3. Nội dung nghiên cứu
1.3. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB VÀ DREB2
1.3.1. Nhân tố phiên mã DREB
DREB (Dehydration Respons protein có chức
Arabidopsis ƣơng, bông [41], [36], [14], [17], [21]. Nhiều công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình này bằng cách kích hoạt nhanh chóng sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh. Nhân tố phiên mã DREB hoạt động không cần thông qua sự tác động của ABA.
Li và cs (2005) phân lập gen trên đối tƣợng cây đậu tƣơng đã chia thành các phân họ DREB gồm: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, ngoài ra còn có DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5, mỗi gen có trình tự, độ dài khác nhau nhƣng đều đƣợc biểu hiện nhiều khi đậu tƣơng gặp các điều kiện hạn.
Wang và cs (2006) đã mô tả mối quan hệ giữa yếu tố phiên mã DREB và DRE/CRT cis- một nhân tố chức năng liên quan đến sự biểu hiện của gen
DREB, nghiên cứu đặc điểm và chức năng của nhóm nhân tố phiên mã AP2/EREBP ở thực vật [39]. AP2/ERF là một họ lớn bao gồm các yếu tố phiên mã quan trọng.
Ở cây Arabidopsis trên cơ sở số lƣợng và giống nhau của các miền DNA- binding, 145 nhân tố phiên mã đƣợc phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen), RAV (6 gen), DREB (còn đƣợc gọi là CBF, 56 gen), ERF (còn đƣợc gọi là EREBP, 65 gen) và nhóm gen khác (4 gen).
Ở Arabidopsis, 10 DREBs (DREB2- DREB11) đƣợc phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB5; nhóm thứ hai gồm W50, DREB6, DREB7, DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm
thứ tƣ gồm DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và ERF2 (Liu và cs, 1998; Riechman và cs, 2000; Tsui- Hung Phang, 2008).
Li và cs (2005) đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb, và
GmDREBc) từ cây đậu tƣơng và cho rằng mỗi phân tử protein của các gen này đã chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [24]. Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan đến sự mất nƣớc và đáp ứng sự mất nƣớc của tế bào. Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb
. Các protein
GmDREBa và GmDREBb trong lá của cây giống đậu tƣơng đƣợc tổng hợp bởi tác động của muối, hạn hán, và lạnh.
Yang và cs (2007) đã phân lập đƣợc phân họ DREB trên đối tƣợng Hoa Cúc, theo đó phân họ gồm DmDREBa và DmDREBb, những gen này mã hoá cho hai protein có 191 amino acid và 185 amino acid với trọng lƣợng phân tử 21,66 và 20,99 kDa, các protein của hai gen này đƣợc biểu hiện khi cây hoa cúc bị stress hạn lạnh.
1.3.2. DREB2 và gen GmDREB2
Đậu tƣơng là một cây trồng quan trọng trên thế giới, trong điều kiện stress phi sinh học nhƣ hạn hán và nhiệt độ, ảnh hƣởng xấu đến sự sống, phát triển cũng nhƣ năng suất. Việc mất nƣớc đƣợc đáp ứng bởi nhóm DREB2 bao gồm các yếu tố phiên mã góp phần chống hạn và chống stress nhiệt bằng cách kích hoạt phiên mã thông qua các yếu tố cis đáp ứng mất nƣớc.
Gen DREB2 tham gia tích cực vào việc chống hạn. Gen DREB2 đƣợc biểu hiện trong môi trƣờng có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp.
Nakashima và cs đã xác định đƣợc ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên quan đến sự mất nƣớc và độ mặn cao trong biểu hiện gen. Trong cây
Arabidopsis gen biểu hiện trong điều kiện mất nƣớc đặc trƣng bởi một nhóm gen DRE/CRT – binding protein là DREB2A và DREB2B. Khi phân tích thấy rằng cả hai gen đƣợc gây ra bởi sự mất nƣớc và độ mặn cao. Mức độ biểu hiện của hai gen rất cao trong rễ khi nồng độ muối cao và trong thân và rễ khi cây bị mất nƣớc. Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3, cả 2 gen bị gián đoạn bởi 1 intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau.
Trong cây chuyển gen Arabidopsis gen DREB2 giải phóng ra Beta- glucuronidase (GUS) trong điều kiện cây bị mất nƣớc và độ mặn cao [33].
