- Proteinase Thiol (Cystein protease) (EC.3.4.22): là các proteinase có nhóm thio (SH) của acid amin cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm (SH) này có vị
c/ Ficin thu được từ nhựa cây sung (Ficus carica) [12]:
1.2.3.3. Từ vi sinh vật:[12,25]
Nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease. Các enzym này có thể ở trong tế bào hoặc tiết ra môi trường nuôi cấy. Một số protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học.
Protease từ vi sinh vật có những ưu điểm: Hoạt động được trong khoảng pH khá rộng, chúng tổng hợp được cả hai loại enzym endo và exo-peptidase, do vậy thủy phân được đến 80% liên kết peptit của protein. Thu nhận protease từ vi sinh vật có nhiều điểm ưu việt hơn so với thu nhận từ động vật và thực vật:
-Hoạt tính enzym vi sinh vật cao.
- Vi sinh vật sinh sản, phát triển và tổng hợp enzym với tốc độ cực kỳ nhanh trên môi trường đơn giản, rẻ tiền dễ kiếm thường là phế phụ liệu của công nông nghiệp; do đó thời gian thu enzym nhanh chóng, giá thành rẻ và dễ áp dụng trong sản xuất từ quy mô nhỏ đến lớn. Ngày nay, với quy mô sản xuất công nghiệp, người ta tạo ra hàng ngàn loại chế phẩm enzym khác nhau.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 25 - Vi sinh vật chịu ảnh hưởng lớn của nhiều yếu tố như: thành phần môi trường dinh dưỡng, các tác nhân lý, hóa, cơ học do đó có thể điều khiển quá trình tổng hợp enzym hoặc tạo ra chủng đột biến cho ta hàm lượng enzym đáng kể với tính đặc hiệu cao.
Trong công nghiệp, protease có thể thu từ nguồn:
- Nấm mốc như: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. terricola, Asp. soizae, Asp.
funigatus, Asp.niger, Asp. usamii. Protease của nấm mốc hoạt đông ở vùng pH= 2-11.
Chế phẩm từ mốc vàng (Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. terricola, Asp. funigatus) có pH tối ưu lân cận 6,5
- Từ vi khuẩn: Bac. subtilis, Bac. mesentericus, Bac. circulans,
Bac.thermophilus. Protease của vi khuẩn hoạt động ở vùng pH=7-8. Chế phẩm enzym
từ vi khuẩn Bac. subtillus khả năng thủy phân tốt protein gọi tên là subtilizin. - Từ xạ khuẩn: Actinomyces griseus, Act. fradiae, Act. rimosus. Người ta thường sản xuất proteinase từ vi khuẩn và nấm sợi:
- Proteinase vi khuẩn: Có hai loại proteinase từ vi khuẩn được bán trên thị trường enzym thế giới. Hai loại này khác nhau rất nhiều về khoảng pH hoạt động, mức độ hoạt động và cấu trúc tâm hoạt động.
+ Proteinase kiềm (EC.3.4.21.14): chế phẩm này có tên thương mại là SUBTILISIN. Chế phẩm enzym này có khoảng pH hoạt động 7-11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Chế phẩm enzym này ở dạng bột và dạng hạt có hoạt tính 1-6UI/gam. Chế phẩm này ở dạng kết tinh có hoạt tính 25-30UI/gam. [12]
Bảng 1.3. Tính chất của proteinase kiềm và trung tính [12]
STT Tính chất Proteinase kiềm Proteinase trung tính
1 2 3 4 Khoảng pH hoạt động pH ổn định tối ưu Chất kìm hãm Cơ chất đặc hiệu 7,0-11,0 7,5-9,5 DIFP, PMSF
Chất kìm hãm: từ khoai tây+ Đậu nành
Ester khác nhau, amid, peptid
6,0-9,0 6,0-8,0 EDTA Sodium dodecylsulfate Một số peptid, ester
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 26 + Proteinase trung tính (EC.3.4.24.4) là metalloenzym, có pH hoạt động 6-9. Các chế phẩm enzym này được sản xuất từ Bac. subtilis, Bac.thermophilus,
Streptomycesmgriseus. Chế phẩm enzym thương mại thường là ở dạng bột, có hoạt
tính 0,5-2 IU/gam. Ngoài ra, chế phẩm thương mại của enzym này còn ở dạng lỏng. - Proteinase nấm sợi: thường thuộc nhóm proteinase acid, kiềm và trung tính. Proteinase thu nhận từ Aspergillus thường thuộc nhóm protease acid và trung tính.
