Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu xanh vigna radiata l wilczek

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC DEFENSIN PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata L Wilczek) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Phan Hải Cƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hƣớng dẫn để tơi c hồn thành b Luận văn thạc sĩ Cơng nghệ sinh học Tôi xin cảm ơn thầy cô C , Bộ môn Di truyền học & Sinh học đại, K nông n , Trƣờng Đại học Sƣ phạm - – đ , tơi q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn thầy cô Khoa Khoa học sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho tơi suốt q trình Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Thái Nguyên, ngày 29 tháng năm 2014 Tác giả luận văn Phan Hải Cƣờng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.2.1 11 1.3 DEFE 16 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 U 22 2.1.1 Vật liệu…… …………………………………………………….… 22 22 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………24 2.2.1 Phƣơng pháp sinh học phân tử……………………………………… 24 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v 2.2.2 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide xử lý số liệu 31 Chƣơng 32 DEFENSIN T 32 cDNA DEF 33 DEF t 33 cDNA DEF1 35 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF 1……………… 39 44 44 44 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid bp Cặp base cs Cộng cDNA Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung đƣợc tổng hợp từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngƣợc) DEF1 Defensin DEPC diethyl pyrocarbonate DNA deoxyribosenucleic acid dNTP deoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid E coli Escherichia coli et al IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilo base kGy Kilogray mRNA messenger ribonucleic acid PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid TAE Tris acetat EDTA VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG 2.1 22 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 25 Bảng 2.3 26 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng nhân gen 26 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector 29 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng colony - PCR 31 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide gen DEF1 giống đậu xanh VN6 trình tự có mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế 37 Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 giống đậu xanh VN6 trình tự mang mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế 38 3.3 39 3.4 (%) 40 Bảng 3.5 (%) 41 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trƣởng thành tác hại chúng………………………………………………………………………… 10 2.1 27 Hình 2.2 28 3.1 cDNA DEF1 VN6, VN7, VN16 nghiên cứu 33 Hình 3.2 Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR 35 3.3 cDNA DEF1 437639) 36 3.4 xanh VN6 với trình tự mang mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế 38 3.5 41 3.6 .42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] loại công nghiệp quan trọng nông nghiệp châu Á, có giá trị dinh dƣỡng kinh tế cao Về mặt dinh dƣỡng, hạt đậu xanh nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24% – 28 %), chứa 1,3% lipid, glucid 60 % chất khoáng nhƣ Ca, Fe, Na Cùng nhiều loại vitamin tan nƣớc nhƣ A, B1, B2, C Hệ thống rễ đậu xanh có nốt sần rễ, nốt sần có chứa vi khuẩn cố định đạm giúp tăng giá trị dinh dƣỡng cho đất Ở nƣớc ta, đậu xanh trồng truyền thống, có khả