Chen và cs (2009) đã phân lập gen PeDREB2 từ cây populus euphratica. Dựa trên sự liên kết nhiều trình tự và đặc tính phát sinh loài PeDREB2 đƣợc xếp vào phân họ A2 trong nhóm gen DREB. Sự biểu hiện của PeDREB2 đƣợc gây ra bởi môi trƣờng có xử lý hạn hán, lạnh và độ mặn cao nhƣng không có ABA. PeDREB2 tăng khả năng chịu mặn trong cây thuốc lá chuyển gen và không gây ra chậm phát triển. Kết quả cho thấy PeDREB2 có chức năng nhƣ là một yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng của nồng độ muối cao và có thể có ích trong việc cải thiện khả năng chịu mặn trong cây chuyển gen [15].
Liu và cs (2008) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc
Dendranthema vestitum. DvDREB2A đƣợc phân lập từ hoa cúc
Dendranthema vestitum nó chứa một (ORF) dài 1.471 bp mã hóa 366 amino acid và đƣợc xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự. Trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP DNA- binding miền gần khu vực N. Trong một phân tích protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố DRE (Trình tự lõi, AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải phóng lacZ. Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị ảnh hƣởng đáng kể bởi nhiệt, nhiệt độ thấp, hạn hán, ABA, độ mặn cao,
những kết quả này chỉ ra rằng gen DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trƣờng [29].
Kobayashi và cs (2008) kích hoạt gen DREB2 lúa mì (wDREB2) trong thuốc lá chuyển gen. Tạo ra cây thuốc lá biến đổi gen biểu hiện wDREB2, wDREB2 biểu hiện tăng khả năng chịu lạnh và thẩm thấu trong cây thuốc lá [22].
Chen và cs (2007), đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tƣơng và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 xếp vào phân họ A5 trong nhóm gen DREB. Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi trƣờng có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và ABA [14]. Sự biểu hiện của GmDREB2 ở cây thuốc lá chuyển gen đƣợc tích lũy cao hơn của hàm lƣợng proline [30]. Đối với cây đậu tƣơng với chức năng kích hoạt sự phiên mã của gen GmDREB2 là cơ sở quan trọng và hữu ích cho việc cải tiến khả năng chịu hạn của cây.
Một gen DREB2 mới ở đậu tƣơng là GmDREB2A, GmDREB2A đƣợc đánh giá cao gây ra không chỉ bởi mất nƣớc và nhiệt mà còn bởi nhiệt độ thấp. GmDREB2A còn cải thiện sốc nhiệt và cải thiện chịu hạn ở cây Arabidopsis biến đổi gen.
Trong ngân hàng gen quốc tế (Genbank) trình tự gen GmDREB2 đã đƣợc công bố, đó là trình tự gen GmDREB2 của Chen và cs công bố năm 2007 có kích thƣớc 480 bp mã hóa 159 amino acid, mã số trên NCBI là DQ208968. Trình tự gene GmDREB2 của Wang và cs công bố năm 2006 có kích thƣớc 480 bp, mã số trên NCBI là DQ054363.
Thông tin về gen GmDREB2 cho thấy trình tự nucleotide của gen
mã hóa cho 159 acid amin, từ vị trí số 1 đến vị trí amino acid thứ 159. Sơ đồ về gen GmDREB2 đƣợc biểu diễn ở Hình 1.1.
Hình 1.1. Sơ đồ mô tả gen và vùng mã hóa của gen GmDREB2 ở cây đậu tƣơng
Sơ đồ về protein DREB2 của cây đậu tƣơng ở Hình 1.2 cho thấy protein DREB2 có vùng bảo thủ AP2 và vị trí đặc biệt bám vào DNA.
Protein DREB2 của cây đậu tƣơng có chứa 159 amino acid chứa vùng AP2 có 59 amino acid, từ vị trí amino acid 34 đến 92 (Hình 1.3).
