Nghiên cứu tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa petase

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ PETASE HÀ NỘI - 2023 ii HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HOÁ PETASE Sinh viên : Nguyễn Thuỳ Dung Ngành : Công nghệ sinh học Giảng viên hướng dẫn : TS Lê Thị Bích Thảo TS Phạm Thị Dung HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tồn kết luận văn trực tiếp thực Các số liệu kết cơng bố luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Dung i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới cô TS Lê Thị Bích Thảo – Trưởng phịng Hố sinh Protein – Viện Công nghệ sinh học cô TS Phạm Thị Dung – Bộ môn Sinh học phân tử & CNSH Ứng dụng - Khoa Công Nghệ Sinh Học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn cán phịng Hố sinh Protein giúp tơi có định hướng xác để thực đề tài ln động viên tơi có đóng góp chun mơn q báu để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Bố, Mẹ, người thân gia đình bạn bè ln ủng hộ, khuyến khích để tơi vững vàng suốt q trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 1năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thuỳ Dung ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VIII TÓM TẮT IX I MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH 1.3 YÊU CẦU II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nhựa 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Phân loại nhựa 2.1.3 Khái niệm nhựa PET 2.1.4 Lịch sử trình thương mại hố PET 2.1.5 Tính chất nhựa PET 2.1.6 Ưu nhược điểm nhựa PET 2.1.7 Tình hình sử dụng nhựa giới Việt Nam 2.1.7.1 Trên giới 2.1.7.2 Tại việt nam 11 2.1.7.3 Phân tích ô nhiễm rác thải nhựa Việt Nam 12 2.1.8 Tái chế nhựa PET 13 2.2 PETASE 15 2.2.1 Tìm hiểu chung 15 2.2.2 Cấu trúc không gian PETASE 16 iii 2.3 Ảnh hưởng petase đến bề mặt nhựa PET 18 2.4 Sự khác enzyme PETASE VÀ MHETASE 19 III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 22 3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 22 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22 3.1.4 Nội dung nghiên cứu 22 3.1.5 Sơ đồ nghiên cứu chung 22 3.2 Vật liệu, hố chất, thiết bị, máy móc 23 3.2.1 Vật liệu 23 3.2.2 Hoá chất, thiết bị, máy móc 23 3.3 Phương pháp 24 3.3.1 Định lượng DNA mẫu 24 3.3.3 Tách dịng gen mã hố PETASE 26 3.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli phương pháp sốc nhiệt 27 3.3.5 Tách chiết dna plasmid từ tế bào E.coli 28 3.3.6 Điện di phát DNA gel agarose 29 3.3.7 Tách chiết DNA khỏi gel agarose 29 3.3.8 Thiết kế vector biểu gen mã hoá cho PETASE 30 3.3.9 Biểu PETASE E.coli 31 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1 Tách dịng gen mã hố cho PETASE 33 4.1.1 Nhân gen mã hoá cho PETASE kỹ thuật PCR 33 4.1.2 Tách dịng gen mã hố cho PETASE 34 4.1.3 Kết xác định trình tự gen mã hố cho PETASE 37 4.2 Biểu PETASE tái tổ hợp 39 4.2.1 Thiết kế vector biểu PETASE – pET22b(+) 39 4.2.2 Biểu PETASE tái tổ hợp 42 iv V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 5.1 KẾT LUẬN 44 5.2 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 48 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Mã nhận diện loại nhựa Bảng 3.1 Các hoá chất enzyme 23 Bảng 3.2 Máy móc thiết bị 24 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 