Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa cytochrome p450 từ DNA metagenome suối nước nóng bình châu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN VĂN TỤNG TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CYTOCHROME P450 TỪ DNA METAGENOME SUỐI NƢỚC NÓNG BÌNH CHÂU LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ NANO SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ NGUYỄN VĂN TỤNG TÁCH DỊNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA CYTOCHROME P450 TỪ DNA METAGENOME SUỐI NƢỚC NĨNG BÌNH CHÂU Chun ngành: Cơng nghệ nano sinh học Mã số: Chuyên ngành đào tạo thí điểm LUẬN VĂN THẠC SĨ CƠNG NGHỆ NANO SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Kim Thoa TS Hà Thị Quyến HÀ NỘI - 2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Kim Thoa, TS Hà Thị Quyến, tận tình bảo, truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trình học tập trực tiếp hướng dẫn, động viên em suốt trình làm thực nghiệm Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Bộ môn công nghệ nano sinh học, khoa Vật lý kỹ thuật công nghệ nano Trường đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp cho em kiến thức cần thiết tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin cảm ơn cán nghiên cứu phòng Cơng nghệ Vật liệu sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâmkhoa học công nghệ Việt Nam giúp đỡ em q trình học tập, nghiên cứu phòng Hà Nội, tháng năm 2017 Nguyễn Văn Tụng LỜI CAM ĐOAN Luận văn thạc sĩ thực hướng dẫn, bảo TS Nguyễn Kim Thoa TS Hà Thị Quyến Tôi xin cam đoan luận văn không chép tài liệu, cơng trình nghiên cứu người khác mà khơng rõ tài liệu tham khảo Nếu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường Người cam đoan Nguyễn Văn Tụng MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 1.1.1 Hệ enzyme cytochrome P450 vi sinh vật 1.1.2 Hệ thống truyền điện tử P450 1.1.3 Hệ enzyme cytochrome P450 bền nhiệt vi sinh vật 1.1.4 Ứng dụng cytochrome P450 1.2 Kỹ thuật metagenomic trình khai thác gen 10 1.3 Khai thác DNA metagenome công cụ tin sinh 11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Vi sinh vật 14 2.1.3 Vector 14 2.1.4 Mồi sử dụng 14 2.1.5 Các môi trường sử dụng .14 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .15 