cung cấp dinh dƣỡng cao, dễ tiêu hoá, phân xanh, cải tạo đất trống xói mịn, đậu xanh ba cơng nghiệp ngắn ngày chính, sau lạc, đậu tƣơng Nƣớc ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nơng nghiệp song có nhiều hội tốt để sâu hại phát sinh phát triển phá hại nghiêm trọng loại trồng đồng ruộng nhƣ kho bảo quản sau thu hoạch Sau thu hoạch khơng có bảo quản bảo quản không tốt làm nông sản hao hụt lớn số lƣợng chất lƣợng Nguyên nhân dẫn đến hao hụt sâu mọt hạt, chúng làm thiệt hại số lƣợng nông sản, làm giảm chất lƣợng, giảm giá trị thƣơng phẩm, gây mùi khó chịu, mầu sắc khơng bình thƣờng mà cịn ngun nhân ảnh hƣởng tới sức khoẻ ngƣời tiêu dùng Hiện kho dự trữ đậu đỗ bị loài sâu mọt gây hại nhƣ: Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.), mọt đậu đỏ Bruchus quadrimaculatus, mọt đậu nành Ancanthoscelides obtectus, mọt đậu tằm Bruchus rufimanus Đặc biệt Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.) thuộc họ Bruchid, Coleoptera, lồi dịch hại chủ yếu nguy hiểm Chúng khơng gây hại kho dự trữ mà chúng lan truyền gây Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ hại đồng ruộng Mọt đậu xanh gây hại loại đậu: Đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen hại nặng đậu xanh Sự thiệt hại chúng gây lớn, làm ảnh hƣởng đến kinh tế quốc dân, cơng tác phịng trừ sâu mọt đậu nói chung mọt đậu xanh nói riêng vấn đề cấp thiết cần đƣợc quan tâm nghiên cứu Chính vậy, việc chọn tạo giống đậu xanh có suất cao, chất lƣợng tốt, có khả chống chịu sâu bệnh, côn trùng đáp ứng nhu cầu thực tiễn nhiệm vụ cần thiết ngành chọn giống đậu xanh Trong năm gần đây, có số cơng trình nghiên cứu khả kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus đƣợc tiến hành số loại trồng khác Các nghiên cứu thống đặc tính kháng mọt hại hạt trồng phức tạp có liên quan đến gen defensin (DEF1) DEF1 thực vật ức chế phát triển loạt loại nấm, số loại virus, số loại côn trùng gây hại lƣơng thực Tuy nhiên, nghiên cứu mối liên quan đặc điểm sinh lí, hố sinh sinh học phân tử gen DEF1 với khả kháng mọt gây hại hạt đậu xanh cịn đƣợc cơng bố Xuất phát từ sở trên, lựa chọn tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen defensin phân lập từ đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek)” Mục tiêu đề tài Xác định đƣợc trình tự cDNA DEF1 phân lập từ đậu xanh tạo nguyên liệu phục vụ thiết kế vector chuyển gen kháng mọt đậu xanh Nội dung nghiên cứu 3.1 DEF1 ; 3.2 DEF1 VN6; DEF1 ; Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 3.3 S cDNA DEF1 gen AY437639) hình 3.3 cho thấy kích thƣớc cDNA DEF1 giống đậu xanh VN6 trình tự mang mã số AY437639 222 bp Khi so sánh trình tự cDNA DEF1 giống đậu xanh VN6 BLAST ngân hàng gen Quốc tế, kết cho thấy cDNA DEF1 giống VN6 AY437639 giống 97,7% Nhƣ vậy, khuếch đại, tách dịng thành cơng xác định đƣợc trình tự nucleotide cDNA DEF1 từ giống đậu xanh VN6 So sánh trình tự nucleotide cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 xác định đƣợc có vị trí nucleotide sai khác so với trình tự gen DEF1 mẫu đậu xanh công bố Ngân hàng gen 437639 3.1) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 Bảng 3.1 Sự sai khác trình tự nucleotide cDNA DEF1 giống đậu xanh VN6 trình tự có mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế Vị trí 12 41 60 87 112 AY437639 A T G T G VN6 G C T C C Mẫu Bảng 3.1 cho thấy, vị trí nucleotide 12 (cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 G cịn gen DEF1 cơng bố ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 A), trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 C gen DEF1 có mã số AY437639 T vị trí 41), vị trí nucleotide 60 (cDNA DEF1 phân lập VN6 T gen DEF1 phân lập ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 G), vị trí nucleotide 87 (cDNA DEF1 VN6 C cịn gen DEF1 với mã số AY437639 T), trình tự cDNA DEF1 phân lập từ giống đậu xanh VN6 cịn có nucleotide sai khác với trình tự gen DEF1 cơng bố ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 vị trí nucleotide 112 (cDNA DEF1 VN6 C gen DEF1 ngân hàng gen Quốc tế có mã số AY437639 G) Khi phân tích , ngồi trình tự nucleotide ngƣời ta cịn quan tâm đến trình tự amino acid suy diễn, phân tử protein sản phẩm gen Trên sở đó, sử dụng phần mềm BioEdit để tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn từ cDNA DEF1 giống đậu xanh VN6 với AY437639 ngân hàng gen Quốc tế, kết đƣợc trình bày hình 3.4 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 38 DEF1 h VN6 với trình tự mang mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế 3.4 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 73 amino acid 97,3% Tuy nhiên, hai trình tự có khác vài vị trí amino acid, : 3.2) Bảng 3.2 Sự sai khác trình tự amino acid suy diễn protein DEF1 giống đậu xanh VN6 trình tự mang mã số AY437639 ngân hàng gen Quốc tế Vị trí 14 38 AY437639 L (Leucine) G (Glycine) VN6 P (Proline) R (Arginine) Mẫu Kết bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid vị trí 14 (L) giống đậu xanh có mã số AY437639 đƣợc thay (P) giống đậu xanh VN6; vị trí 38, trình tự amino acid giống đậu xanh mang mã số AY437639 (G) đƣợc thay (R) giống đậu xanh VN6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF cDNA DEF1 gen DEF1 T DEF1 (AY437639, (AY856095, AY856096) [54] 3.3 3.3) DEF1 - DEF1 Năm STT ên Quốc tế VN6 2014 Cuong PH., et al AY437639 2003 Chen,G.-H., et al AF326687 2005 Lin,C.-Y., et al AY856095 2007 Baek,H.-J., et al AY856096 2007 Baek,H.-J., et al FJ591131 2009 Wang,P.W., et al DEF1 3.4) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 3.4 cDNA DEF1 DEF1 (%) bảng 3.4 cho thấy hệ số tƣơng đồng 82,2% đến DEF1 100% Trong có giống AY437639 FJ591131 Gen DEF1 thấp 82,2% s xanh VN6 đậu xanh có gen DEF1 tƣơng đồng 100% AY856096 Hệ số sai khác trình tự nucleotit đƣợc công bố ngân hàng gen Quốc tế cao 20,3 giống đậu xanh địa phƣơng VN6 với giống AY856096 AY437639 sai khác Ở mức độ nucleotide, hệ số sai khác FJ591131 không giống VN6 với AY437639 FJ591131 2,3 t defensin g DEF1 nhóm chính: giống đậu xanh VN6, AY856095, FJ591131, AY437639 nhóm phụ giống đậu xanh AF326687 Nhóm II giống AY856096 9,8% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 3.5 DEF1 Hình 3.5, cho thấy mối quan hệ đậu xanh dựa trình tự nucleotide khác nhau, giống đậu xanh địa phƣơng VN6 với đậu xanh ngân hàng gen Quốc tế (AY856095, FJ591131, AY437639) khoảng 1,5%, giống đậu xanh AF326687 có khoảng cách với giống đậu xanh (VN6, AY856095, FJ591131, AY437639,) 2% 3.5 Bảng 3.5 hệ số s 3.6 đậu xanh DEF1 (%) , hệ số tƣơng động từ 69,9 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên xanh cao, dao trình tự amino acid http://www.lrc-tnu.edu.vn/ gen 42 DEF1 công bố Quốc tế 100%, thấp 69,9%, giống (AY437639, AY856095), giống (AY437639, FJ591131), có giống (AY856095, FJ591131) có hệ số đồng dạng trình tự amino acid 100% Sự sai khác amino acid đậu xanh (AY437639, AY856095), (AY437639, FJ591131) (AY856095, FJ591131) 0,0 Hệ số sai khác trình tự amino acid