- Xác định các chỉ tiêu: NNH3, Naa, N T, thành phần acid amin.
2.2.5.1. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson [3]:
* Nguyên tắc:
Cho protease tác dụng với cơ chất là casein (ho ặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay các acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin, từ đó xác định hoạt độ protease theo định nghĩa:
Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân Casein bởi 1ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,5oC, pH 7.6).
* Hóa chất:
- Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6: trộn 177ml dung dịch Na2HP O4 1/15M và 23ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng.
- Dung dịch casein 1%, dung dịch TCA (tricloro acetic acid)10%, dung dịch NaOH 0,5N, dung dịch HCl 0,2N, dung dịch tyrosine 1mM.
- Thuốc thử Folin được pha tỉ lệ 1:1.
*Cách tiến hành:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Lượng tyrosine (µmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo lượng tyrosin ở các ống.
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Trang 44 Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu:
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Thử thật Thử không Casein 1% (ml) 5 5 TCA 10% (ml) 0 5 Dung dịch mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5 o C, trong 30 phút TCA 10% (ml) 5 0 Dung dịch mẫu (ml) 0 1
Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu
Dịch lọc 1 1
Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 2 2
Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6
Lắc đều và để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm * Cách tính:
Hoạt độ protease:
(UI/g) Trong đó:
- X: Số µmol tyrosine suy ra từ đường chuẩn tương ứng giá trị OD - V: Tổ ng thể tích hỗn hợp phản ứng enzym (11ml)
- v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml)
2.2.5.2.Phương pháp xác định Nitơ formol theo phương pháp Sorensen[3]:
* Nguyên tắc:
- Trong một hỗn hợp gồm nhiều protein, peptid, acid amin, amin, amoniac,… để xác định gần đúng loại đạm “phi protein” người ta dung phương pháp Sorensen.
- Trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu chức là carboxylic (-COOH) như là một acid còn đầu kia là chức amin (-NH2) xem như là một base; còn các amin tự do cũng như amoniac khi hòa tan thường ở dạng amonium NH4+ kết hợp với một anion thường là clorua, sulfat, photphat,…
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Trang 45 - Khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol, formol sẽ tác dụng lên nhóm chức -NH2 để tạo thành phức chất metylen (mono, tri ho ặc hexametilen).
- Sản phẩm tạo thành là hợp chất metylen và một chức –COOH tự do ho ặc HCl có tính acid, nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đó cho phép xác định một các gián tiếp được lượng NH2.
* Hóa chất:
- Dung dịch NaOH N/10, dung dịch H2SO4 N/10, dung dịch formol ½. - Thuốc thử phenolphtalein 3% trong ethanol.
*Cách tiến hành:
- Trung hòa formol ½: thêm vào dung dịch formol ½ vài giọt phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt, ta được dung dịch formol ½ đã trung hòa.
- Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 25 lần thêm vào đó 10ml dung dịch formol ½ đã trung hòa và thêm vài giọt phenolphtalein 3%, l ắc đều để phản ứng xảy ra hoàn toàn, sau đó định phân bằng NaOH N/10 cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng.
Thực hiện ba lần thử không và ba lần thử thật.
* Cách tính:
Số gam Nitơ formol có trong 1 lít nguyên liệu
Trong đó: ΔV = Vt – Vo (ml)
HOOC - CH- NH2 + HCHO HOOC – CH – N = CH2 + H2O
R R
Chƣơng 2: Vật liệu và phƣơng pháp Trang 46 - Vo là thể tích NaOH N/10 trung bình của 3 lần thử không.
- Vt là thể tích NaOH N/10 trung bình của 3 lần thử thật. - x là hệ số hiệu chỉnh của dung dịch NaOH N/10)