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử 15 2.2.1.1 Tách chiết DNA metagenome 15 2.2.1.2 Giải trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 16 2.2.1.3 Thiết kế mồi 16 2.2.1.4 Khuếch đại gen P450-T2 16 2.2.1.5 Chuẩn bị tế bào Escherichia coli khả biến xung điện .17 2.2.1.6 Tạo vector biểu pET17b gắn đoạn gen P450-T2 (pET17b-T2) .17 2.2.1.7 Biến nạp vào E coli phương pháp xung điện 18 2.2.1.8 Chọn lọc dòng E coli mang vector pET17b-T2 18 2.2.1.9 Biểu gen P450-T2 .18 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh 19 2.2.2.1 Tinh protein P450-T2 tái tổ hợp .19 2.2.2.2 Điện di SDS-PAGE 19 2.2.2.3 Xác định phổ hấp thụ phân tử UV-Vis phương pháp xác định nồng độ cytochrome P450 20 2.2.2.4 Xác định pH tối ưu nhiệt độ tối ưu P450-T2 tái tổ hợp 21 2.2.2.5 Xác định độ bền nhiệt P450-T2 tái tổ hợp 21 2.2.2.6 Xác định redox partner hệ thống truyền điện tử P450-T2 22 2.2.2.7 Xác định phổ chất tiềm P450-T2 22 2.2.3 Các phương pháp tin sinh học .22 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .24 3.1 Tách chiết DNA metagenome từ mẫu suối nƣớc nóng Bình Châu 24 3.2 Giải trình tự DNA metagenome thiết bị HiSeq Illumina 25 3.3 Xây dựng sở liệu metagenome suối nƣớc nóng Bình Châu gen mã hóa cytochrome P450 cơng cụ tin sinh học 25 3.3.1 Giải trình tự tiền xử lý liệu 25 3.3.2 Lắp ráp de novo metagenome 26 3.3.3 Dự đoán gen xây dựng sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hố cytochrome P450 27 3.3.4 Dự đoán nhiệt độ nóng chảy (Tm) P450 tiềm sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29 3.4 Tách dòng biểu gen mã hóa cytochrome P450 từ DNA metagenome suối nƣớcnóng Bình Châu 30 3.4.1 Phân lập gen mã hóa cytochrome P450 30 3.4.2 Lựa chọn ORF hoàn chỉnh mã hóa cytochrome P450 31 3.4.3 Phân tích trình tự gen mã hố cytochrome P450 tổng hợp nhân tạo (P450T2) 31 3.4.4 Thiết kế hệ vector biểu gen mã hóa P450-T2 34 3.4.5 Biểu gen mã hóa P450-T2 .34 3.5 Tinh P450-T2 tái tổ hợp 36 3.6 Xác định số tính chất P450-T2 37 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên hoạt tính enzyme tái tổ hợp 37 3.6.2 Độ bền nhiệt nhiệt độ biến tính tồn phần (Tm) P450-T2 .38 3.7 Redox partner thích hợp chuỗi truyền điện tử P450-T2 40 