cao đậu xanh địa phƣơngVN6 với AY856096 công bố ngân hàng gen Quốc tế 38,5% 3.6 DEF1 Sơ 3.6 trình tự cDNA DEF1 nhóm chính: Nhóm I phâ 2 nhóm phụ: nhóm phụ giống AY856095, FJ591131, AY437639, AF326687 nhóm phụ có giống giống AY856096 VN6 Nhóm II ngân hàng gen Quốc tế 19% cDNA DEF1 giống đậu xanh địa phƣơng VN6 với AY856095, FJ591131, AY437639 AF326687 2%, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ đậu 43 xanh AF326687 có mối quan hệ trình tự amino acid với AY856095, FJ591131, AY437639 ngân hàng gen Quốc tế khoảng 1,5% Sự sai khác trình tự nucleotide trình tự amino acid sở để chúng tơi có nghiên cứu nhiều giống đậu xanh so sánh hai nhóm kháng mọt tốt nhằm tìm kiếm thay đổi vị trí nucleotide amino acid liên quan đến tính trạng kháng mọt giống đậu xanh Đây tiền đề tạo sở cho việc nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh có khả kháng mọt tốt, phục vụ cho phát triển đậu xanh sản xuất đời sống Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 1.1 cDNA DEF1 đ đƣợc n từ VN6, VN7, VN16 0,22 kb 6đ 1.2 cDNA DEF1 , cDNA DEF1 phân 222 73 amino acid VN6 năm mẫu ngân 1.3 S hàng gen quốc tế đƣợc phân tích đánh giá DEF1 gen DEF1 9,8% dựa 19% , so DEF1 để 2.2 nucleotide DEF1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 Nguyễn Mạnh Chính, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2008), Trồng đậu xanh, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội, tr: 3-9 Đƣờng Hồng Dật (2006), Cây đậu xanh Kỹ thuật thâm canh biện pháp tăng suất, chất lượng sản phẩm, Nxb Lao Động - Xã Hội, tr: 5-31 Lê Dỗn Diên (1995), Sử dụng kỹ thuật cơng nghệ sinh học để bảo quản, chế biến nông sản sau thu hoạch, Nxb Nông nghiệp Nguyễn Lâm Giang (2009), Thành phần sâu mọt, đặc điểm sinh học, sinh thái phát sinh gây hại loài Callosobruchus maculatus F Trên hạt đỗ xanh, đỗ tương nhập từ Trung Quốc qua cửa Lạng Sơn (2008 - 2009) biện pháp phịng trừ, Luận văn thạc sĩ Nơng nghiệp, Trƣờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005), „„Nghiên cứu tính đa dạng di truyền 57 giống đậu xanh (Vigna radiata L.) kỹ thuật RAPD‟‟, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 3(1), tr: 57-66 Bùi Công Hiển (1995) Côn trùng hại kho Nxb khoa học kĩ thuật, tr 11-12 Bùi Cơng Hiển, Phạm Chí Dũng (1989) Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng tia xạ Gamma mọt đậu xanh (C.chinensis L.) Tạp chí Sinh học 11 Bùi Công Hiển, Nguyễn Quang Hiếu, Lƣơng Thị Hải (2000) Một số kết điều tra côn trùng hại kho thóc dự trữ Hà nội Hải phòng TT Bảo vệ thực vật Số Hà Quang Hùng (2005), Giáo trình kiểm dịch thực vật dịch hại nông sản sau thu hoạch, Nxb Nông nghiệp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 10 Nguyễn Đăng Khôi (1997), “Các đậu ăn hạt Việt Nam”, Tạp chí Sinh học, số 2, tr:5-6 11 Kết nghiên cứu khoa học đậu đỗ 1991- 1995 (1996), Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp, Việt Nam, tr: 4-188 12 Kết nghiên cứu khoa học nông nghiệp 2000 (2001), Nxb Nông Nghiệp 13 Phạm Văn Lầm (1995), Biện pháp sinh học phịng chống dịch hại nơng nghiệp, Nxb Nơng nghiêp, Hà Nội 14 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1998), Cây đậu xanh, Nxb Nơng Nghiệp 15 Trần Đình Long, Lê Khả Tƣờng (1991), Những nghiên cứu chọn tạo giống đậu đỗ, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr: 2-20 16 Đỗ Tất Lợi (1997), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 17 Lê Đình Lƣơng, Lê Văn Sơn, Lƣơng Văn Hinh (2002), Giáo trình lương thực (dành cho sinh