Bảng 1.4. Tính chất proteinase từ nấm sợi [12]
STT Vi sinh vật Khoảng pH hoạt động pH ổn định Chất ức chế
Hemoglobi n Casein 1 2 3 4 5 6 7 Aspergillus saitoi Aspergillus oryzae (proteinase acid) Aspergillus oryzae (proteinase trung tính) Aspergillus oryzae (proteinase kiềm) Paecilomyces varioti Phizopus chinensis Mucor pusillu 3,0 – 4,5 3,0 – 4,0 5,0 – 7,5 6,0 – 9,5 3,5 – 5,5 5,0 3,5 – 4,5 2,5 – 3,0 2,5 – 3,0 6,5 – 10,0 3,0 2,9 – 3,3 5,6 2,0 – 5,0 5,0 7,0 7,0 – 8,0 3,0 – 5,0 3,8 – 6,5 3,0 – 6,0 NBS EDTA DIFP
Các protease của vi sinh vật được chú ý nghiên cứu từ năm 1960. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzym và ứng dụng enzym trong thực tế.
Có rất nhiều chế phẩm protease từ vi sinh vật được sản xuất trên thế giới được trình bày ở bảng 1.5:
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 27
Bảng 1.5. Các các chế phẩm protease vi sinh vật và hãng sản xuất. [28]
STT Nguồn thu enzym Tên chế phẩm (Nhà sản xuất)
1 Carboxyl protease acid
Rhizopus spp Asp.oryzae Asp. niger Asp. saitoi Mucor miehei Mucor pusillus
Sumizime R.P (SN), Newlase (AM) Cololase PS (RM), Veron PS (RM) Sumizime LP (SN), Sanzyme (SA) Sumizime FP (SN), protease (MJ) Seishin Pharm co., Noda, Japan (SP) Rennilase (NO), Fromase (GB) Marzyme (SOE), Morcurd Plus (NO) Noury Lad (MSJ)
Meito Rennet (MSJ), Noury Lad (MSJ) 2 Metaloprotease
B. amyloliquefaciens B. thermoproteolyticus
Neutrase (NO), Cololase. N (RM), Bioprase (NG), Veron P (RM), Rhozyme (GR), Orientase (UA) Thermoase (DA) 3 Serin protease Asp. sojae Asp. melleus B. licheniformis Bacillus sp. B. griseus Corolase PN (RM) Sumizyme MP (SN), (AM)
Alkalase (NO), Optimase (SO), Maxatase P (SO). Esperase (NO), Savinase (NO).
Pronase (KK)
Hiện nay, enzym được sản xuất bởi các vi sinh vật biến đổi gen (GMMs) có một số ưu điểm:
- Có thể sản xuất enzym với độ đậm đặc và độ tinh khiết cao hơn.
- Có thể tạo ra các enzym không có sẵn và không có lợi đối với cơ thể sinh vật - Hiệu quả sản xuất cao, tiết kiệm năng lượng và giảm chất thải từ các nhà máy sản xuất.
- Các enzym được sản xuất bởi sự lên men của vi sinh vật biến đổi gen (chủng sản xuất). Quá trình này diễn ra dưới sự kiểm soát tốt trong điều kiện nuôi cấy trong thùng lên men kín.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 28 - Sau khi lên men enzym được tách ra từ các dòng sản xuất, tinh lọc và trộn chất độn tạo sự ổn định cho enzym.