3.8 Phổ chất tiềm P450-T2 41 KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC .51 DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT APS Ammonium Persulfate CD Circular Dichroism(Quang phổ lưỡng sắc tròn) CYP Cytochrome P450 DTE Dithioerythritol FDA Flavin adenine dinucleotide FMN Flavin mononucleotide LDL Low-density lipoprotein(Lipoprotein tỉ trọng thấp) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide ORF PMSF SDS-PAGE Open reading frame Phenylmethylsulfonyl fluoride Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(Điện di gel Polyacrylamide) DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Kết lắp ráp de novo metagenome suối nước nóng Bình Châu 26 Bảng 3.2: Cơ sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu cụm gen mã hóa cytochrome P450 28 Bảng 3.3: Sàng lọc chất P450-T2 dựa thay đổi UV-Vis từ trạng thái LS sang trạng thái HS 42 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình 1.1: Sơ đồ số hệ thống truyền điện tử điển hình nhóm P450 Hình 1.2: Quy trình xây dựng phân tích hệ gen từ liệu giải trình tự 13 Hình 2.1: Quy trình lắp ráp xử lý số liệu 23 Hình 3.1: Vị trí điểm sơi suối nước nóng Bình Châu lựa chọn để lấy mẫu 24 Hình 3.2: DNA metagenome mẫu nước suối nước nóng Bình Châu 25 Hình 3: Thành phần đoạn đọc thơ mẫu đọc trình tự DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 25 Hình 3.4: Chất lượng liệu sau tiền xử lý Trimmomatic 26 Hình 3.5: Phân bố độ dài contig sau lắp ráp phần mềm SOAPdenovo2 27 Hình 3.6: Phân bố độ dài gen dự đoán từ sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 27 Hình 3.7: Số lượng cytochrome P450 sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29 Hình 3.8: Phân bố Tm cytochrome P450 tiềm mã hố 38 ORF hồn chỉnh từ sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 30 Hình 3.9: Cây phả hệ cytochrome P450 mã hóa gen phân lập từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu số cytochrome P450 khác 32 63 AGAGCTGCGCGTCTACAGCGCCGAGTACGAGCGCAACGGCTTCCAGGGCGGGCTGCAGTGGTACCGCTGCGCGACCGATCCGG GGCACGCGGCCGATCTTCAGGTGTTCTGTGGCCGCACCATCGACGTGCCCTCGCTGTTCATCGCCGGCCGCAGCGACTGGGGC ATCTATCAGAGACCCGGGGAGTTCGAGCGCATGCAGCAGCAGGCCTGCACCCGCATGCTCGGCTGCCACCTGGTCGAAGGCGC