viên cao học), Nxb Nông nghiệp 18 Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, Nxb ĐHQG Hà Nội 19 Quyền Đình Thi, Nơng Văn Hải (2008), Những kỹ thuật PCR ứng dụng phân tích DNA, tập II, Nxb Khoa học Tự nhiên Công nghệ 20 Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền phân lập số gen liên quan đến tính chịu hạn đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội 21 Phạm Văn Thiều (1997), Cây đậu xanh Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nơng nghiệp Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 22 Phòng Kiểm dịch thực vật - Cục Bảo vệ thực vật (2003), Thành phần côn trùng hại kho Việt Nam năm 1996 - 2000, số ứng dụng bảo vệ thực vật vào sản xuất nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp 23 Nguyễn Thị Giáng Vân (1996), Thành phần côn trùng kho Việt Nam, Báo cáo kết nghiên cứu khoa học, Cục Bảo vệ thực vật T 24 Adler C (2001), “Potential of phytochemical for prevention, detection and control of insect pests in integrated stored product protection”, Workshop on practice oriented results on use of plant extracts and pheremones in integrated and biological pests control, Cairo, Egypt February 10-1 25 Carvalho A de O., Gomes V.M (2009), “Plant defensins - prospects for the biological functions and biotechnological properties”, Peptides, 30(5), pp: 1007-1020 26 Carvalho A de O., Gomes V.M (2011), “Plant defensins and defensinlike peptides - biological activities and biotechnological applications”, Current Pharmaceutical Design, 17(38), pp: 4270-4293 27 Chen G.H., Hsu M.P., Tan C.H., Sung H.Y., Kuo C.G., Fan M.J., Chen H.M., Chen S., Chen C.S (2005), “Cloning and characterization of a plant defensins VaD1 from azuki bean”, Agric Food Chem, 53(4), pp:982-988 28 Chen J.J., Chen G.H., Hsu H.C., Li S.S., Chen C.S (2004), “Cloning and functional expression of a mungbean defensin 1-18 VrD1 in Pichia pastoris”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52(13), pp: 4350 29 Chen K.C., Lin C.Y., Kuan C.C., Sung H.Y., Chen C.S (2002), “A Novel DEF1 encoded by a mungbean cDNA exhibits insecticidal activity against Bruchid”, Agricultural Food Chemistry, 50 (25), pp: 7258-7263 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 30 Chen Y.J., Wu M.F., Yu Y.H, Tam M.F., Lin T.Y (2004), “Developmental Expression of Three Mungbean Hsc70s and Substratebinding Specificity of the Encoded Proteins”, Plant and cell Physiology, 45 (110), pp: 1603-1614 31 Henrik U.S., Brandi S., Yueju W (2009), “A defensin from tomato with dual funtion in defense and development”, Plant Molecular Biology, 71, pp: 131-143 32 Henrik U.S., James G.T., Thomson Y.W (2009), “plant defensins defense, development and application”, Plant signaling & Behavior 4, 15, pp: 1010-1012 33 Koichi F (1967), Studies on interspecies competition between the Azuki bean weevil, Callosobruchus chinensis and the Southern cowpea weevil, C Maculatus, Res Popul Ecol IX, 192-200 34 Liu Y.J., Cheng C.S., Lai S.M., Hsu M.P., Chen C.S., Lyu P.C (2006), “Solution structure of the plant defensin 1-VrD1 from mung bean and its possible role in insecticidal activity against bruchids”, Proteins, 63(4), pp: 777-786 35 Marcos K (1998), “Integrated pests management: Historical perspective and contemporary development”, Annual rev Entomol (43), p 243-270 36 Meyer B., Houlne G., Pozueta-Romero J., Schantz M.L., Schantz R (1996), “Fruit-specific expression of a defensin 1-type gene family in bell pepper