3.4 Chương trình thực phản ứng PCR 26 Bảng 3.5 Thành phần hỗn hợp phản ứng ghép nối 27 Bảng 3.6 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28 Bảng 3.7 Thành phần dung dịch tách chiết DNA plasmid 28 Bảng 3.8 Thành phần hỗn hợp phản ứng ghép nối PETase – pET22b(+) 31 Bảng 3.9 Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE 32 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cơng thức cấu tạo Polyethylene terephthalate Hình 2.2 Polyethylene terephthalate Hình 2.3 Biểu đồ cung cầu nhựa PET châu lục năm 2018 2022 10 Hình 2.4 Sợi dệt tái chế từ lốp xe qua sử dụng 11 Hình 2.5 Sản lượng sản phẩm nhựa tiêu thụ giai đoạn 2015-2020 12 Hình 2.6 Rác thải nhựa bãi sông Việt Nam 13 Hình 2.7 Cấu trúc sản phẩm thuỷ phân PETase 16 Hình 2.8 Cấu trúc không gian PETase 17 Hình 2.9 Kết bề mặt PET film chụp kính hiển vi điện tử quét (SEM) 19 Hình 2.10 Bề mặt PET gần bị phân huỷ hoàn toàn sau tuần 30oC 19 Hình 2.11 Cấu trúc tinh thể (A) PETase (B) MHETase 20 Hình 2.12 Cấu trúc MHETase ( độ phân giải 1,6 Å) 21 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình bước tiến hành 22 Hình 3.2 Sơ đồ thiết kế vector biểu PETase pET22b+ 31 Hình 4.1 Kết PCR nhân gen mã hố cho PETase 33 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp 35 Hình 4.3 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme NdeI BamHI 36 Hình 4.4 Phổ trình tự nucleotide đoạn gen mã hoá cho PETase 37 Hình 4.5 Trình tự nucleotide gen mã hố cho PETase với trình tự gen ngân hàng Genbank 38 Hình 4.6 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen plasmid tái tổ hợp PETase-pBT 39 Hình 4.7 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen mở vòng vector pET22b(+) 40 Hình 4.8 Hình ảnh kiểm tra kết DNA khỏi gel agarose 41 Hình 4.9 Biểu protein dung hợp PETase – pET22b(+) 43 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Amp Ampicillin Ampicillin APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate Bp Base pair Cặp bazơ DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic E.coli Escherichia coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic Axit tetraacetic ethylene acid diamine IPTG Isopropyl-b-D-thiogalactoside Isopropyl-b-D-thiogalactoside Kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton LB Luria – Bertani Môi trường LB OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate SDS – PAGE Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel Đệm điện di biến tính SDS gel polyacrylamide electrophoresis TEMED Tetramethyl ethylene diamine Tetramethyl ethylene diamine v/v Volume/Volume Thể tích/Thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích viii dịng pBT mở vịng Tổ hợp gen (plasmid tái tổ hợp) tạo thành biến nạp vào tế bào tách dòng DH5α phương pháp sốc nhiệt để chọn dịng plasmid có khả mang gen mã hoá cho PETase 4.1.2 Tách dịng gen mã hố cho PETase Q trình tách dịng gen mã hoá cho PETase vào vector pBT gồm bước: (i) nối ghép gen vào vector enzyme T4 ligase, (ii) biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt, (iii) nuôi cấy tế bào cuối (iv) tách chiết DNA plasmid kiểm tra plasmid tái tổ hợp enzyme giới hạn Tế bào vi khuẩn E.coli DH5α chứa tổ hợp gen nuôi cấy môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin X-gal Kết thu hai dòng khuẩn lạc xanh trắng Khuẩn lạc xanh khơng có khả chứa gen đích vector pBT tự đóng vịng nên gen mã hố cho PETase vector tổng hợp enzyme chuyển hố chất X-gal từ khơng màu sang màu xanh Khuẩn lạc trắng khuẩn lạc có khả cao chứa vector pBT mang đoạn gen đích Do gen đích chèn vào vector nên vùng gen mã hố cho PETase bị gián đoạn, enzyme không tổng hợp để phân huỷ chất X-gal dẫn đến khuẩn lạc có màu trắng Để khẳng định dòng khuẩn lạc trắng có mang vector tái tổ hợp hay khơng chúng tơi tiến hành cấy chuyển dòng khuẩn lạc chọn lọc sang mơi trường LB lỏng với có mặt ampicillin đến nồng độ cuối 100 µg/ml nuôi lắc qua đêm 37oC, 170 v/p Dịch tế bào sử dụng để tách chiết DNA plasmid, khuẩn lạc xanh không chứa vector tái tổ hợp sử dụng làm đối chứng âm Kết tách chiết DNA plasmid (Hình 4.2) cho thấy thu hai loại plasmid có kích thước khác Đoạn có kích thước nhỏ (2705 bp) plasmid gốc pBT (đường chạy số 1) nằm vị trí thấp điện di đồ, cịn 34 đoạn nằm vị trí cao có kích thước lớn (đường chạy 3) vector pBT chèn thêm đoạn gen Các plasmid tái tổ hợp kiểm tra cấu trúc cách cắt với hai enzyme NdeI BamHI vùng cắt đa vị vector pBT có hai vị trí nhận biết enzyme Sản phẩm cắt kiểm tra điện di gel agarose 0,8% (Hình 4.3) bp M 6000 3000 1000 1000 1000 1000 Hình 4.2 Kết tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp M: thang DNA chuẩn 1kb; đường chạy số 1: plasmid tách từ khuẩn lạc xanh; đường chạy số 3: plasmid tách từ khuẩn lạc trắng 35 bp M 6000 3000 1000 1000 1000 - Gen PETase 1000 Hình 4.3 Kiểm tra sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp enzyme NdeI BamHI M: thang DNA chuẩn kb; đường chạy số 2: plasmid có khả mang gen chèn vào cắt kiểm tra NdeI BamHI Kết Hình 4.3 cho thấy đường chạy 2, mẫu DNA plasmid sau xử lý enzyme giới hạn NdeI BamHI xuất băng: băng thứ có kích thước 2705 bp vector pBT nguyên gốc mở vịng thành dạng mạch thẳng; băng thứ hai có kích thước khoảng 900 bp tương đương với kích thước sản phẩm PCR so với thang DNA chuẩn Như vậy, bước đầu nhận định dịng tế bào đường chạy số (Hình 4.3) có khả chứa gen mã hoá cho PETase vector tái tổ hợp đặt tên PETase- pBT 36 4.1.3 Kết xác định trình tự gen mã hố cho PETase Plasmid tái tổ hợp có khả mang gen mã hoá cho PETase tiến hành kiểm tra xác định trình tự gen Mồi sử dụng để đọc kiểm tra từ đầu đoạn gen thiết kế tổng hợp enzyme cắt giới hạn mang mã khởi đầu kết thúc NdeI EcoRI Kết xác định trình tự xử lý phần mềm tin sinh BioEdit (Hình 4.4) Hình 4.4 Phổ trình tự nucleotide đoạn gen mã hố cho PETase 37 BBYR01000074.1 PETase BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 4.1 PETase 4.1 BBYR01000074.1 PETase 4.1 4.1 4.1 Hình 4.1 4.5 Trình tự nucleotide gen mã hố cho PETase với trình tự gen ngân hàng Genbank 38 Kết Hình 4.4 Hình 4.5 có độ tương đồng 79.26% so với trình tự nucleotide PETase tìm thấy Genbank với số đăng ký BBYR01000074.1 Tuy có sai khác trình tự nucleotide so với trình tự gốc mã hố cho axit amin không thay đổi Kết khẳng định gen mã hố cho PETase dịng hố vào vector pBT Để tiến hành biểu gen vi khuẩn E.coli, gen mã hoá cho PETase chuyển từ vector tái tổ hợp pBT – PETase sang hệ vector pET22b(+) Tổ hợp gen PETasepET22b(+) tiếp tục biến nạp vào tế bào E.coli