CGGCCACTGGGTTCAGCAGGAACGGCCCGAAGAGGTCGGACGCCTGCTGCTCGATTTTCTCCGGCGCGGCGGGGCGAGCGCCT AG >[denovogenes]_37407 ATGATCGATTTTACGACTGAAGAGATGCGACGCAACCCCTTCCCTGTTTATGAAATGGTACGAAACCTAGCGCCCCTGCTCAA TGAGCCCCGGAGCGGTCTTTGGCTGGTCTTCGACTATGAGGGCGTAAAGCGTGTCCTGAACGATCACGCCGTGTTCAGCGCCC AACACGGCCCCGCGGAATGGATCGTATTTATGGATCCGCCGCGCCACACAAAGCTGCGCGCCCTCATATCGCAAGCATTCTTG CCGCGCCACATCGCCGGCCTCGAACCCCGCATCCGCGAGCTGTCACGCCAACTGCTGGACCAGACGATCGAGCAAGGCGAGAT GGATCTGGCCGCGGACTTCGCTGTGCCCCTGCCAATGATGGTGATCGCCGAGATGCTGGGTATCCCCGCCGTCGATCGGCCGC TCTTCAAGCGCTGGAGCGATGTGATCTTGAATATGAGTTACGCCGTAGCAGGCAGTTCCGAAGCCGCTCAGGCAGCCAGTAAT TTCATGGCCGTTACCGCCGAGATGAACACCTACCTCACTGAAGTGCTCGAGCAGCGCAGGGCGCAGCCCAAAGACGACCTGCT CACCCGCCTGCTTGCCGCCGAAGTCGATGGCGACCGGCTCACACAGAAGGAGATCTTGAACTTCTTTCAGGCCCTGCTGGTGG CCGGGCAGGAGACCACTACAAACCTGATCAACAATGCCATTATCTGCTTCATCGAGAACCCGGACCAACTGGCCCGTCTGAGA GCACGGCCCGATCTCTTGCCTGCGGCCATCGAGGAGGTATTGCGCTACCGCTCGCCCGTACAATGGATGTTCCGCGTGACAAA ACAGGATGTCGAGATGCACGGACAGGTGATCCCGGCGGGCAAGCTGGTACTGGCGATGATTGGTGCTGCAAACCGCGATCCCG GCCACTTCCAGGAGGCCGATCGCTTCGATATCGCGCGCGAACCGAACCCCCATATCGCCTTCGGACACGGCATCCACTTCTGC CTTGGTGCCGCGCTCTCACGCCTGGAAGCGCGCATCGCGCTCGCAGATCTGCTGGCGCGCGTCAAGGATATCAGCTTCGCCAG CGACACGCCCTGGCAGCCGCGCAAAGCTCTGCATGTACACGGCCCAGAACGTCTGCCGATTCGCTTCCGGCCGGTGTAA >[denovogenes]_50228 ATGACGGACGCCCATCCCATGGGGCCGCACCGCCGGGTGCGCGCCAACGGCATTGATTTGGCCATCTGGGAAGCCGGGGAAGG GTTTCCCGTCGTGCTTTGCCACGGCTTTCCGGAATTGGCCTACTCCTGGCGCCACCAACTGCCGGCCCTGGCCGCGGCGGGTT ACCACGCCATCGCGCCCGATCAGCGGGGCTACGGCCTCAGCAGCCGTCCGGCGGACGTGGCGGCCTATGACGCCGCGCACCTG ACCGGCGACCTGGCGGGGTTGCTGGACGCGCTGGGGCTGGAGCGGGCGGTCTTCTGCGGCCATGACTGGGGCGGGATCGTCGT CTGGCACATGGCCCTGCTGCACCCGGGCCGGGTGGCCGGCGTCATCGCCCTCAACACGCCTTTTCAGCCCCGCGGGCCGCGGG ACCTGGTTTCCACCCTGCGGCACGTCTACGGGGAAGACCACTACATGGTGGCCTTTCAACAGCCGGGCCGGCCGGAGGCGATG TTCGAGCAGGACGTGGCACGGGTGCTGGGGCGCATGTTCCGCAAGCCCAAAAGCGGCCACGCGGTGAACCTGCCGCGGGAACA GGCGGCGCGCCTGTTGACCCTGGAGGCCCTGGCCGGCACCGGCCCCACCGGCGGCGAGCCGTTTCTGCCGCCGGAGGACTTCC AGTTCTACGTGGATACCTTCCGCCGCACGGGATTTTCCGGCGGCATCCACTGGTACCGCAACCTGCGCCGCAACTGGGAGCTG CTGGCGGACGTGCCCCAGCGGGTGGAAGTGCCGGCGCTGATGATCTCGGCGGAGAACGACCTGTTCCTGCCGCCCCGGCTCAC CGAGGGCATGGAGCGCTGGGTGCCCAAACTCGAGCGGCACGTGATCCCCCGCTGCGGTCACTGGACGCAACAGGAGCAGCCCG