Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong gen của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam

Mục tiêu

Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Tách dòng và xác định trình tự nucleotit một số đoạn trong genome của virut vàng lùn lúa (RGSV) tại Việt Nam”.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Thu mẫu thí nghiệm

Trước khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số hiệu của gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi có đƣợc trình tự của gen quan tâm, các đoạn primer sẽ được thiết kế bằng việc sử dụng các chương trình thiết kế. ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. RNA tổng số từ các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết theo hướng dẫn sử dụng hóa chất trizol reagents. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE [45], nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide và thôi gel bằng bộ Kit của QIAGEN.

Sản phẩm PCR của gen quan tâm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% và đƣợc làm sạch theo bộ kit QIAquick Gel Extraction rồi gắn vào vectơ tách dòng pBT (Hình 2.2). Vectơ tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và được cấy trải trên môi trường LB đặc cú bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100àM. Nguyên lý của khuẩn lạc xanh và trắng: Toàn bộ khuẩn lạc phát triển trên môi trường có ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit (vectơ).

Những khuẩn lạc xanh xuất hiện do trong vectơ mang gen lac-operon hoạt động bình thường, không có đoạn gen được xen vào, khi có chất cảm ứng của IPTG sẽ tổng hợp enzym β-galactosidase, enzym này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có mầu xanh. Còn những khuẩn lạc trắng có thể là do nhận đƣợc plasmit mang lac-operon không hoạt động, chính vì vậy khi có chất cảm ứng IPTG thì gen không tổng hợp enzym β-galactosidase và không xảy ra hiện tƣợng chuyển hóa X-gal. Khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đƣợc chọn lọc và đánh số thứ tự, thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang gen quan tâm.

Bước đầu tiên trong quá trình cắt gen bằng enzym giới hạn, chúng ta phải xác định những enzym có thể sử dụng để cắt đƣợc đoạn gen quan tâm. Những enzym đƣợc lựa chọn là những enzym dự tính không có điểm cắt trên đoạn gen quan tâm, không có quá nhiều vị trí cắt trên vectơ. Sau khi đã xác định đƣợc enzym cắt giới hạn, đối chiếu với bảng enzym để xác định đƣợc đệm phù hợp nhất, cho khả năng cắt cao nhất.

Tiến hành cắt enzym, cho lần lƣợt các thành phần theo thứ tự: Đệm cho enzym cắt, chất phụ trợ (nếu có), plasmit, enzym. Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong vector tách dòng pBT [4] và biến nạp vào tế bào khả biến E. Chọn các mẫu plasmit tái tổ hợp có kích thước như mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

• THIẾT KẾ MỒI

Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu với phân đoạn 1 và phân đoạn 4 của RGSV là RNA1-RGSV và RNA4-RGSV với mẫu RNA phân lập từ lúa của tỉnh Bình Thuận đều thu được các băng điện di có kích thước nhƣ mong muốn. Như vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi CP-RGSV-xuôi và CP-RGSV-ngƣợc với các mẫu lúa BĐ và NT, chỉ mẫu NT thu đƣợc băng có kích thước phù hợp với đoạn gen CP của RGSV. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR với 3 cặp mồi đặc hiệu (bảng 3.1) và điện di trên gel agarose chỉ thu được các băng có kích thước phù hợp với gen CP-RGSV tại mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận và băng có kích thước.

Để kiểm tra các khuẩn lạc trắng chứa plasmit mang đoạn DNA quan tâm, chúng tôi lựa chọn từ mỗi đĩa khuẩn một số khuẩn lạc trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. Kết quả điện di trên hình 3.5 cho thấy tại giếng đối chứng dương xuất hiện băng điện di có kích thước khoảng 0,6Kb đây là kích thước của đoạn DNA đã xác định trong plasmit sử dụng để PCR, giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng không lây nhiễm DNA, phản ứng diễn ra đạt yêu cầu. Sau khi chọn khuẩn lạc trắng tương ứng với các giếng sản phẩm colony-PCR có kích thước như mong muốn và nuôi trong 3ml LB lỏng trong 16 giờ, chúng tôi tiến hành tách plasmit theo bộ kit QIAprep Spin Miniprep nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.8.

Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit mang gen CP của RGSV bằng BamHI (Hình 3.8) cho thấy, các giếng plasmit không cắt chỉ xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 3,7Kb chứng tỏ plasmit đã tinh sạch và có chất lƣợng tốt. Các giếng số 1, 2 đều xuất hiện 2 băng: một băng có kích thước khoảng 2,7Kb phù hợp với kích thước của vectơ pBT và một băng có kích thước khoảng 1Kb phù hợp với kích thước đoạn DNA mong muốn. Hệ số tương đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tương ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank).

Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Bootstrap của phần mềm MEGA4 sử dụng kết quả so sánh ClustalW trình tự các gen CP-RGSV của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự của một số trình tự tương ứng đại diện cho các dòng RGSV khác nhau tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.9). Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh 02 trình tự nucleotit của gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (Ninh Thuận, Bình Thuận) với các trình tự tương ứng của ĐBSCL và thế giới công bố trên GenBank. Nhánh gồm các trình tự của Việt Nam lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ, trong đó hai trình tự gen phân lập tại hai tỉnh Nam Trung Bộ thuộc nhánh nhỏ thứ hai gồm các trình tự: VL1, VL2, BL2, TG2, DT1, TV2 (ĐBSCL) và NT, BT (Nam Trung Bộ).

Nhƣ vậy, hai dòng RGSV phân lập từ các tỉnh Nam Trung Bộ có quan hệ gần gũi với các dòng RGSV phân lập từ ĐBSCL, đặc biệt là với tỉnh Vĩnh Long và có sự khác biệt nhỏ với nhóm của thế giới. Vì vậy, có thể giả thiết rằng các chủng virut RGSV phân lập đƣợc từ Ninh thuận và Bình Thuận có quan hệ về nguồn gốc với các trình tự của gen CP- RGSV phân lập từ ĐBSCL. Nhƣ vậy, một lần nữa khẳng định mối quan hệ về nguồn gốc giữa 2 dòng RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với các dòng thuộc khu vực ĐBSCL, đặc biệt là với dòng của tỉnh Vĩnh Long.

4> So sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với trình tự tương ứng của Trung Quốc thấy 20 điểm sai khác phân bố khá đều trên gen và dẫn đến 2 sự sai khác có ý nghĩa trong hai chuỗi polypeptit do gen này mã hóa. Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hữu Cường, Hoàng Thị Nga, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Như Cường (2009), Kiểm tra sự có mặt của virut gây bệnh vàng lùn lúa (RGSV) trong rầy nâu tại các tỉnh Nam Trung Bộ bằng RT-PCR.