hệ thống tiêu hóa chúng bị tiêu hóa bình thường Các test invitro khả tiêu hóa tiến hành protein CP4 EPSPS cho thấy enzyme bị phân hủy nhanh chóng phản ứng kiểm tra hệ tiêu hóa (Harrison cs.,1996) (30 giây dịch ruột dịch tiêu hóa người) Trong điều kiện invitro, DNA plasmid mang gen kháng ampicilin xử lý với nước bọt cừu có khả chuyển vào E.coli sau 24h Tuy nhiên, DNA nhiễm sắc thể ngô bị phân hủy vòng phút ủ với dịch cỏ Tất điều cho thấy, DNA tái tổ hợp chưa kịp chuyển ngang sang hệ vi sinh vật bị tiêu hóa hết * Rào cản thứ 2: Các vi khuẩn nhận có khả mang gắn đoạn DNA lạ dạng mạch thẳng (địi hỏi tương đồng cao trình tự) hình thành vùng tái độc lập Trong trường hợp, đoạn DNA may mắn vượt qua rào cản thứ nhất, gặp phải rào cản thứ Trong thể sinh vật có chế tự đào thải, mức độ sai khác cao làm hạn chế khả chuyển gen ngang thành công Tuy nhiên, tái tổ hợp bất thường xảy với tần số thấp (Ehrlich cs., 1993), đặc biệt vi khuẩn bị đột biến thiếu sót tác động mơi trường Những vi khuẩn đột biến thường chứa đột biến gen đầu mút, liên quan tới sửa chữa methyl-directed DNA, sửa chữa sai dẫn tới khả tái tổ hợp với DNA loài khác tăng lên (Rayssiguier cs., 1989, Matic cs.,v1995, 1997, Vulic cs., 1997, Taddei cs., 1997) Khi đó, chúng phải vượt qua rào cản thứ * Rào cản thứ 3: Sự biểu gen chuyển vào địi hỏi có mặt trình tự promoter điều hịa thích hợp Rào cản liên quan đến chế trình phiên mã Một gen khơng thể phiên mã khơng có trình tự promoter thích hợp Điều có nghĩa là, gen ngoại lai phiên mã đưa vào vi khuẩn có chứa trình tự promoter thích hợp với gen ngoại lai phải chứa trình tự promoter có đoạn DNA tái tổ hợp ban đầu Ở tần số thấp đó, trình thành cơng khơng có nghĩa gen ngoại lai biểu thành cơng, mà cịn phải vượt qua rào cản cuối cùng: rào cản thứ * Rào cản thứ 4: Để trì quần thể vi khuẩn, tính trạng chuyển vào phải mang ưu cạnh tranh Kiểu gen + mơi trường = kiểu hình Nguy + điều kiện phơi nhiễm = rủi ro Trong hệ tiêu hóa người động vật có cực nhiều loại vi sinh vật khác nhau, chúng phải cạnh tranh để sinh sống, không đủ mạnh để át chế lồi khác gen có chuyển vào thành cơng khơng có khả biểu kiểu hình Bởi vậy, mơi trường hay điều kiện phơi nhiễm thích hợp đóng vai trị lớn việc giúp chúng vượt qua rào cản Đây coi rào cản kiểm tra may mắn Kết luận: Các rào cản đóng vai trị tích cực việc ngăn chặn trình chuyển gen ngang xảy Có thể nói rào cản ngăn chặn hồn tồn, khơng cho đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO chuyển giao thành công vào hệ vi sinh vật ngườ động vật Phương pháp để phát đọan DNA tái tổ hợp chuyển nạp thành công vào vi sinh vật Nuôi cấy vi sinh vật môi trường kháng kháng sinh (đối với loại chuyển gen mà sử dụng gen kháng kháng sinh để chọn lọc) Chiết tách DNA, PCR với mồi đặc hiệu để phát đoạn DNA tái tổ hợp Lai southerm blot ( lại DNA tế bào với mẫu dị DNA) để kiểm tra có mặt gen chuyển tế bào Lai western blot ( lai protein với protein hay kháng nguyên với kháng thể) để phát loại protein mà DNA tái tổ hợp mã hóa Ví dụ kiểm tra khả chuyển gene ngang Dryzga cs.,(2007) đánh giá an tồn giống bơng chuyển gene kháng trùng có tên Widesstrike chứa độc tố BT Cry1F/Cry1Ac, sử dụng đối chứng giống ngô truyền thống PHY72, PHY78 98M-2983-một dịng đối chứng khơng chuyển gene PSC355 Thức ăn chuẩn bị cho chuột nghiên cứu trog 90 ngày với lượng hạt chuyển gene chiếm 10% phần, tương đương 7,235mg/kg/ngày chuột đực 7,935mg/kg/ngày chuột Động vật đánh giá thông qua thông số trọng lượng thể tiêu thụ thức ăn chăn nuôi Kiểm tra chức năng, hoạt động động khám mắt trước tiếp xúc trước kết thúc thí nghiệm Tiêu chuẩn huyết học, hóa học lâm sàng, thời gian prothrombin thơng số phân tích nước tiểu đánh giá Tất chuột khám nghiệm xác chết quan mục tiêu kiểm tra Sau 90 ngày kể từ ngày cho ăn, khơng có tác dụng phụ phát trình tiến hành quan sát lâm sàng thông số đo nghiên cứu Nghiên cứu chứng minh chế độ ăn với 10% hạt chuyển gene không gây tác động có hại nào, bao gồm khả chuyển gene ngang IV Kết luận Tóm lại, có nguy rủi ro chuyển gen ngang sinh vật chuyển gen chứng minh an tồn sức khỏe người vật ni Việc phát tán DNA tái tổ hợp từ thức ăn vào thể động vật chưa phát hiên khơng có dư lương DNA tái tổ hợp tìm thấy mơ hay quan Về bản, chúng khơng có sai khác thành phần hợp chất so với giống truyền thống; không tiềm ẩn nguy gây độc hại gây dị ứng cho người vật nuôi; ngày có nhiều quốc gia phê duyệt cho phép sử dụng trông CNSH sản phẩm bắt nguồn từ chúng chuối cung ứng thực phẩm quốc gia  ... rằng, cơng nghệ DNA tái tổ hợp an tồn chuyển gen ngang từ GMO sang hệ vi sinh người động vât, phần đây, nhóm xin phép tìm hiểu vấn đề II Cơ sở khoa học vi? ??c chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển. .. vật chuyển gen sang hệ vi sinh vật người vật ni Đây nguyên nhân bắt nguồn cho vi? ??c nghi ngờ DNA tái tổ hợp có khả chuyển từ GMO sang hệ vi sinh vật người động vật Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal... thiện khả ký sinh để trích xuất chất dinh dưỡng từ ký chủ, giúp trốn tránh đề kháng ký chủ III Khả chuyển đoạn DNA tái tổ hợp sinh vật chuyển gen vào hệ vi sinh người đông vật Vậy, DNA tái tổ hợp