AGGAAGTGAACCGTTTGATGACCGCCTGGCTGCGGCGCTGGTTCCGGCCCGCCGGCCGCCTGCGCCTTGAGCCGGGGGGGCTG CGCCATGGCTGA >[denovogenes]_55086 ATGCGAACCCGCCCTGTCCAGACCGACCGCCTGACCCAGCAGATCCTCGAGGCCGGCTCCGGCCCCCTGGTGCTGCTGGTTCA CGGCTTCCCGGAGCTCTCGATCAGCTGGCGCGCCCAGGTCGACGCCCTCGCCGCCGCGGGCTTCCGCGCCGTCGCTCCCGACA TGCGCGGCTACGGCGAAACGGAGAAGCCCGCCGACCGCGACAGCTACTCGATACTTCACCTCGTCGGCGACATGGTCGACCTC GTCCGGGCGCTTGGCGAAGAGCGCTGCGTCGTCGTCGGCCATGACTGGGGCGCGGCGGTCGCGTGGCACTGCGCCCTGATGCG GCCGGACCTGTTCACGGCCGTCGCCGGCCTGTCCGTGCCGTTCCAGCCCCGCCGGCCGAAGGGGCCGCCGACAGCCGCCGTGG CCGCCCTGTCGAAACGGGCCGGCCTCGGCGACCTCTACATCAGCCGCTTCCAGGCCGATGACGCCCATGCGGCCTTCGACGCC GACCCTGCGACCGCCCTGCGCAAGATGTTCTACGCCTACGACGGCGCGACTCCCACCGGCCGCCAGTCCACCGGCTTCCTCCC TGAAGGCGTGGGCCTGACGGAGTCCATCGCGGACGACGCCGCCCTGCCGCCGTGGATGAGCGATCCGCATTTCGACGAGTACG TCGCGGCCTTCTCCGCCGGCGGCTTCCGCGCTCCGCTCGACTGGTACCGCTGCCTCGACCTGAATTGGGCCCAGACCGCCTTC CTGCAGGACGCCCGCGTCCGCGTCCCGGCGGCCTTCATGGTCGGCGAGCGCGATCCCGTGCGCCACTACGCCGGCGCCCACGA GGCGGCGATGAAGGACTGGATCCCCGACCTGCGCGTCCAGCGGGTCCTGCCCGGCGCCGGCCACTGGATCCAGCAGGAGCGGC CGGAGGAGGTGAACGCCTTCCTGCTCGACTTCCTGCGCGGGCTCTAG >[denovogenes]_6360 ATGAAGTTAAAAAAAACAGTATCAGGAACAAATGAACCAATCCGTAAAATAGATCACGTTCTCACTCGCCGCGGTTCTTTCGG TATCAAGTTCACGCCTGATTATGCCGCCATACAGCTTTCTTCCGGATGGGAAGGCCGGAACATTGACGAAATTCAGAAAATAT TAATCAGTGCCGCAAAAAAATGTAATACCGAAATTGAAAATACCGATTGTGAAAAAACCAAACAACAAATACGAAAAGCATAC AGACAATTTGTTGAAGAAGCATTTACGCCGGTATTATTACAAAAAAATGATATACCGGATTTGTTTCAGATTCTTATCGGAAA 64 TTTTTCAAGCCTGATTATAACCATTTTTAATAGTAAAGAGACCCCGGAATTAAAAAATTCAGCCTATAGTGTCCTGGAAGAGT CGCTTAAAACACTCTGTAAAGACCTGGTTGAACATTTTGAACTGCCGGAAAACGTTGAAGAGTTATTTGTCTCGACATTAATG GATGTATCTTTCACCTTATCACAAGGGCTAATGAGTGATTTCCAAAAGAACCAAAACCCTGACACTCTGGGACATCTTAATGA AAAAGTAACAGATATAATGTCTACTCCACCTCAATTATCACGAAAACACAGTACCTCTAACGTAGCACCGGGAGAAAAAGTCG CACTATCTACTTTTGATATGGGTATGGTTAACATTTTAAGAGCCATGTCGATTCTTCCCCGGAACGATTGGACAGATTATGGA CGATGGACCGGAGTAATAGGGAAACGGGCGTCCGGGCCTCATAGTCTCGACGGATTAAAAAACTGGGATATCATCAGAACAAT AGGCCTTAAAGCCTTTTTAGATCACCTTCATGATAAATACGGAAAAGTTGTATTTTTTTACATTGTACATGAACCGGTTTACT CCATAGCAGACCCGAAACTGCATCATGCCCTTGCCACCCACAAAGATATCGACCGCGGCGAAACCTTGGCCCATTTTAGAGAA TTGTTTGGCCCCTATTCAATATTTACCGAAAAAGATCCGGAAAAATGGAAAAAAATACATGATGTATACAGGAAAGCACTTAC