1 meeaglgdcc ssnttitrks ekrkqqhqqq ekpyrgirmr kwgkwvaeir epnkrsriwl
61 gsyatpvaaa raydtavfhl rgpsarlnfp ellsqdddvs tqqqgkmsad sirqkatqvg 121 arvdalqtal qqsssthsis sshvsyekpd lneypkped
Hình 1.3. Trình tự amino acid của vùng AP2 của protein DREB2 ở đậu tƣơng
u
2 en DREB2
, việc nghiên cứu về gen
GmDREB2 làm cơ sở nghiên cứu cơ chế kháng hạn của cây đậu tƣơng nhằm tăng cƣờng khả năng chịu hạn và nâng cao năng suất đậu tƣơng.
Chƣơng 2
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Vật liệu
Bảy giống giống đậu tƣơng địa phƣơng đƣợc sử dụng làm vật liệu nghiên cứu do các Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn thuộc các huyện Hoàng Xu Phì, Bắc Quang, Quản Bạ, Yên Minh, Xín Mần (Hà Giang), huyện Bắc Sơn (Lạng Sơn) và huyện Lục Nam (Bắc Giang) cung cấp (Bảng 2.1 và Hình 2.1)
Bảng 2.1. Nguồn gốc các giống đậu tƣơng nghiên cứu
STT Tên giống Ký
hiệu Nguồn gốc Nơi cung cấp
1 Hoàng Su Phì HG1 Hoàng Su Phì – Hà Giang Phòng NN và PTNT Hoàng Su Phì – Hà Giang 2 Bắc Quang HG2 Bắc Quang – Hà Giang Phòng NN và PTNT Bắc Quang – Hà Giang
3 Quản Bạ HG3 Quản Bạ - Hà Giang Phòng NN và
PTNT Quản Bạ - Hà Giang
4 Yên Minh HG4 Yên Minh – Hà
Giang Phòng NN và PTNT Yên Minh – Hà Giang 5 Xín Mần HG5 Xín Mần – Hà Giang Phòng NN và PTNT Xín Mần – Hà Giang 6 Lục Nam BG Lục Nam - Bắc Giang Phòng NN và PTNT huyện Lục Nam- Bắc Giang
7 Bắc Sơn BS Bắc Sơn – Lạng Sơn Phòng NN và
PTNT Bắc Sơn – Lạng Sơn
Hình 2.1. Hình ảnh các giống đậu tƣơng nghiên cứu
2.1.2. Hóa chất
Sử dụng các hoá chất: Yeast Extract và trypton (DIFCO- Mỹ), EDTA, SDS, Tris- HCl (Mỹ), acid acetic (Merk- Đức), X- gal (sigma- Mỹ), Kanamycin (Wako- Japan), Agar, Agarose (sigma- Mỹ), cồn tuyệt đối, BigDyeTeminater v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems- Mỹ).
Bộ Kit dùng cho phản ứng PCR, bộ Kit tinh sạch sản phẩm PCR Accuprep PCR Purification (Bioneer- Hàn Quốc), bộ Kit tách dòng “TA cloning Kit” (hãng Invitrogen), bộ Kit tách plasmid tái tổ hợp “AccuprepTM
Plasmid Mini Extraction Kit” do hãng Bioneer cung cấp, Kit tinh sạch sản phẩm PCR do hãng Bioneer cung cấp.
2.1.3. Thiết bị
Các thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học, khoa Khoa học sự sống, Trƣờng Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên.
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng
STT Tên thiết bị Nguồn gốc xuất sứ
1 Bộ điện di Scie- plas Ltd- UK
2 Máy cất nƣớc Canada Bio Water system- Pall Co.UK
3 Máy PCR Amplied Biosystems USA/ Singapore
4 Nồi hấp khử trùng HV- 110- Hirayama- japan
5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic 1500- Kodak- USA
6 Máy đo quang phổ Biomate 3- Thermo Scientific USA
7 Máy lắc SK 3000- Jeotech- Korea
8 Máy Vortex Vortex Genius 3- IKA Genmany/ China
9 Máy Spin down E- centrifuge- Wealtec- Taiwan/USA
10 Máy đo pH F- 51 BW- Horiba- Japan
11 Lò vi sóng MS- 2347 AR- LGVN
12 Máy DNA sequencing ABI Prism 3130- USA/Japan
13 Cân điện tử TE 214S- Startorius Germany
14 Bể ổn nhiệt Tech- OSI
15 Máy li tâm Eppendorf- CHLB Đức
16 Bể rửa sóng siêu âm Jeiotech- Korea
17 Máy lọc nƣớc siêu sạch Pall Co- UK
18 Pipettte 8- channel Thermo Labsystem- Finland
19 Tủ lạnh -20C, -80C Super freezer Eco130- Ficchetti- Italy 20 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu- 425- 400E- Nuaire- USA
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non trong điều kiện gây hạn nhân tạo trong điều kiện gây hạn nhân tạo
Phƣơng pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non đƣợc xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1].