BL21(DE3) để biểu PETase 4.2 Biểu PETase tái tổ hợp 4.2.1 Thiết kế vector biểu PETase – pET22b(+) Để tạo dịng vector có khả biểu cho PETase, cần phải đưa đoạn gen mã hoá cho PETase vào vùng đa điểm cắt vector pET22b(+), gen PETase đưa vào vector pET22b(+) vị trí NdeI BamHI Plasmid tái tổ hợp PETase – pBT vector pET22b(+) xử lý với hai enzyme giới hạn NdeI BamHI để tạo đầu dính tương hợp đoạn gen cần chèn vector Sản phẩm phản ứng cắt điện di kiểm tra gel agarose 0,8% (Hình 4.6 4.7) bp M 6000 3000 1000 1000 1000 - Gen PETase 1000 Hình 4.6 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen plasmid tái tổ hợp PETase-pBT 39 M: Thang DNA chuẩn 1kb; Đường chạy số 1: plamsid tái tổ hợp PETase – pBT cắt enzyme NdeI BamHI Kết Hình 4.6 sản phẩm plasmid tái tổ hợp PETase – pBT sau xử lý enzyme giới hạn NdeI BamHI cho thấy, đường chạy số xuất băng: băng có kích thước 2700 bp vector pBT bị cắt văng băng thấp có kích thước khoảng 900 bp tương đương với sản phẩm PCR đường chạy số (Hình 4.1) gen mã hoá cho PETase bp M pET22b(+) 6000 3000 1000 1000 1000 1000 Hình 4.7 Hình ảnh điện di phản ứng cắt gen mở vòng vector pET22b(+) M: Thang DNA chuẩn 1kb; Đường chạy số 1: Vector pET22b(+) cắt mở vòng enzyme NdeI Bam HI Kết Hình 4.7 sản phẩm vector pET22b(+) sau xử lý enzyme giới hạn NdeI BamHI cho thấy đường chạy số có băng DNA có kích thước 5500 bp tương ứng với vector pET22b(+) mở vòng 40 M Hình 4.8 Hình ảnh kiểm tra kết DNA khỏi gel agarose M: Thang DNA chuẩn 1kb; đường chạy số 1: gen PETase sau gel; đường chạy số 2: vector pET22b(+) chưa cắt gen mở vòng; đường chạy số 3: vector pET22b(+) mở vịng sau thơi gel Các sản phẩm cắt sau tinh kit chuẩn QIAGEN để tách vector pET22b(+) gen đích mô tả phần phương pháp Kết điện di kiểm tra sản phẩm thơi gel (Hình 4.6) cho thấy, băng DNA đạt độ tinh cần thiết để thực thí nghiệm Sau tinh từ gel agarose, gen mã hoá cho PETase vector pET22b(+) ghép nối với nhờ enzyme T4 DNA ligase Sản phẩm gắn kết biến nạp vào chủng E.coli DH5α để chọn dòng vector pET22b(+) có chứa gen mã hố cho PETase Vector ký hiệu PETase – pET22b(+) sau biến nạp vào chủng E.coli BL21(DE3) để biểu 41 4.2.2 Biểu PETase tái tổ hợp Do đơn giản tiện lợi nên E.coli hệ biểu sử dụng rộng rãi để tạo lượng lớn protein ngoại lai Đây tế bào chủ biểu mà gen chúng có chứa gen T7-RNA polymerase kiểm soát gen LacUV5 cảm ứng tiến hành cách bổ sung isopropyl βD- thiogalactosidase (IPTG) Lúc tế bào chủ xảy trình phiên mã dịch mã để sinh tổng hợp nên phân tử protein nghiên cứu Tế bào E.coli BL21(DE3) chứa tổ hợp gen PETase - pET22b(+) nuôi cấy mơi trường LB đặc sau chuyển sang mơi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh ampicillin đến nồng độ cuối 100 µg/ml Dịch tế bào sau cấy chuyển với tỷ lệ 1%, nuôi lắc 37oC đến OD600nm đạt từ 0,6 – 0,8 cảm ứng IPTG đến nồng độ cuối 0,4 mM Sinh khối tế bào thu thời điểm 0h ( trước cảm ứng) 3h ( sau cảm ứng) để tiến hành điện di kiểm tra biểu protein dung hợp Protein tổng số biểu từ dòng tế bào cảm ứng đối chứng không cảm ứng dòng tế bào kiểm tra điện SDS – PAGE 12,6% (Hình 4.7) Kết điện di Hình 4.7 cho thấy, đường chạy 3h protein tổng số thời điểm 3h sau cảm ứng IPTG, xuất băng protein so với đường chạy 0h protein tổng số thời điểm trước