CCGTCTGACTGACATTCAACCTTCTTTAATGGAAAATCTCACTAAGCAATGGCACCAATCCCTAAGCCATTACAGTTGCACAC ACGAAGCGTTTGAGATAGTGGGTGAAATGAAACGGGTAACGCTATTTGTATTTTCTTCTGTCTTTTTGAATATCGAGAATATT GAAAATCCCAAAGAACTGGGGAATTTATTTACGGAATTGCTAAATACGGTGTTCAGCAATACCGTCAATCCCTTGGAAAGACA GTCTATCGAAAATAAAAGAGAAGCCTTATGGATCAAATTTGAATCGGTTGTAAAACGTAACCCCGGGATGTTAAACGTGGAAT TTGTTAAAGAGTTAATAGGCATTGATAGAGACAATGTGACAATTGAGACCCTGACGGAAGAAGAAAAAAGAACTCTGCGGGAT CAGCTTTTGACCACAATGTTTGCCGGCCATGAAACGACCTCCAAACTGGCAACCTGGATGCTCTTGTATCTCATTAAATACCC TGAGTTGGAAAGAAAAATAATCCAGGAAATCAATGAATCCGGATATGCCGCAGATCCGTCCCTTCCAAATTTGAGAAAACTCA AAACGTTAGAAGCTCTGATTAATGAAATATTGCGGGATCGCGGCCCCATTTGGGTATATGGCCGCGAAGCACAAGAAACGGTT TCCTTAACAGGAAGTGACGGGAAATCATATGCCTTTTATAAAGGCGATAAAATTTTATTAAATAGTCACCGTGTTCATCACGA TCCGGATTATTGGGAAAACCCAAATGAATTTAACCTGGATCGCTGGAATAATACCAAGCTGGAATCAGGACAATTTACGCCGT TCGGAGATGGCCCTAAAGCCTGTCTAGGGCGGTTCTTTGCAAAAATTGAAGCTATGCGTATTAGCGCGGATATTATTTTACAA TTCAAATTCTCGTTTGCGATGGGTGAAGATATAAAAGATCCGGAATACACATTTGCCTGTGGTCCTCGACCAACATATATTCA TGTGGAACGTCGTACAAACGCTCAATCACGCCCCCTTTCTGCCTGCAAAAAAGAAACGGATGGTTTATTACCGAATAAGGACC ATACAACAGTTTACATCTAG >[denovogenes]_65701 ATGCGCCCACGCATACAAGCCATCACCGATGAACTCTTGGACCAGGTGCAGCCCGCGGGACAAATGGATATTATCGCTGATTT GTCATTCCCTTTGCCGGTGATCGTTATCGCGCAGATGTTAGGAGTACCAACGGAAGATCGCGATAAGTTCAAAGCGTGGACGC CTGATCTGGCGCGGACGCTTGATCCTCTCGTTTCCCCCGAAATTCTGGACGCCGGGGATGCGGCAACGCTTGCTTTCTACGAC TATTTTCGTGAATTGGTTGTGAAACGGCGAAAAGATTTGCGGGATGATTTGCTGAGCGCGTTAATCGCGGCCGAGGAGCAAGG AGATCGTCTCTCTGAAGATGAGTTAATCGCAACGGCCGTGTTGTTGCTTGGCGCCGGTCATGAAACCACGATGAATCTCATTG GCAATGGTTTGCTAGCGCTGTTCCGTCACCCTGACCAGCTCGAGAAGCTCAAAGCTGACCCAACGCTAATTCAAAGCGCGATC GAGGAATGCCTGCGTTTCGATGGTCCCGTGCAAATGACTGCGCGGACGGCGCTGGAGGACGTAGAGATCGGAGGAAACACACT GACGAAAGGTCAGCAGGCCGTTATCGTACTCGCAGCGGCCAATCGCGACCCTGCACAATTTGTTGATCCGGACCGATTCGCTA TTACTCGCAAGGAGAATCTGCATATCGCTTTCAGCCACGGTATTCACTACTGTCTCGGTGCGCCACTGGCGCGGGTCGAGGCG CAAATCGTCATTAATACGCTTCTTCGGCGCATGCCTAACCTGCGACTGGCGACCGAGCAACTGGAATGGCGAGAGACGGTGAC GTTGCGTGGGTTAAAGGCGCTGCCGGTGGCATTTTAG 65 Phụ lục 3: Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR STT Mồi xuôi Mồi ngƣợc 5’-GCATATGAAAACATCAGCTCAG -3’ 5’-GAACTACAGAGTTTCAACCGCT -3’ 5’-GCATATGCAGGTCTTCAAC-3’ 5’-GTATCAGGTCGAAGAGGC-3’ 5’-GTATATGCGCCCACGCCTG-3’ 