BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK
Kết quả ở bảng 3.3, hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là rất cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất với trình tự VL2 (EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự CN(AF290947) của Trung Quốc (98,0%).
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CP- RGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh ĐBSCL và thế giới (GenBank).
AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2, BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà
Hệ số tƣơng đồng Hệ s ố sa i khá c
Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Bootstrap của phần mềm MEGA4 sử dụng kết quả so sánh ClustalW trình tự các gen CP-RGSV của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự của một số trình tự tƣơng ứng đại diện cho các dòng RGSV khác nhau tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.9).
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh 02 trình tự nucleotit của gen CP- RGSV Nam Trung Bộ (Ninh Thuận, Bình Thuận) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL và thế giới công bố trên GenBank.
Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng trên cơ sở so sánh 23 trình tự (Nam Trung Bộ (2), ĐBSCL(18) và thế giới (3)) gen CP-RGSV lấy từ GenBank. Thanh bar trình bày số thay thế nucleotide. Các số trên mỗi đốt của cây phát sinh chủng loại là giá trị bootstrap tính theo phần trăm (1000 lần lặp lại). Chỉ những giá trị bootstrap > 50% đƣợc chỉ ra trên hình. AG(GQ306203): An Giang, BL1(EU076531): Bạc Liêu1, BL2(EU976532): Bạc Liêu2,
BT(FM882251): Bình Thuận, CT1(EU076533): Cần Thơ1, CT2(EU076534): Cần Thơ2, CN(AF290947): Trung Quốc, DT1(EU076535): Đồng Tháp1, DT2(EU076536): Đồng Tháp2, HG(GQ329709): Hậu Giang; JP(AB000403): Nhật Bản, JP(AB023779): Nhật Bản, LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận, ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542): Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2.
Qua hình 3.9 thấy rằng cây phát sinh chủng loại đƣợc chia thành hai nhánh chính là: nhánh gồm các trình tự gen CP-RGSV của thế giới và nhánh gồm các trình tự gen CP-RGSV của Việt Nam. Nhánh gồm các trình tự của Việt Nam lại đƣợc chia thành hai nhánh nhỏ, trong đó hai trình tự gen phân lập tại hai tỉnh Nam Trung Bộ thuộc nhánh nhỏ thứ hai gồm các trình tự: VL1, VL2, BL2, TG2, DT1, TV2 (ĐBSCL) và NT, BT (Nam Trung Bộ). Nhƣ vậy, hai dòng RGSV phân lập từ các tỉnh Nam Trung Bộ có quan hệ gần gũi với các dòng RGSV phân lập từ ĐBSCL, đặc biệt là với tỉnh Vĩnh Long và có sự khác biệt nhỏ với nhóm của thế giới. Vì vậy, có thể giả thiết rằng các chủng virut RGSV phân lập đƣợc từ Ninh thuận và Bình Thuận có quan hệ về nguồn gốc với các trình tự của gen CP- RGSV phân lập từ ĐBSCL. Đồng thời, có thể thấy rằng các dòng virut phân lập tại Việt Nam (ĐBSCL và Nam Trung Bộ) đều có nguồn gốc nội địa, nhƣ vậy dịch bệnh VL&LXL tại các khu vực nghiên cứu của Việt Nam do virut nội địa gây ra chứ không phải do virut ngoại lai xâm nhập vào.
Căn cứ vào hệ số tƣơng đồng và mối quan hệ giữa các trình tự của gen CP- RGSV (bảng 3.3 và hình 3.9) thấy rằng hai trình tự của Ninh Thuận và Bình Thuận giống nhất với trình tự VL2 của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự của Trung Quốc (CN- AF290947). Vì vậy chúng tôi lần lƣợt so sánh 2 trình tự trên với trình tự VL2 và trình tự của Trung Quốc nhằm phân tích mức độ đa dạng ở cấp độ nucleotit để đánh giá mức ý nghĩa của những sai khác ở trên.
Từ quả kết quả phân tích bằng phần mềm DNAsp thấy hai trình tự của gen CP- RGSV là Bình Thuận và Vĩnh Long2 khác nhau 01 vị trí, tại cặp nucleotit thứ 93. Đồng thời, hai trình tự Ninh Thuận và Vĩnh Long2 cũng chỉ khác nhau tại vị trí cặp nucleotit thứ 585. Sự sai khác tại 01 vị trí giữa trình tự Bình Thuận và Long An2 không ảnh hƣởng tới thành phần và số lƣợng axit amin trong chuỗi polypeptit do 2 trình tự trên mã hóa. Kết quả này cũng tƣơng tự với 2 trình tự Ninh Thuận và Vĩnh Long2. Nhƣ vậy, một lần nữa khẳng định mối quan hệ về nguồn gốc giữa 2 dòng RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với các dòng thuộc khu vực ĐBSCL, đặc biệt là với dòng của tỉnh Vĩnh Long.
