3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2.6. Tách chiết plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm colony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bƣớc tách chiết plasmid:
(1) Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn.
(2) Hòa cặn trong 250 l Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ. (3) Bổ sung 250 l Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ.
(4) Bổ sung 350 l Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ.
(5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.
(6) Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(7) Bổ sung 500 l Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(8) Bổ sung 700 l Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(9) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.7. Phương pháp phân tích trình tự gen
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2.8. Xử lý kết quả và tính toán số liệu
Các số liệu đƣợc Xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel với mức ý nghĩa α=0,05 ; n≤ 30.Mỗi thí nghiệm đƣợc nhắc lại 3 lần.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU
Phân tích tác động của hạn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đậu tƣơng thông qua tính tỉ lệ cây héo và tỉ lệ cây chết, kết quả cho thấy tỉ lệ cây héo và cây chết của các giống đậu tƣơng tăng theo thời gian gây hạn và có sự phản ứng đối với hạn biểu hiện khác nhau giữa các giống.
Khi bị hạn lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây, các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Trƣớc khi gây hạn thì cả 7 giống đậu tƣơng đều chƣa có cây héo và cây chết (Hình 3.1). Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy ở thời điểm 3 ngày sau khi xử lý hạn các cây đậu tƣơng đã bắt đầu có sự thay đổi, bắt đầu có cây héo, tỉ lệ cây không héo khá cao, cao nhất là giống BS (93,33%), thấp nhất là giống HG1 (70%). Sau 5 ngày xử lí hạn mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt. Sau 7 ngày thì cả 7 giống tỉ lệ cây héo và tỉ lệ cây chết đã tăng cao (Hình 3.2).
Hình 3.1. Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng trƣớc khi gây hạn
Giống BS có tỉ lệ cây sống và khả năng giữ nƣớc là cao nhất sau đó đến giống HG2. Tỉ lệ cây sống và khả năng giữ nƣớc thấp nhất là giống HG1 (Bảng 3.1). Kết quả theo dõi đã chứng tỏ khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu ở mức độ cây non 3 lá là khác nhau và phụ thuộc vào genotype của mỗi giống.
Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá chét đƣợc phân tích với các tính trạng, đó là: (1) tỉ lệ cây không héo ở thời điểm sau 3, 5, 7 ngày hạn; (2) khả năng giữ nƣớc ở thời điểm sau 3, 5, 7 ngày hạn; (3) tỉ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 5, 7 ngày hạn; (4) tỉ lệ thân lá khô/thân lá tƣơi sau 5, 7 ngày hạn (Bảng 3.1). Bảng 3.1 cho thấy chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp nhƣ sau:
BS > HG4 > HG5 > HG2 > HG3 > BG > HG1
Giống BS có chỉ số chịu hạn tƣơng đối cao nhất và giống có chỉ số chịu hạn thấp nhất là giống HG1. Nhƣ vậy giống BS có khả năng chịu hạn cao nhất, giống HG1 có khả năng chịu hạn thấp nhất.
Hình 3.2. Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng sau 7 ngày hạn
Bảng 3.1. Chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu % CKH sau 3 ngày hạn % CKH sau 5 ngày hạn % CKH sau 7 ngày hạn KNGN sau 3 ngày hạn (%) KNGN sau 5 ngày hạn (%) KNGN sau 7 ngày hạn (%) Tỷ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 5 ngày hạn Tỷ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 7 ngày hạn Tỷ lệ thân, lá khô/thân lá tƣơi sau 5 ngày hạn Tỷ lệ thân lá khô/thân lá tƣơi sau 7 ngày hạn Chỉ số chịu hạn tƣơng đối Xếp thứ tự khả năng chịu hạn HG1 70,00 53,33 43,33 76,23 62,62 17,30 0,13 0,16 0,06 0,11 4469,26 4 HG2 83,33 56,67 53,33 82,86 68,74 24,56 0,12 0,15 0,07 0,12 5746,16 3 BS 93,33 83,33 76,67 88,80 71,36 37,79 0,18 0,18 0,12 0,15 8821,36 1 HG4 80,00 73,33 66,67 83,62 61,40 32,84 0,13 0,10 0,08 0,09 6901,22 2 HG5 73,33 70,00 63,33 85,72 62,07 33,20 0,11 0,13 0,09 0,80 6591,66 2 HG3 86,67 63,33 53,33 79,44 60,22 27,52 0,14 0,10 0,10 0,10 5744,97 3 BG 76,67 60,00 50,00 81,84 65,80 26,88 0,15 0,09 0,09 0,11 5539,94 3
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU TƢƠNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử. Chất lƣợng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của các giống đậu tƣơng theo phƣơng pháp của Gawel và Jarret (1991).
Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng địa phƣơng có khả năng chịu hạn khác nhau, nhƣ: BS (chịu hạn tốt nhất), BG, HG4 và HG1 (chịu hạn kém nhất) đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số.
Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn. Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết từ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Hình 3.3).
Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 4 mẫu HG1, BG, HG4 và BS
(1- HG1, 2- BG, 3- HG4, 4 - BS)
1 2 3 4
3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR
Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ DNA khuôn tối ƣu cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành nhân gen GmDREB2 từ hệ gen của bốn giống đậu tƣơng BS, BG, HG4 và HG1. Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để khuếch đại gen GmDREB2 với cặp mồi Dreb2soyF/Dreb2soyR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen DREB2 đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số DQ208968. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56C. Sau 30 chu kỳ phản ứng, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Kết quả nhân gen GmDREB2 cho thấy, ở cả bốn giống đậu tƣơng BS, BG, HG4 và HG1 gen GmDREB2 đều có kích thƣớc ƣớc tính khoảng 0,5kb. Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế cặp mồi để nhân gen này.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB2
của bốn giống đậu tƣơng nghiên cứu
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1- HG1, 2- BG, 3- HG4, 4 - BS)
M 1 2 3 4
0,5kb 1,0kb
3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2
Sau khi thu nhận đƣợc gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5. Tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung Kanamycin và X- gal, để qua đêm, kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng trong và khuẩn lạc màu xanh (Hình 3.5).
Hình 3.5. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5
chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB2
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong LB lỏng có bổ sung bổ sung ampicillin, để qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony–PCR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony–PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di tren gel agarose 1% trong đệm TAE 1X (Hình 3.6).
Sau khi biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã lựa chọn ở mức tối ƣu, tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep
Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen GmDREB2
trực tiếp từ khuẩn lạc
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2- HG1, 3,4- BG, 5,6- BS, 7,8 – HG4)
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen GmDREB2 của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen GmDREB2
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 M 7 8
0,5kb 1,0kb
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm tách dòng gen và plasmid đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ giải trình tự gen DREB2. Để xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB2 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA
capillary electrophoresis system. Kết quả đọc trình tự nucleotide của 4 mẫu plasmid tái tổ hợp từ 4 giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và HG4 đƣợc so sánh bằng BLAST trên NCBI cho thấy chỉ ở 2 trình tự phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS và BG là gen GmDREB2. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, kết quả thu đƣợc trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8 cho thấy kích thƣớc gen GmDREB2 phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS, BG đều có kích thƣớc là 480 nucleotide. Từ kết quả này chúng tôi đi đến kết luận đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS và BG.
3.2.4. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS, BG với trình tự đã công bố
Kết quả so sánh ở Hình 3.8 cho thấy trình tự nucleotide của gen
GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS và BG với trình tự nucleotide của gen DREB2 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có mã số DQ054363 có sự sai khác ở 7 vị trí nucleotide: 159, 163, 165, 178, 202, 219, 261. Trình tự gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự mã số DQ054363 có độ tƣơng đồng cao, khoảng hơn 99%. Kết quả này đã khẳng định gen
Hình 3.8. Trình tự gen GmDREB2 phân lập từ hai giống đậu tƣơng BG, BS
3.2.5. So sánh trình tự amino acid của protein DREB2 của hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự đã công bố
Kết quả so sánh trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide do gen
GmDREB2 mã hoá của hai giống đậu tƣơng BS, BG đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 suy diễn từ trình tự gen GmDREB2
Trình tự amino acid của protein DREB2 của giống đậu tƣơng BS và BG với trình tự amino acid của protein DREB2 có mã số AAY89658 có sự sai khác ở 1 vị trí amino acid là 68, mức độ tƣơng đồng cao 99%.