cảm ứng, có kích thước khoảng 28 kDa so với thang protein chuẩn 42 kDa M 0h 3h 116 1000 66,2 1000 45 1000 35 Protein 1000 25 - 1000 18,4 14,4 1000 1000 Hình 4.9 Biểu protein dung hợp PETase – pET22b(+) M: Thang protein chuẩn SM0431; Đường chạy 0h: protein tổng số thời điểm (trước cảm ứng); Đường chạy 3h: protein tổng số thời điểm ( sau cảm ứng) Protein kiểm tra điện di SDS-PAGE gel 12,6% điều kiện phòng Như hệ biểu vector pET22b(+) mang gen PETase hoạt động biểu chủng E.coli BL21(DE3) dẫn đến sinh tổng hợp loại protein 43 V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết thu trên, chúng tơi có số kết luận sau: ❖ Đã thực tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hoá gen PETase nằm vector pET22b(+) với kích thước 890 bp ❖ Đã biểu Protein tái tổ hợp chủng E.coli BL21(DE3) có kích thước khoảng 28 kDa 5.2 Kiến nghị Do thời gian điều kiện nghiên cứu có hạn nên chưa thể thực đánh giá khảo sát điều kiện biểu protein PETase Vì chúng tơi có số kiến nghị sau: ❖ Tiếp tục nghiên cứu khảo sát điều kiện nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng IPTG thời gian cảm ứng để lựa chọn điều kiện tối ưu khả biểu PETase ❖ Ứng dụng thử hoạt tính PETase vào q trình thuỷ phân nhựa PET 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt Asia, E., Region, P., & Series, M P (2020) Phân tích nhiễm rác thải nhựa việt nam Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Diệp Linh, Đỗ Thị Hồng Uyên (2021) Vấn đề rác thải nhựa Việt Nam OSF Preprints, 8–11 Tạ Việt Phương 2019 Báo Cáo Ngành Nhựa Cơng ty chứng khốn FPT (8424): 64 Võ Thị Hai, Hoàng Ngọc Cường (2008) Phản ứng cắt mạch polyethylene terephtalate (PET) từ vỏ chai dietylene glycol (DEG) Phạm Văn Đan Thuỷ, Trương Hà Phương Ân, Nguyễn Thanh Việt (2011) Tái Chế Nhựa Polyethylene Terephthalate (PET) Và Ứng Dụng Nhựa Đã Qua Tái Chế Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần thơ 13(1): 26–35 Trần Thị Thu Trang (2017) Báo Cáo Ngành Nhựa Việt Nam Trần Thu Hương.(2020) Nghiên Cứu Khảo Sát Hiện Trạng Chất Thải Nhựa Tại Việt Nam Plastic Smartcities WWF Tài liệu tham khảo Tiếng anh ACRR (2004) Good Practice Guide on Waste Plastics Recycling A Guide by and for Local and Regional Authorities 99 Aging, Thermo-oxidative.(2021) Properties of Polyethylene Terephthalate (PET) after Thermo-Oxidative Aging Materials 14(14): 3833 Al-Sabagh, A M., Yehia, F Z., Eshaq, G., Rabie, A M., & ElMetwally, A E (2016) Greener routes for recycling of polyethylene terephthalate Egyptian Journal of Petroleum, 25(1), 53–64 Benavides, P T., Dunn, J B., Han, J., Biddy, M., & Markham, J (2018) Exploring Comparative Energy and Environmental Benefits of Virgin, Recycled, and BioDerived PET Bottles ACS Sustainable Chemistry and Engineering, 6(8), 9725–9733 Bornscheuer, U T Feeding on plastic Science 351, 1154-1155 (2016) Chau, M Q., Hoang, A T., Truong, T T., & Nguyen, X P (2020) Endless story about the alarming reality of plastic waste in Vietnam Energy Sources, Part A: Recovery, Utilization and Environmental Effects, 00(00), 1–9 Chen, C C., Han, X., Ko, T P., Liu, W., & Guo, R T (2018) Structural studies reveal the molecular mechanism of PETase FEBS Journal, 285(20), 3717–3723 Crawford, C B., & Quinn, B (2017) Physiochemical properties and degradation In Microplastic Pollutants Drzyzga, O., & Prieto, A (2019) Plastic waste management, a matter for the ‘community.’ Microbial Biotechnology, 12(1), 66–68 10 Fecker, T., Galaz-Davison, P., Engelberger, F., Narui, Y., Sotomayor, M., Parra, L P., & Ramírez-Sarmiento, C A (2018) Active Site Flexibility as a Hallmark for Efficient PET Degradation by I sakaiensis PETase Biophysical Journal, 114(6), 1302–1312 11 Goverment-UK.(2012) Different Plastic Polymer Types Ryedale District Council 2020: 1–2 45 12 Graf, L G., Michels, E A P., Yew, Y., Liu, W., Palm, G J., & Weber, G (2021) Structural analysis of PET-degrading enzymes PETase and MHETase from Ideonella sakaiensis In Methods in Enzymology (1st ed., Vol 648) Elsevier Inc 13 Han, X., Liu, W., Huang, J W., Ma, J., Zheng, Y., Ko, T P., Xu, L., Cheng, Y S., Chen, C C., & Guo, R T (2017) Structural insight into catalytic mechanism of PET hydrolase Nature Communications, 8(1) 14 Jambeck, J., Geyer, R., Wilcox, C., Siegler, T R., Perryman, M., Andrady, A., Narayan, R., & Law, K L (2015) the Ocean : the Ocean : Marine Pollution, 347(6223), 768- 15 Joo, S., Cho, I J., Seo, H., Son, H F., Sagong, H Y., Shin, T J., Choi, S Y., Lee, S Y., & Kim, K J (2018) Structural insight into molecular mechanism of poly(ethylene terephthalate) degradation Nature Communications, 9(1) 16 Kawai, F., Kawabata, T., & Oda, M (2019) Current knowledge on enzymatic PET degradation and its possible application to waste stream management and other fields Applied Microbiology and Biotechnology, 103(11), 4253–4268 17 Kent Academic Repository School of Biosciences (2021) Towards the biological degradation of plastics: Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae to secrete Ideonella sakaiensis derived PETase 18 Kim, J W., Park, S Bin, Tran, Q G., Cho, D H., Choi, D Y., Lee, Y J., & Kim, H S (2020) Functional expression of polyethylene terephthalate-degrading enzyme (PETase) in green microalgae Microbial Cell Factories, 19(1), 1–9 19 Knott, B C., Erickson, E., Allen, M D., Gado, J E., Graham, R., Kearns, F L., Pardo, I., Topuzlu, E., Anderson, J J., Austin, H P., Dominick, G., Johnson, C W., Rorrer, N A., Szostkiewicz, C J., Copié, V., Payne, C M., Woodcock, H L., Donohoe, B S., Beckham, G T., & McGeehan, J E (2020) Characterization and engineering of a two-enzyme system for plastics depolymerization Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 117(41), 25476–25485 20 Minh, N D., Nguyen, N D., & Cuong, P K (2019) Applying lean tools and principles to reduce cost of waste management: An empirical research in Vietnam Management and Production Engineering Review, 10(1), 37–49 21 Ma, Y., Yao, M., Li, B., Ding, M., He, B., Chen, S., Zhou, X., & Yuan, Y (2018) Enhanced Poly(ethylene terephthalate) Hydrolase Activity by Protein Engineering Engineering, 4(6), 888–893 22 Minh, N D., Nguyen, N D., & Cuong, P K (2019) Applying lean tools and principles to reduce cost of waste management: An empirical research in Vietnam Management and Production Engineering Review, 10(1), 37–49 23 Müller, R J., Schrader, H., Profe, J., Dresler, K., & Deckwer, W D (2005) Enzymatic degradation of poly(ethylene terephthalate): Rapid