Sau đây là danh sách các enzym protease của Novozymes được sản xuất bởi các sinh vật biến đổi gen.
Bảng 1.6. Danh sách enzym protease của Novozyme được sản xuất bởi các vi sinh vật biến đổi gen. [38]
STT Tên thương mại Lĩnh vực ứng dụng
1 NovoCarne® Tender, Novozym® 37020 Chế biến thịt
2 RONOZYME ProAct Thức ăn gia súc
3 Everlase®, Kannase®,Savinase® Công nghiệp bột giặt 4 NovoBate® 115,Novobate 1547,
Novobate 5046
NovoCor® ABG, NovoCor® ABL NovoCor B-50, NovoCor® SG
NovoCor® SL, NovoCor S 2500, Resinase®
Công nghiệp da
5 Novo-Pro D® Thức ăn thú cưng
1.2.4.Ứng dụng của enzym protease:
Protease là nhóm enzym thủy phân protein thành các sản phẩm đơn giản hơn như peptid ngắn, acid amin, pepton,…. là một trong những nhóm enzym quan trọng của enzym công nghiệp. Sau amylase thì protease là enzym công nghiệp quan trọng đứng thứ 2. Nó chiếm khoảng 60% enzym thương mại (Naseimento và Martins, 2004; Beg và Grupta, 2003; Ellaiah và cộng sự, 2003)
Protease là loại enzym được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vự như: Công nghệ thực phẩm, y học, hóa phân tích, chế biến thủy sản,…
- Sản xuất thực phẩm truyền thống: nước chấm, nước mắm, tương, chao,…
- Trong sản xuất nước quả và rượu vang: Một trong những nguyên nhân chính
gây đục nước quả là protein. Người ta sử dụng nhiều phương pháp để phá hủy protein
làm trong nước quả: xử lý nhiệt, xử lý bằng chất keo tụ, xử lý bằng chất hấp phụ và xử
lý bằng enzym. Trong các phương pháp đó thì phương pháp ưu điểm nhất là sử dụng
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 29 enzym protease. Các loại nước quả thường có pH thấp nên phải sử dụng protease acid. Hiện nay, người ta sản xuất ra nhiều chế phẩm protease acid, các chế phẩm protease acid được sử dụng trong xử lý nước quả thường hoạt động mạnh ở pH= 2,5-3,5. Các protease acid thường được sản xuất từ Asp. oryzae, Asp. awamori, Asp. niger, Asp. flavus, Asp. saitoi. [12]
- Trong công nghiệp chế biến thịt: protease (elastase keratinase, bromelin,
papain) dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một số liên kết peptid trong phân tử protein trong thịt, vừa làm cho thịt có độ mềm thích hợp và hương vị tốt hơn. [1], [12]
+ Chế phẩm thương mại papain dạng bột và chế phẩm thương mại dạng lỏng được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thịt.
+ Chế phẩm enzym này thường được lấy từ canh trường nuôi xạ khuẩn
actinomyces faradiae. Người ta ngâm thịt hay tiêm enzym vào thịt với liều lượng nồng
độ, pH, nhiệt độ thích hợp, sau một thời gian nhờ sự thủy phân một phần làm thịt mềm ra. Ngoài ra, protease còn được sử dụng để sản xuất dịch đạm thủy phân từ các nguồn thực phẩm giàu protein nhưng kém giá trị kinh tế, hay phế liệu của ngành công nghiệp chế biến thủy sản.
- Trong công nghệ thuộc da: protease được dùng làm mềm da, sạch lông, bóng
da trong công nghệ tơ tằm, làm bóng và tách rời các sợi tơ nhờ sự phá bỏ lớp protein xerixin bằng phản ứng thủy phân.