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ
TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
3.3.1. Sự đa dạng của các giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide của gen DREB2 nucleotide của gen DREB2
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng di truyền và hệ số khác nhau trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide của gen DREB2 ở 11 giống đậu tƣơng, đó là:
BS, BG, NM_001250325, DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự gen GmDREB2
của hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự gen GmDREB2 của 9 giống đậu tƣơng trên GenBank
Kết quả cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền về trình tự gen GmDREB2
của 11 giống đậu tƣơng nghiên cứu là rất cao, dao động từ 96,2% - 100%. Độ tƣơng đồng giữa 9 trình tự gen GmDREB2 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế thấp nhất là 96,2% và cao nhất là 99,8%.
Gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BS có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 lần lƣợt là 98,5%, 99,8%, 96,4%, 98,8%, 97,8%, 96,2%, 96,4%, 98,6%. Gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BG có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 lần lƣợt là 98,5%, 99,8%, 96,4%, 98,8%, 97,8%, 96,2%, 96,4%, 98,6%.
Hệ số sai khác giữa giống đậu tƣơng BG và BS với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 giao động từ 0,2% - 3,9%.
Mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự gen GmDREB2 đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây trên Hình 3.10.
Hình 3.10. Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình tự gen GmDREB2
Biểu đồ hình cây trên Hình 3.10 cho thấy dựa trên trình tự nucleotide của gen DREB2 thì 11 giống đậu tƣơng phân bố ở 5 nhóm, phân thành 2 nhánh với khoảng cách di truyền là 1,4%.
Nhánh I gồm 8 giống BG, BS, FJ965341, NM_001250325, DQ054363, JF946767, JF946771, JF946768. Nhánh II gồm ba giống JF946766, JF946769, JF946770. 1 2 3 4 5
3.3.2. Phân tích sự đa dạng của 11 giống đậu tƣơng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen DREB2
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác trên cơ sở phân tích trình tự amino acid của protein DREB2 ở 11 giống đậu tƣơng BS, BG, NM_001250325, DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein DREB2 ở hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự amino acid của
protein DREB2 của 9 giống đậu tƣơng công bố trên GenBank
Hệ số tƣơng đồng về trình tự amino acid của protein DREB2 của 11 giống đậu tƣơng khoảng từ 96,4%-100%. Hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein DREB2 của 11 giống từ 0% - 3,7%.
Mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự amino acid của protein DREB2 đƣợc thể hiện trong sơ đồ hình cây ở Hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình tự amino acid của
protein DREB2
Sơ đồ hình cây ở Hình 3.11 cho thấy 11 giống đậu tƣơng phân bố trong 5 nhóm, đƣợc chia làm 2 nhánh lớn, nhánh thứ nhất chỉ có giống JF946768; nhánh thứ hai gồm 10 giống, khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 1,4%. Nhánh thứ hai lại chia làm hai nhánh phụ: Nhánh phụ I có 3 giống: JF946769, JF946770, JF946766; Nhánh phụ II lại chia làm hai nhánh nhỏ: Nhánh nhỏ 1 có 2 giống JF946767 và JF946771; Nhánh nhỏ 2 gồm có giống NM_001250325 và 4 giống BS, BG, DQ054363, FJ965341. Nhƣ vậy hai giống BS và BG phân bố ở nhóm 5. 1 2 3 4 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Khả năng 7 giống u đã đƣợc xác định
và giống BS 8821,36, HG1 u
h là 4469,26.
1.2. Đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định trình tự gen GmDREB2
phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS và BG. Trình tự gen GmDREB2 có 480 nucleotide, mã hoá 159 amino acid.
1.3. So với trình tự gen DREB2 có mã số DQ054363 trên GenBank, trình tự nucleotide của gen GmDREB2 ở giống BS và BG có độ tƣơng đồng là 98,5% và có sự sai khác ở 7 vị trí nucleotide: 159, 163, 165, 178, 202, 219, 261.