Tách chiết plasmit

Một phần của tài liệu luận văn thạc sĩ sinh học :Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit (Trang 35)

Sử dụng bộ kit QIAprep Spin Miniprep và chỉ dẫn của nhà sản xuất để tách chiết plasmit. Đây là phƣơng pháp tách plasmit lƣợng nhỏ từ 1 – 1,5 ml dịch khuẩn

E.coli, có số bản sao plasmit cao. Qui trình bao gồm: Hút 1,5ml dịch khuẩn E.coli

đã nuôi qua đêm trong môi trƣờng LB lỏng cho vào ống eppendorf 1,5ml. Ly tâm 8.000v/p trong 5 phút để thu tế bào vi khuẩn. Hòa tan tế bào trong 250µl buffer RS có bổ sung RNase (sản phẩm tách không còn RNA). Bổ sung 250µl BL, đảo ống nhẹ nhàng 4-6 lần để trộn đều hỗn hợp. Cần thiết có thể đảo ống cho đến khi nhìn thấy dịch trắng sữa. Không để phản ứng phân giải quá 5 phút. Các dung dịch RS và BL có tác dụng phá vỡ thành tế bào, màng sinh chất... và giải phóng ra các thành phần trong tế bào. Bổ sung 350µl NE, đảo ống ngay lập tức nhƣng nhẹ nhàng 3- 4 lần. Tránh kết tủa cục bộ, đảo đều dung dịch nhẹ nhàng nhƣng liên tục ngay khi bổ sung NE. Dung dịch trở nên có màu trắng sữa. Dung dịch NE có tác dụng kết tủa protein, polysaccarit... tạo kết tủa bám vào thành ống eppendorf. Ly tâm 13.000v/p trong 15 phút. Hút dịch nổi cho vào cột QIAprep Spin Miniprep. Ly tâm 13.000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm 13.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bƣớc này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng

endA+ nhƣ JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó hoặc các chủng dại mà có mức độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng đọ carbohydrate cao. Chủng tế bào chủ nhƣ XL-1 và DH5α không cần thiết phải thực hiện bƣớc rửa này. Rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,75ml buffer WP và ly tâm ở 13.000v/p. Loại bỏ dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung 13.000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer rửa. Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5ml mới. Hòa tan DNA bằng cách bổ sung 50µl EL hoặc nƣớc cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprep, để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm ở 13.000v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản phẩm tinh sạch plasmit trên gel agarose 0,9%.

Một phần của tài liệu luận văn thạc sĩ sinh học :Tách phòng và xác định trình tự Nucleotit (Trang 35)