hydrolyse using a hydrolase from T fusca Macromolecular Rapid Communications, 26(17), 1400–1405 24 Nardini, M., & Dijkstra, B W (1999) α/β hydrolase fold enzymes: The family keeps growing Current Opinion in Structural Biology, 9(6), 732–737 25 Nisticò, R (2020) Polyethylene terephthalate (PET) in the packaging industry Polymer Testing, 90(April) 26 Palm, G J., Reisky, L., Böttcher, D., Müller, H., Michels, E A P., Walczak, M C., 46 Berndt, L., Weiss, M S., Bornscheuer, U T., & Weber, G (2019) Structure of the plastic-degrading Ideonella sakaiensis MHETase bound to a substrate Nature Communications, 10(1), 1–10 27 Puspitasari, N., Tsai, S L., & Lee, C K (2021) Fungal Hydrophobin RolA Enhanced PETase Hydrolysis of Polyethylene Terephthalate Applied Biochemistry and Biotechnology, 193(5), 1284–1295 28 Ragaert, K., Delva, L., & Van Geem, K (2017) Mechanical and chemical recycling of solid plastic waste Waste Management, 69, 24–58 29 Seo, H., Kim, S., Son, H F., Sagong, H Y., Joo, S., & Kim, K J (2019) Production of extracellular PETase from Ideonella sakaiensis using sec-dependent signal peptides in E coli Biochemical and Biophysical Research Communications, 508(1), 250–255 30 Silva, C., Da, S., Silva, N., Matamá, T., Araújo, R., Martins, M., Chen, S., Chen, J., Wu, J., Casal, M., & Cavaco-Paulo, A (2011) Engineered Thermobifida fusca cutinase with increased activity on polyester substrates Biotechnology Journal, 6(10), 1230–1239 31 Sulyman, M., Haponiuk, J., & Formela, K (2016) Utilization of Recycled Polyethylene Terephthalate (PET) in Engineering Materials: A Review International Journal of Environmental Science and Development, 7(2), 100–108 32 Taniguchi, I., Yoshida, S., Hiraga, K., Miyamoto, K., Kimura, Y., & Oda, K (2019) Biodegradation of PET: Current Status and Application Aspects ACS Catalysis, 9(5), 4089–4105 33 United Nations Environment Programme (2009) Converting Waste Plastics into a Resource Compendium of Technologies United Nations Environmental Programme, 1–51 34 Wyeth, N C., Mendenhall, P., & Roseveare, R N (1973) Biaxially oriented poly(ethylene terephthalate) bottle United Patent Office, 1–6 35 Yoshida, S., Hiraga, K., Takehana, T., Taniguchi, I., Yamaji, H., Maeda, Y., Toyohara, K., Miyamoto, K., Kimura, Y., & Oda, K (2016) A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate) Science, 351(6278), 1196– 1199 36 Yoshida, S., Hiraga, K., Taniguchi, I., & Oda, K (2021) Ideonella sakaiensis, PETase, and MHETase: From identification of microbial PET degradation to enzyme characterization In Methods in Enzymology (1st ed., Vol 648) Elsevier Inc 37 Zhang, R., Ma, X., Shen, X., Zhai, Y., Zhang, T., Ji, C., & Hong, J (2020) PET bottles recycling in China: An LCA coupled with LCC case study of blanket production made of waste PET bottles Journal of Environmental Management, 260(January), 110062 47 PHỤ LỤC Hình phụ Kết biến nạp sản phẩm ghép nối vector pBT gen PETase Đĩa cấy 110 µl khuẩn mơi trường LB đặc có sử dụng X-gal Đĩa mọc khuẩn, có khuẩn xanh khuẩn trắng Khuẩn xanh khuẩn không mang vector tái tổ hợp pBT – PETase Còn khuẩn trắng khuẩn có khả mang vector tái tổ hơp pBT – PETase Những khuẩn trắng tiến hành điện di DNA để kiểm tra tính xác 48