Mặt khác, khi so sánh trình tự gen CP- RGSV của Bình Thuận và Trung Quốc khác nhau tại 20 vị trí. Các vị trí khác biệt không tập trung tại một vùng gen mà tại nhiều vị trí khác nhau trên cả đoạn gen. Khi so sánh trình tự gen CP- RGSV của Ninh Thuận và Trung Quốc cũng khác nhau tại 20 vị trí. Đồng thời các vị trí khác biệt cũng không tập trung tại 1 khu vực mà trải đều trên gen.
Mặc dù số vị trí sai khác là rất lớn (20/978 = 2,05%), nhƣng cả trình tự của Bình Thuận và Ninh Thuận khi so sánh với trình tự của Trung Quốc trong 20 vị trí bị biến đổi chỉ 2 vị trí làm thay đổi axit amin trong chuỗi polypeptit của gen CP gồm các axit amin số 19 và 221. Nhƣ vậy, mức độ ảnh hƣởng từ sự sai khác trong gen đến sản phẩm protein là không nhiều. Tuy nhiên, vẫn có thể cho rằng sự sai khác giữa các trình tự của gen CP- RGSV là có ý nghĩa. Điều này cũng khẳng định rằng gen CP- RGSV có độ bảo thủ khá cao.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1> Đã hoàn thiện và tối ƣu phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu để phát hiện virut RGSV với độ đặc hiệu cao.
2> Đã tách dòng, xác định trình tự các phân đoạn 1, 4 RGSV của mẫu lúa Bình Thuận và gen CP- RGSV từ mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận. Kích thƣớc của gen CP đã đƣợc xác định trình tự đầy đủ là 978 nucleotit, của các phân đoạn 1 và 4 lần lƣợt là 423 và 441 nucleotit. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự thu đƣợc là: FM995215, FN179368, FM882251, FM882252.
3> Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là rất cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất với trình tự VL2 (EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự CN(AF290947) của Trung Quốc (98,0%).
4> So sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với trình tự tƣơng ứng của Trung Quốc thấy 20 điểm sai khác phân bố khá đều trên gen và dẫn đến 2 sự sai khác có ý nghĩa trong hai chuỗi polypeptit do gen này mã hóa.
2. Đề nghị
1> Tiếp tục phân lập các phân đoạn khác trong genome của RGSV và của các chủng virut khác gây bệnh VL&LXL (RRSV, RTSV, RTBV).
2> Nghiên cứu sự có mặt của các chủng virut trên trong rầy nâu nhằm tăng khả năng cảnh báo sự xuất hiện bệnh tại các tỉnh trên.
CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ
1. Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Nhƣ Cƣờng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Nguyễn Trung Nam (2008), Quan hệ di truyền giữa các chủng virut gây bệnh vàng lùn ở lúa tại các tỉnh Nam Trung bộ, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 301-309.
2. Nguyễn Ngọc Sơn, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Hữu Cƣờng, Hoàng Thị Nga, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Đặng Thị Lan Anh, Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Nhƣ Cƣờng (2009), Kiểm tra sự có mặt của virut gây bệnh vàng lùn lúa (RGSV) trong rầy nâu tại các tỉnh Nam Trung Bộ bằng RT-PCR. Tạp chí Bảo vệ thực vật, 1: 23- 27.
3. Nguyen Trung Nam, Hoang Thi Thu Hang, Chu Hoang Ha, Nguyen Huu Cuong, Dang Thi Lan Anh, Nguyen Nhu Cuong, Nguyen Ngoc Son, Hoang Thi Nga, Hoang The Hung, Le Tran Binh (2009), Detection of rice ragged stunt virus (RRSV) in Vietnamese rice using RT-PCR and DNA sequencing. Proceeding of the
Analytical Vietnam Conference 2009: 233- 240.
4. Nguyen, S.N. et al. (2008, 2009), Các trình tự DNA của virus RGSV đã đăng ký trên GenBank với mã số FM882251, FM882252, FM956076, FM958187, FM995215, FM994933, FM995502, FM995503, FM995504, FM995505, FN179368.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Bùi Bá Bổng (2006), Tổng kết hội nghị phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn và (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
lùn xoắn lánăm 2006.
2. Phạm Văn Dƣ (2007), Các giải pháp quản lý bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ lúa Hè thu năm
2007 ở Nam bộ. Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (2002), Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục.
4. Phan Trọng Hoàng, Nông Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2005), “Sử dụng enzym XcmI để thiết kế vector pBT phục vụ tách dòng và đọc trình tự gen”,
Tạp chí Công nghệ sinh học, 3: 459-463.