5’-GTAAGGCCACCGCGTGATC-3’ 5’-GCTACATGGCACAGCAATTG-3’ 5’-GCTTACTAGTCGTCCCACAT-3’ 5’-GCAATATGCTCGTGCCGGAA-3’ 5’-GAATTCTAGGCGGCGGAGG-3’ 5’-GCGCATGATGTTTCAAACAGAC-3’ 5’-GTCCGATTAAGTTGCGATGCG-3’ 5’-GCATATGGCAACACCCGCA-3’ 5’-GCCAGTTAGTTTATCGCTTC-3’ 5’-GATCCATATGGGCCTTGGCAGCTTCCA3’ 5’GATCAAGCTTAGTGGTGATGGTGATGATGCTGGG CCTTGAGCTGCAGCA-3’ 5’-GCGCATATGTCCGATTCCGGA-3’ 5’-GAATACTAGGCGGCGGAGGT-3’ 10 5’-GCTAATGGGAGAGACGCGG-3’ 5’-GCCATCTAACTGGAACAATTA-3’ 11 5’-GCTTCATGACGCTACCGCCT-3’ 5’-GCCATGATCAAGAGTTAACCAC-3’ 12 5’-GCTCACATGAACCTTGAGCCC -3’ 5’-GCATCGTTAGTGCGACAGCCTT-3’ 13 5’-GTCGCATATGGCGAAAGAAACC-3’ 5’-GGCATCGCTACGAATTCAATTC-3’ 14 5’-GCTAAATGTCCCTGCCGCCA 5’-GGTAGATCACACGTATTGCGG 15 5’-GTCATATGGCGCTCCAAGC-3’ 5’-GCTATCAGGCGCGGACCC-3’ 16 5’-GCGCATCATGGTTACGTCAATA-3’ 5’-GCCTAGCGTTATCTTTTGGTCAA-3’ 17 5’-GATCCATATGGTCACGGCCGCG-3’ 5’-GATCCATTCAGCTGACGGCAAA-3’ 18 5’-GTACCTAATGCCGCTAAAGTCG-3’ 5’-GCACCTCCATTAACTGCTTAATCA-3’ 19 5’-GCAGAATGCCGCTAAAGTCG-3’ 5’-GCCACGATCATTTGTTTCTTTTC-3’ 20 5’-GAGCCATATGACAGTCTGGACC-3’ 5’-GATCCATTCAGGCCCGTTTCAC-3’ 21 5’-GTGCCATATGAGCGCCCTACGA-3’ 5’-GTGCCTATTAGTTTCTCCTCTC-3’ 22 5’-GCACATGATGCAAGTCTCGGAC-3’ 5’-GCACATGTTAGGCAACGCCAC-3’ 23 5’-CGACATGATGGCAGAGTTTCGC-3’ 5’-CGTCAACGTTATCGCGGCCTGAT-3’ 66 24 5’-CGACTAGATGAATATCCGTCGC-3’ 5’-CGACATGCTAATTTCTGCGCGT-3’ 25 5’-GCAGTAATGACGGGCATGGG-3’ 5’-CGTGATCTAGACCTGCACCT-3’ 26 5’-GCATTCGATGACGGACACCATC-3’ 5’-GGATCATCACCGCACCCGCA-3’ 27 5’-GCACGTCATGAACATGTCTGAC-3’ 5’-GATACATCACGCCGTCCAGCA-3’ 28 5’-GTGCCAATGAGCACACGACTG-3’ 5’-GTGCCATCAGTTCAGCAAGAC-3’ 29 5’-GTCCGAATGGTGAATATGAAT-3’ 5’-GCGCACTACAAAACGCGTAT-3’ 30 5’-GTACCTAATGATGATCATGCCCG-3’ 5’-GATGCTAATGCTAGGCGCTCG-3’ 31 5’-CTGCTACATGATCGATTTTACG-3’ 5’-CGTCAACTTACACCGGCCGGAA-3’ 32 5’-CGACTAGATGACGGACGCCCAT-3’ 5’-GCACTAGTCAGCCATGGCGCAG-3’ 33 5’-GTACCTCATATGCGAACCCGCCCT-3’ 5’-GATGCTAATCTAGAGCCCGCGCAG-3’ 34 5’-CGACGAGTCATGAAGTTAA-3’ 5’-GCGCTAGATGTAAACTG-3’ 35 5’-GCACATGACTAAAATGCCACCGG-3’ 5’-GCACATGAATGCGCCCACGCATA-3’ 36 5’-CGTGATCGATGTATGTGTTCCGA-3’ 5’-GGTGATCTTCAACGCAAACGCA-3’ 67 Phụ lục 4: Trình tự axit amin gen >[denovogenes]_35152-T2và trình tự axit amin tƣơng ứng >[denovogenes]_35152-T2 ATGGGCCTTGGCAGCTTCCACTTCGACCCGTATTCCCCGGCCATCGACGCCGACCCCTTCCCCAGCTACAAGCGCCTGCGCGA