Up regulating during ripening and upon wounding”, Plant Physiology, 112, pp: 615-622 37 Oh B.J., Kos M.K., Kostenyuk I., Shin B., Kim K.S (1999), “Coexpression of a defensin gene and a thionin-like via different signal transduction pathways in pepper and Colletotrichum gloeosporioides interactions”, Plant Molecular Biology, 41, pp: 313-319 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 38 Park H.C., Kang Y.H., Chun H.J., Koo J.C., Cheong Y.H (2002), “Characterization of a stamen-specific cDNA encoding a novel plant defensin in Chinese cabbage”, Plant Molecular Biology, 50, pp: 59-69 39 Phillips T.W (1994) Pheromones of stored products insects current status and future perspectives In: Highley E., Wright EJ., Banks HJ, Champ BR Eds stored product protection: Proceedings, 6th international working conference of stored products, protection, pp.1723 40 Prasantha B., Rohitha D (2002), “Efficacy of burnt plant materials smoke for protection of stored paddy against infestation of Sitophilus oryzae (L.)”, Integrated protection of stored products, IOBC Bulletin, Vol 25 (3), p 171-176 41 Reichmuth C (2000), biological control in stored product protection, integrated protection of stored product, IOBC bulletin Vol.23(10), p 1123 42 Sabah F (2001), “Development of lowinput technology for reducing postharvest losses of staples in Southeast Asia”, JIRCA 2001 annual report, p 30 -32 43 Stotz H.U., Thomson J.G., Wang Y (2009), "Plant defensins: defense, development and application", Plant Signal Behav, 4(11), pp:1010–1012 44 Subramanyam B.H., Cutkomp L.K (1985) Moth control in stored grain and the role of Bacillus thuringien.sis: An overview Residue Rev., 94:147 45 Tavares L.S., Santos M de O., Viccini L.F., Moreira J.S., Miller R.N., Franco O.L (2008), “Biotechnological potential of antimicrobial peptides from flowers”, Peptides, 29(10), pp: 51-142 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 46 Terras F.R.G , Eggermont K., Kovalev V., Raikhel N.V., Osborn R.W (1995), “Small cysteine-rich antifungal proteins from radish Their role in host defense”, Plant Cell, 7, pp: 573-588 47 Thevissen K., Ferket K.K., Francois I.E., Cammue B.P (2003), “Interaction of antifungal plant defensins with fungal membrane components”, Peptides, 24, pp: 1705-1712 48 Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K (2002), “Plant defensins”, Planta, 216(2), pp: 193-202 Internet 49 Callosobruchus chinensis L http://www.scient.dost.gov.ph/ /bsubview1php 50 Callosobruchus chinensis L http://www.agri.ruh.ac.lk/biology/staff/academic/ 51 Callosobruchus chinensis L http.//www.idosi.org/wijas2(1)/13.pdf 52 http://faostat.fao.org 53 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 54 http://invasive.org/browse/detail.cfm?imgnum=5460517 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... học phân tử gen DEF1 với khả kháng mọt gây hại hạt đậu xanh cịn đƣợc cơng bố Xuất phát từ sở trên, l? ??a chọn tiến hành nghiên cứu đề tài ? ?Nghiên cứu đặc điểm gen defensin phân l? ??p từ đậu xanh (Vigna. .. phân l? ??p từ giống đậu xanh VN6 C gen DEF1 có mã số AY437639 T vị trí 41), vị trí nucleotide 60 (cDNA DEF1 phân l? ??p VN6 T gen DEF1 phân l? ??p ngân hàng gen Quốc tế mã số AY437639 G), vị trí nucleotide... (Vigna radiata L Wilczek) ” Mục tiêu đề tài Xác định đƣợc trình tự cDNA DEF1 phân l? ??p từ đậu xanh tạo nguyên liệu phục vụ thiết kế vector chuyển gen kháng mọt đậu xanh Nội dung nghiên cứu 3.1