luận văn thạc sĩ sinh học :Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit

Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - - Nguyễn Ngọc Sơn TÁCH DỊNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -  - NGUYỄN NGỌC SƠN TÁCH DỊNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tác giả Nguyễn Ngọc Sơn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Trung Nam (Viện Công nghệ Sinh học) tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà, TS Nguyễn Hữu Cường, KS Hoàng Thị Thu Hằng tập thể cán Phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ suốt thời gian thực nghiệm hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới TS Nguyễn Như Cường (Viện Bảo vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học virut gây bệnh môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, biện pháp quản lý tổng hợp trồng (ICM) sản xuất lúa” cung cấp mẫu bệnh cộng tác q trình tơi thực cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN, thày cô giáo, cán Khoa truyền đạt kiến thức tạo điều kiện cho thực khóa luận Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tác giả luận văn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 11 1.1.1 Thế giới 11 1.1.2 Việt Nam 12 1.2 TRIỆU CHỨNG LÖA NHIỄM BỆNH VL&LXL 13 1.3 ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA 14 1.3.1 Virut vàng lùn lúa (RGSV) 14 1.3.2 Các loại virut khác 16 1.3.2.1 Virut lùn xoắn lúa (RRSV) 16 1.3.2.2 Virut tungro hình cầu (RTSV) 17 1.3.2.3 Virut tungro hình nhộng (RTBV) 18 1.4 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA RẦY NÂU – MÔI GIỚI CHỦ YẾU TRUYỀN BỆNH VL&LXL 19 1.4.1 Đặc điểm hình thái 19 1.4.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái gây hại 19 1.5 PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL 20 1.6 MỘT SỐ ENZYM VÀ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUT 21 1.6.1 Một số enzym sử dụng sinh học phân tử 21 1.6.2 Kỹ thuật RT-PCR 22 1.6.3 Kỹ thuật PCR 23 1.6.4 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli 24 1.6.5 Kỹ thuật tách dòng gen 24 1.6.6 Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 25 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 VẬT LIỆU 26 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM 27 2.2.1 Hóa chất 27 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.2 Thiết bị 27 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 27 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.3.1 Thu mẫu thí nghiệm 27 2.3.2 Thiết kế mồi đặc hiệu 28 2.3.3 Tách chiết RNA tổng số virut lúa 28 2.3.4 Phản ứng RT-PCR 29 2.3.5 Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) 29 2.3.6 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt 30 2.3.7 Colony-PCR 31 2.3.8 Tách chiết plasmit 32 2.3.9 Cắt gen enzym giới hạn 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 THIẾT KẾ MỒI 34 3.2 TÁCH DÕNG CÁC ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 34 3.2.1 RT-PCR 34 3.2.2 Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 37 3.2.3 Chọn lọc plasmit tái tổ hợp colony-PCR 37 3.2.4 Tách plasmit cắt kiểm tra có mặt gen 39 3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 40 3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CƠNG BỐ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ RNA thông tin) CS Cộng CLRRI Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng sông Cửu Long), http://www.clrri.org CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid DPV Description of Plant Viruses (Miêu tả virus thực vật), http://www.dpvweb.net EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễm dịch liên kết với enzym) g gram ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế phân loại virus) ICTVdB The Universal Virus Database of the International Committee on Taxonomy of Viruses (Ngân hàng liệu virus ICTV), http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế), http://www.irri.org Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kb Kilobase LB Luria Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia thông tin Công nghệ Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân RNA tạo phân tử RNA) RGSV Rice grassy stunt virus (Virut vàng lùn lúa) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RRSV Rice ragged stunt virus (Virut lùn xoắn lúa) RSV Rice stripe virus RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngƣợc) RTBV Rice tungro bacilliform virus (Virut tungro hình nhộng) RTSV Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu) RWSV Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút vcRNA viral complementary RNA (đoạn RNA bổ sung virus) VL&LXL Vàng lùn, lùn xoắn vRNA viral RNA (đoạn RNA virus) X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Trình tự mồi sử dụng để nhân số đoạn genome RGSV… 34 Bảng 3.2 Mã số đăng ký GenBank trình tự thu đƣợc 41 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng sai khác trình tự nucleotit gen CPRGSV Bình Thuận, Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng tỉnh ĐBSCL giới (GenBank) 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi 13 Hình 1.2 RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 15 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc gen RGSV 16 Hình 1.4 RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 17 Hình 1.5 RTSV RTBV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử 18 Hình 1.6 Các giai đoạn phát triển rầy nâu 19 Hình 2.1 Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL Nam Trung Bộ 26 Hình 2.2 Sơ đồ vectơ pBT 30 Hình 3.1 Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn RGSV từ mẫu tỉnh Bình Thuận cặp mồi RNA1-RGSV RNA4-RGSV 35 Hình 3.2 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV 36 Hình 3.3 Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP RGSV cặp mồi CP-RGSV 36 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học (IBT) Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái... gen 39 3.3 XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT CỦA MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA RGSV 40 3.4 SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG... hành đề tài : “Tách dịng xác định trình tự nucleotit số đoạn genome virut vàng lùn lúa (RGSV) Việt Nam” Mục tiêu Phân lập so sánh trình tự nucleotit số đoạn genome virut vàng lùn lúa (RGSV) Nội