5. Vũ Triệu Mân (2007), Một số ý kiến về việc phòng chống bệnh lùn cỏ, vàng lùn và lùn xoắn lá ở miền Nam Việt Nam. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ
Hè Thu năm 2007 ở Nam Bộ. Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ.
6. Nguyễn Thơ (2007), Một số suy nghĩ về phòng trừ bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá
trên lúa. Các giải pháp kỹ thuật thích hợp cho vụ Hè Thu năm 2007 ở Nam Bộ.
Diễn đàn khuyến nông @ Công nghệ.
7. Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Minh Hùng, Chu Hoàng Hà, Hoàng Thị Thu Hằng, Lê Trần Bình (2007), “Đánh giá đa dạng di truyền các dòng virus gây bệnh lùn lúa cỏ tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5: 479-484.
8. Hà Minh Trung, Phạm Văn Doãn, Đặng Vũ Thị Thanh, Trần Thị Thuần, Ngô Vĩnh Viễn (1980), Kết quả nghiên cứu bệnh lúa lùn xoắn lá ở các tỉnh phía Nam
1978 – 1979/ Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật (1969 - 1979), Nhà xuất bản
Nông nghiệp.
9. Ngô Vĩnh Viễn (1994), Bệnh vàng lá lúa do virut và Mycoplasma gây ra và biện
pháp phòng trừ ở Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Viện
Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội.
10. Ngô Vĩnh Viễn (2007), Kết quả nghiên cứu và xây dựng mô hình phòng chống rầy nâu, bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá tại Long An và Bến Tre, vụ Đông Xuân 2006- 2007. Hội nghị toàn quốc tổng kết công tác Bảo vệ thực vật năm 2006, kế hoạch công tác năm 2007.
11. Ban chỉ đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL các tỉnh phía Nam (2008),
Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL ở các tỉnh phía Nam.
12. Ban chỉ đạo phòng chống rầy nâu, bệnh VL&LXL các tỉnh phía Nam (2009),
Báo cáo tình hình dịch rầy nâu, bệnh VL&LXL ở các tỉnh phía Nam.
Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
13. Azzam O., Arboleda M., Umadhay K.M.L., Cruz F.S., Mackenzie A., McNally K.L. (2000), “Genetic composition and complexity of virus populations at tungro-endemic and outbreak rice sites”, Arch Virol, 145: 2643-2657.
14. Azzam O., Imbe T., Ikeda R., Nath P.D., Coloquio E. (2001), “Inheritance of resistance to rice tungro spherical virus in a near-isogenic line derived from Utri Merah and in rice cultivar TKM6”, Euphytica, 122: 91-97. (RTSV)
15. Bao Y., and Hull R. (1992), “Characterization of the discontinuities in rice tungro bacilliform virus DNA”. J Gen Virol, 73:1297-1301.
16. Cabauatan P.Q, Hibino H., Lapis D.B. , Omura T., and Tsuchizaki T. (1985), “Transmission of rice tungro bacilliform and spherical viruses by Nephotettix virescens Distant. Philippine”, Phytopathology, 21:103-109.
17. Cabauatan P.Q., Cabunagan R.C., and Koganezawa H. (1995), “Biological variants of rice tungro viruses in the Philippines”, Phytopathology, 85:77-81. 18. Chaogang S., Jianhua W., Guoying Z., Gang S., Baozhen P., Juanli L., Dendi J.,
Shenxiang C., Upadhyaya N.M., Waterhouse P., and Zuxun G. (2003), “Ectopic expression of the spike protein of Rice Ragged Stunt Oryzavirus in transgenic rice plants inhibits transmission of the virus to insects”, Mol Breeding, 7:295- 301. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19. Chen C., and Chiu R. (1982), “Three symptomatological types of rice virus diseases related to grassy stunt in Taiwan”, Plant Dis, 66 : 5-18.
20. Chen C., Chiu R., Wang E. (1979) “Rice ragged stunt: a virus disease new to Taiwan”, Plant Prot Bull, (Taiwan) 21:447 (Abstr.).
21. Chomchan P., Li S.F., Shirako Y. (2003), “Rice Grassy Stunt Tenuivirus Nonstructural Protein p5 Interacts with Itself To Form Oligomeric Complexes In Vitro and In Vivo”, J Virol, 77: 769–775.
22. Dyck V.A., Thomas B. (1979), The brown planthopper problem. In: Brown Planthopper: Threat to Rice Production in Asia. IRRI, Philippines. pp. 3-17. 23. Druka A., Burns T., Zhang S., Hull R. (1996), “Immunological characterization
of rice tungro spherical virus coat proteins and differentiation of isolates from the Philippines and India”, J Gen Virol, 77:1975-1983.