Hạt đậu tƣơng nảy mầm gieo vào các chậu (kích thƣớc 30cm x 30cm) chứa cát vàng đã rửa sạch, mỗi chậu trồng 30 cây, 3 chậu cho mỗi giống. Thời gian đầu tƣới nƣớc cho đủ ẩm, khi cây đậu tƣơng đƣợc 3 lá chét (15 ngày) tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng:
Thống kê số cây chết, số cây héo và xác định số cây không héo (CKH) sau 3, 5, 7 ngày hạn.
Xác định tỷ lệ cây sống sót (%) đƣợc tính nhƣ sau:
Theo dõi các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn trƣớc và sau khi gây hạn: (1) Cân khối lƣợng tƣơi của rễ và thân lá theo từng cây (n =10); (2) Cân khối lƣợng khô của rễ và thân lá theo từng cây (n =10). Các mẫu đƣợc sấy khô tuyệt đối ở 1050C đến khối lƣợng không đổi. (3) Tính tỷ lệ thân, lá khô/thân lá tƣơi ở thời điểm sau 5 ngày hạn, sau 7 ngày hạn theo từng cây và sau đó tính trung bình, theo công thức:
Tỷ lệ thân, lá khô/thân lá tƣơi (%) = Khối lƣợng thân lá khô Khối lƣợng thân lá tƣơi
Tỷ lệ CKH = Số CKH (%)
- Chỉ số chịu hạn tƣơng đối đƣợc tính theo công thức: ) ( sin 2 1 ka ik hi gh fg ef de cd bc ab S
Trong đó: S: chỉ số chịu hạn tương đối; a: % CKH sau 3 ngày hạn b: % CKH sau 5 ngày hạn c: CKH sau 7 ngày hạn d: KNGN sau 3 ngày hạn e: KNGN sau 5 ngày hạn f: KNGN sau 7 ngày hạn
g: Tỷ lệ rễ khô/rễ tươi sau 5 ngày hạn h: Tỷ lệ rễ khô/rễ tươi sau 7 ngày hạn
i: Tỷ lệ thân, lá khô/thân lá tươi sau 5 ngày hạn k: Tỷ lệ thân, lá khô/thân, lá tươi sau 5 ngày hạn
α: góc tạo bởi 2 trục mang trị số gần nhau và tính bằng 360/10= 360
.
2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 [42] nhƣ sau:
Tách DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Thêm 0,8 ml đệm rửa, li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại bƣớc này 2 lần).
- Bổ sung 700 μl đệm tách, trộn nhẹ.
Ủ ở 65оC trong thời gian 1h, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform: isoamyl (24:1), dùng máy trộn trộn đều khoảng 20 phút.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm isopropal, trộn nhẹ đặt nên đá (để trong 1h), chờ đến khi xuất hiện tủa trắng.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Thêm 300 μl cồn 70%, búng nhẹ.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (bƣớc này lặp lại 2 lần). - Làm khô DNA bằng máy speed vac;
- Hòa tan DNA trong 30 μl nƣớc tinh khiết (nƣớc đã đƣợc ủ ấm ở 60о trong thời gian 10 phút). Lắc đều để DNA hòa tan hoàn toàn.
Kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% - 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi bản gel trên máy soi gen tia UV và chụp ảnh. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.2.2. Kỹ thuật PCR
Sau khi đã tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân gen DREB2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen đã công bố trên GenBank có mã số DQ054363. Bảng 2.3 trình bày trình tự nucleotide của cặp mồi SoyDreb2F/SoyDreb2R.
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2
Mồi Trình tự mồi
SoyDreb2F 5’ ATG GAA GAA GCG GGT TTA G 3’
Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.4 và bảng 2.5. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Bảng 32.Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 11 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0
7 Taq-polymerase (5U/1µl) 1
8 DNA mẫu 2
Tổng 25
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
Lặp lại 30 chu kỳ
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm bản