TGAATTCCCCTGCTTCTGGAGCGAGGAGGCGCAGATGTGGATCCTCTCGCGCTACAGCGACATCGTGACCGCCGGCCAGGACT GGCAGACGTATTCGAGCGCCAGCGGCAACCTGATGACGGAACTGCCCGGCCGCGCCGGTGCCACGCTGGGCAGCTCGGACCCA CCAAAACACGACCGCCTGCGCGGCCTGATCCAGCACGCGTTCATGAAGCGCAACCTGATGGCGTTGGAAGAGCCGATCCGTGA CGTGGCGAAACAGGTGTTTGCGCAGGTCAAGGGCGTCAAGGAATTCGACTTCAAGGACGTGTCCTCGCAGTTCACCGTCAAGG TGCTGATGGCCGCACTGGGGCTGCCCATGGGCGAAGACGCGCTGGTGCCCGAGCACGAGGTGCGCGAGAACGCCGTGCTGATG GTGCAGAGCGATGCCCGCACCCGCGCCAAGGGGCCGGAACACATTGCTGCCTACAACTGGATGCAGGACTACGCGAGCAAGGT CATCGCCATGCGCCGGGCCAGCCCGCAGAACGACCTGATCAGCAACTTCGCGCTGGCCGAGATCGACGGCGACCGGCTGGACG ACCGCGAGGTGCTGCTGACCACCACCACGCTGATCATGGCGGGCGTGGAATCGCTGGGCGGCTTCATGATGATGTTCGCCTAC AACCTGGCCACGTTTGACGAGGCACGCCGCGCCGTGGTGGCCAACCCGGCCCTGTTGCCTGATGCGATCGAGGAGAGCCTGCG CTTCAACACCTCGGCCCAGCGCTTCCGCCGCCGCCTGATGAAGGACGTGACCCTGCACGGCCAGACCATGAAGGAAGGCGACT TCGTCTGTCTGGCCTACGGCAGCGGCAACCGCGACGAGCGCCAGTACCCCAATCCCGATGTGTATGACATCGCGCGCAAGCCG CGTGGCCATCTGGGCTTTGGCGGTGGCGTGCATGCCTGCCTGGGCACCGCGATTGCCCGTCTGGCGGTCAAGATCGCATTCGA GGAATTCCACCAGGTGGTGCCCGACTACAGGCGTGTGGCTGACCAGCTGCCCTGGATGCCTTCGTCCACCTTCCGCAGCCCGC TGGTGCTGCAGCTCAAGGCCCAGTAA > CYP203A1_[denovogenes]_35152-T2 MGLGSFHFDPYSPAIDADPFPSYKRLRDEFPCFWSEEAQMWILSRYSDIVTAGQDWQTYSSASGNLMTELPGRAGATLGSSDP PKHDRLRGLIQHAFMKRNLMALEEPIRDVAKQVFAQVKGVKEFDFKDVSSQFTVKVLMAALGLPMGEDALVPEHEVRENAVLM VQSDARTRAKGPEHIAAYNWMQDYASKVIAMRRASPQNDLISNFALAEIDGDRLDDREVLLTTTTLIMAGVESLGGFMMMFAY NLATFDEARRAVVANPALLPDAIEESLRFNTSAQRFRRRLMKDVTLHGQTMKEGDFVCLAYGSGNRDERQYPNPDVYDIARKP RGHLGFGGGVHACLGTAIARLAVKIAFEEFHQVVPDYRRVADQLPWMPSSTFRSPLVLQLKAQ 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 ... liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29 3.4 Tách dòng biểu gen mã hóa cytochrome P450 từ DNA metagenome suối nƣớcnóng Bình Châu 30 3.4.1 Phân lập gen mã hóa cytochrome P450. .. ORF hoàn chỉnh từ sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 30 Hình 3.9: Cây phả hệ cytochrome P450 mã hóa gen phân lập từ DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu số cytochrome P450 khác 32 Hình... gen dự đoán từ sở liệu DNA metagenome suối nước nóng Bình Châu 27 Hình 3.7: Số lượng cytochrome P450 sở liệu metagenome suối nước nóng Bình Châu 29 Hình 3.8: Phân bố Tm cytochrome P450 tiềm mã