24. Herdt R.W. (1991), Rice Biotechnology, Eds Khush & Toenniessen, pp. 19-54, CABI, Wallingford, UK.
25. Hibino H., Cabauatan P., Omura T., and Tsuchizaki T. (1985b), “Rice grassy stunt virus strain causing tungro like symptoms in the Philippines”, Plant Dis,
69:538-541.
26. Hibino H. (1996), “Biology and epidemiology of rice viruses”, Ann Rev
Phytopathol, 34:249-274.
27. Hull R. (1996), “Molecular biology of rice tungro viruses”, Ann Rev
Phytopathol, 34:275-297.
28. Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A. (1982), “Variation in the transmission rates of rice grassy stunt virus in various colonies of brown planthopper”, Proc
Assoc Plant Prot Kyushu, 28:1-3.
29. Iwasaki M., Nakano M., and Shinkai A. (1985b), “Detection of rice grassy stunt virus in planthopper vectors and rice plants by ELISA”, Ann Phytopathol Soc Jpn. 51:450-458.
30. Lin P.K.T., Brown D.M. (1992), “Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing degenerate bases and their use as primers in the polymerase chain reaction”, Nucleic Acids Res, 19:5149-5152.
31. Ling K.C., Aguiero V.M., and Lee S.H. (1970), “A mass screening method for testing resistance to grassy stunt disease of rice”. Plant Dis Rep, 56:565–569. 32. Ling K.C. (1972), Rice Virus Diseases. International Rice Research Institute,
Los Baños Philippines.
33. Mariappan V., Hibino H., and Shanmugam N. (1984), “A new rice virus disease in India”. Int Rice Res Newsl, 9:9-10.
34. Marmey P., Bothner B., Jacquot E., Kochko A.d., Ong C.A., Yot P., Siuzdak G., Beachy R.N., and Fauquet C.M. (1999), “Rice Tungro Bacilliform Virus Open Reading Frame 3 Encodes a Single 37-kDa Coat Protein”, Virolog, 253:319-326. 35. Mayo M.A., Miranda J.R.D., Falk B.W., Goldbach R., Haenni A.L., Toriyama
S. (2000), Genus Tenuivirus. In: van Regenmortel M.H.V., Fauquet C.M., Bishop D.H.L., Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R.B. (eds) Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, Academic Press, San Diego, pp 622–627
36. Milne R., Ling K. (1982), “Rice ragged stunt virus”. CMI/AAB Desc Pl
37. Miranda J.G., Aliyari R., Shirako Y. (2001), “Nucleotide sequence of a Dianthovirus RNA1-like RNA found in grassy stunt- diseased rice plants”, Arch
Virol,146: 225–238.
38. Miranda J.R.D., Wu R., Espinoza A.M. (2001), “Phylogenetic Placement of a Novel Tenuivirus from the Grass Urochloa plantaginea”, Virus Genes, 22: 329– 333.
39. Montpetit M.L., Cassol S., Salas T., and O'Shaughnessy M.V. (1992), “OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences”, J Virol Methods, 36: 119-128.
40. Palmer L.T., Soepriaman Y., Sunendar K., Kartaatmadja S. (1978), “Rice yield losses due to brown planthopper and rice grassy stunt disease in Java and Bali”,
Plant Dis Rep, 62: 962-965.
41. Pham V.D., Cabunagan R.C., Choi I.R. (2005), “Rice Yellowing Syndrone in Mekong River Delta”, Omonrice, 13: 135-138.
42. Rivera C.T., Ou S.H.(1965), “Leafhopper transmission of tungro disease of rice”. Plant Dis Rep, 49:127- 131. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
43. Rivera C.T., Ou S.H., and Ida T. (1966), “Grassy stunt disease of rice and its transmission by the planthopper Nilaparvata lugens Stal”, Plant Dis Rep, 50:453- 456.
44. Saha P., Dasgupta I., Das S. (2006), “A novel approach for developing resistance in rice against phloem limited viruses by antagonizing the phloem feeding hemipteran vectors”, Plant Mol Biol, 62:735–752.
45. Sambrook J., Russell D. (2001), Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
46. Shen P., Kaniewska M., Smith C., Beachy R.N. (1993) “Nucleotide sequence and genomic organization of rice tungro spherical virus”, Virology, 193: 621- 630.
47. Shikata E., Senboku T., and Ishimizu T. (1980), “The Causal Agent of Rice Grassy Stunt Disease”, Proc Japan Acad,SerB 56.
48. Shikata E., Senboku T., Tiongco E.R., and Ling K.C. (1979), ”Rice ragged stunt virus, a new member plant reovirus group”, Ann Phytopath soc Jpn, 45: 436-443. 49. Thole V., Hull R. (1996), “Rice tungro spherical virus: nucleotide sequence of
the 3' genomic half and studies on the two small 3' open reading frames”, Virus