Protein là một thành phần cơ bản của da và lông nên protease đã được sử dụng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trình thuộc da rất có hiệu quả (Christner, 1996; Varela và cộng, 1997).[26]
Quá trình chế biến da bao gồm một số công đoạn như ngâm ướt, tẩy lông, làm mềm da và thuộc da. Thông thường các phương pháp thuộc da thường dùng các hóa chất độc hại như natri sulfide, làm ảnh hưởng rất nghiêm trọng đến môi trường khi nước thải của nhà máy này thải ra sông. Việc sử dụng enzym để thay thế các hóa chất đã rất thành công trong việc nâng cao chất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 30 Chế phẩm proteinase trung tính từ vi khuẩn và proteinase kiềm từ Aspergillus
được sử dụng trong công nghệ thuộc da.
- Trong công nghệ hương mỹ phẩm: người ta trộn một lượng nhỏ protease vào
kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem giặt,.. để làm cho da tóc mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già…
- Trong Nông nghiệp: protease được sử dụng để tận dụng các chế phẩm giàu protein làm thức ăn cho động vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn: thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc xử lý sơ bộ thức ăn,làm thức ăn gia súc (Cheng vàc cộng sự, 1995). Ngoài ra protease còn được sử dụng để thủy phân trùn quế thành dịch acid amin làm thức ăn cho ấu trùng tôm [26], hoặc làm phân bón cho cây trồng.
- Trong công nghiệp nhẹ: [35]
Xà bông, kem giặt có enzym protease sẽ dễ dàng tẩy các vết bẩn, đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải. Protease là một trong những thành phần không thể thiếu trong tất cả các loại chất tẩy rửa, từ chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả và kem đánh răng. Việc ứng dụng enzym vào các chất tẩy rửa nhiều nhất là trong bột giặt. Và đến gần đây, tất cả các protease bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là serine protease được sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ B. subtilis. Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzym này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzym protease (Gupta và cộng sự , 2002).
- Công nghệ sữa: Thông thường người ta dùng rennin làm đông tụ sữa trong sản
xuất format, ngày nay người ta đã dùng các chế phẩm từ vi khuẩn (Bac. mesentericus) hay từ nấm mốc (Asp. candidus, Mucor) có hoạt tính tương tự enzym rennin có thể thay thế một phần cho renin (từ 25-50%), ngoài ra chế phẩm ficin cũng được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến sữa. [5,12,18]
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 31
- Trong y học: protease có nhiều ứng dụng
+Protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật (pepton), sản xuất huyết thanh miễn dịch.
+ Một số protease như pepsin, trypsin, α-chymotripsin dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh kém tiêu hóa như: pepsin-B1, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch, tiêu mủ ở các chỗ viêm, làm thông đường hô hấp, bệnh thiếu enzym bẩm sinh,... Tác giả Phạm Thị Trân Châu đã kết hợp cùng với viện quân y 108 nghiên cứu sử dụng chế phẩm protease có tên gọi Prozimabo để điều trị bỏng, kết quả cho thấy giả mạc rụng nhanh, vết thương nhanh khỏi. [4]
- Trong công nghệ môi trường: protease được sử dụng để tận dụng nguồn
protein trong chất phế thải để hạn chế các tác nhân gây ô nhiễm môi trường, mặt khác xử lý các chất phế thải protein tồn đọng trong các dòng chảy thành dạng dung dịch rửa trôi không còn mùi hôi thối (Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, 2007), xử lý chất thải từ động vật giáp xác (Yang và cộng sự, 2000), xử lý rác thải trong các lò mổ gia cầm (Dalev, 1994), xử lý nước nuôi trồng thủy sản.
- Trong chế biến thủy sản: enzym protease được sử dụng trong sản xuất nước
mắm từ cá (Rebeca và cộng sự, 1991), (Đặng Văn Hợp, 2000), (Vũ Ngọc Bội, 2004) nhằm rút ngắn thời gian chế biến
- Trong các ngành khác:
Enzym protease kiềm từ Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc tính bền
vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao nên chúng được ứng dụng ở nhiều ngành
công nghiệp khác nhau như: xử lý phim X-quang đã qua sử dụng để nhằm thu hồi bạc
(Fujiwara và cộng sự, 1991; Ishikawa và cộng sự, 1993).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu Trang 32
