Nghiên cứu đặc điểm của Gen GmDreb2 phân lập từ cây đậu tương Glycine max (L.) Merrill

S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ XOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ XOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L.) Merrill Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS. Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả Hoàng Thị Xoan S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Trƣởng khoa Khoa học Sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tác giả Hoàng Thị Xoan S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Những chữ viết tắt trong luận văn v Danh mục các bảng trong luận văn vi Danh mục các hình trong luận văn vii MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. CÂY ĐẬU TƢƠNG 4 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng 4 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng 5 1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam 7 1.2. GEN VÀ ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƢƠNG 9 1.2.1. Hạn và tác động hạn đến sinh trƣởng phát triển của thực vật 9 1.2.2. Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 11 1.2.3. Một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 13 1.2.3.1. Nhóm gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng 13 1.2.3.2. Nhóm gen điều khiển quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 16 1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB VÀ DREB2 18 1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB 18 1.3.2. DREB2 và gen GmDREB2 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn iv 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 25 2.1.1. Vật liệu 25 2.1.2. Hóa chất 26 2.1.3. Thiết bị 26 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.2.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non trong điều kiện gây hạn nhân tạo 28 2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 29 2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 29 2.2.2.2. Kỹ thuật PCR 30 2.2.2.3. Phƣơng pháp tinh sạch sản phẩm PCR 32 2.2.2.4. Phƣơng pháp gắn gen vào vector tách dòng 33 2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5 34 2.2.2.6. Tách chiết plasmid 34 2.2.2.7. Phƣơng pháp phân tích trình tự gen 35 2.2.2.8. Xử lý kết quả và tính toán số liệu 35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 36 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 39 3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 39 3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR 40 3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2 41 3.2.4. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 của ba giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 43 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn v 3.2.5. So sánh trình tự amino acid của protein DREB2 của ba giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và các trình tự đã công bố 45 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG 45 3.3.1. Sự đa dạng của các giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide của gen DREB2 45 3.3.2. Phân tích sự đa dạng trong trình tự amino acid của DREB2 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn vi NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisis acid bp Cặp base CS Cộng sự DNA Deoxiribonucleic acid DREB Dehydration- Responsive Element Binding EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid HSP Heat shock protein kb Kilo base LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tích luỹ với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi) LTP Lipid Tranfer protein (Protein vận chuyển lipid) MGPT Môi giới phân tử PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RNA Ribonucleic Acid TAE Tris acetat EDTA S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ 2005- 2011 8 Bảng 2.1 Nguồn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu 25 Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị đã sử dụng 27 Bảng 2.3 Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2 30 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 31 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT 33 Bảng 3.1 Chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu 38 Bảng 3.2 Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự gen GmDREB2 của 3 giống đậu tƣơng BS, BG và HG1 và trình tự gen GmDREB2 của 9 giống đậu tƣơng trên GenBank 46 Bảng 3.3 Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein DREB2 của 3 giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và trình tự amino acid của protein DREB2 của 9 giống đậu tƣơng trên GenBank 48 S ố hóa bởi Trung tâm Học liệu http://lrc.tnu.edu.vn viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở đậu tƣơng 23 Hình 1.2 Sơ đồ mô tả protein GmDREB2 ở đậu tƣơng 23 Hình 1.3 Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB2 ở đậu tƣơng 23 Hình 2.1 Hình ảnh hạt các giống đậu tƣơng nghiên cứu 26 Hình 2.2 Sơ đồ vector tách dòng pBT 33 Hình 3.1 Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng hạn trƣớc khi gây hạn 36 Hình 3.2 Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng sau 7 ngày hạn 37 Hình 3.3 Hình ảnh điện di DNA tổng số của 4 giống HG1, BG, HG4 và BS 39 Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB2 của bốn giống đậu tƣơng nghiên cứu 40 Hình 3.5. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5 chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB2 41 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen GmDREB2 trực tiếp từ khuẩn lạc 42 Hình 3.7 Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen GmDREB2 42 [...]... hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tƣơng [Glycine max (L.) Merrill] ” 2 Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự khác nhau về khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng; Xác định đƣợc điểm sai khác về trình tự gen GmDREB2 phân lập từ một số giống đậu tƣơng địa phƣơng Đánh giá đƣợc sự đa dạng của một số giống đậu tƣơng dựa trên trình tự gen GmDREB2. .. [7], [9], [10] 1.2.2 Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tƣơng nói riêng là cây có nhu cầu về nƣớc cao hơn các loại cây khác là do trong hạt và cây đậu tƣơng có h – 50%, trong khi đó ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [6] Khi nghiên cứu về các đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng về phƣơng diện sinh l đến đặc điểm hóa keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi... tự gen GmDREB2 phân lập từ ba giống đậu tƣơng 44 HG1, BG, BS Hình 3.9 Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 45 suy diễn từ trình tự gen GmDREB2 Hình 3.10 Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 47 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình tự gen GmDREB2 Hình 3.11 Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 49 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của. .. diễn 3 3 Nội dung nghiên cứu - Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng nghiên cứu - Thu thập thông tin về gen DREB2 ở cây đậu tƣơng và thiết kế cặp mồi cho PCR nhân gen - Nhân gen DREB2 từ hệ gen của giống đậu tƣơng địa phƣơng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đã thiết kế Tách dòng và xác định trình tự gen DREB2 - So sánh trình tự gen DREB2 của một số giống đậu tƣơng địa phƣơng... gen đã công bố - Phân tích hệ số tƣơng đồng di truyền và hệ số sai khác về trình tự gen DREB2 và trình tự amino acid suy diễn Thiết lập sơ đồ hình cây giữa các giống đậu tƣơng dựa trên trình tự gen DREB2 và trình tự amino acid suy diễn 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và vị trí cây đậu tƣơng Cây đậu tƣơng hay còn gọi là đậu nành, tên khoa học Glycine max (L.). .. điều quan trọng là nghiên cứu các chức năng của gen liên quan đến stress để cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng với hạn hán Có hai nhóm gen có liên quan chủ yếu đến tính chịu hạn của cây đậu tƣơng: (1) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng có ảnh hƣởng trực tiếp tới đặc tính chịu hạn; (2) Nhóm gen mà sản phẩm của chúng kích hoạt quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn 13 1.2.3 Một số gen liên quan đến... Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2) trong thuốc lá chuyển gen Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong cây thuốc lá [22] Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tƣơng và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong nhóm gen DREB Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trƣờng có... trong khi đó ở ngô là 30%, ở lúa là 26% [6] Đặc tính chịu hạn của cây đậu tƣơng liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất Tính chịu hạn của cây đậu tƣơng mang tính đa gen Chúng thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau: sự phát triển nhanh của bộ rễ, tính chín sớm tƣơng đối, cũng nhƣ bản chất di truyền của từng giống trong quá trình sinh trƣởng và phát... [14] Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen đƣợc tích lũy cao hơn của hàm lƣợng proline [30] Đối với cây đậu tƣơng với chức năng kích hoạt sự phiên mã của gen GmDREB2 là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây Một gen DREB2 mới ở đậu tƣơng là GmDREB2A, GmDREB2A đƣợc đánh giá cao gây ra không chỉ bởi mất nƣớc và nhiệt mà còn bởi nhiệt độ thấp GmDREB2A còn cải... thời sự biểu hiện của các gen liên quan đến khả năng chịu hạn DREB là một họ protein trong đó có DREB2, gen DREB2 đƣợc biểu hiện trong môi trƣờng có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp Chình vì vậy phân lập và nghiên cứu gen DREB tạo nguyên liệu phục vụ tạo cây chuyển gen nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tƣơng là vấn đề đang đƣợc quan tâm nghiên cứu Xuất phát từ lý do trên chúng . hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tƣơng [Glycine max (L. ) Merrill] . 2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định đƣợc sự khác nhau về khả năng chịu hạn của. CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 36 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU 39 3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng 39 3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2. ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG THỊ XOAN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƢƠNG Glycine max (L. ) Merrill LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC