3. Nội dung nghiên cứu
3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2
Sau khi thu nhận đƣợc gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5. Tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung Kanamycin và X- gal, để qua đêm, kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng trong và khuẩn lạc màu xanh (Hình 3.5).
Hình 3.5. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5
chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB2
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong LB lỏng có bổ sung bổ sung ampicillin, để qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony–PCR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony–PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di tren gel agarose 1% trong đệm TAE 1X (Hình 3.6).
Sau khi biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã lựa chọn ở mức tối ƣu, tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep
Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen GmDREB2
trực tiếp từ khuẩn lạc
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2- HG1, 3,4- BG, 5,6- BS, 7,8 – HG4)
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen GmDREB2 của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen GmDREB2
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 M 7 8
0,5kb 1,0kb
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm tách dòng gen và plasmid đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ giải trình tự gen DREB2. Để xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB2 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA
capillary electrophoresis system. Kết quả đọc trình tự nucleotide của 4 mẫu plasmid tái tổ hợp từ 4 giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và HG4 đƣợc so sánh bằng BLAST trên NCBI cho thấy chỉ ở 2 trình tự phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS và BG là gen GmDREB2. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, kết quả thu đƣợc trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8 cho thấy kích thƣớc gen GmDREB2 phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS, BG đều có kích thƣớc là 480 nucleotide. Từ kết quả này chúng tôi đi đến kết luận đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS và BG.
3.2.4. So sánh trình tự nucleotide của gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS, BG với trình tự đã công bố
Kết quả so sánh ở Hình 3.8 cho thấy trình tự nucleotide của gen
GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS và BG với trình tự nucleotide của gen DREB2 đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế (NCBI) có mã số DQ054363 có sự sai khác ở 7 vị trí nucleotide: 159, 163, 165, 178, 202, 219, 261. Trình tự gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự mã số DQ054363 có độ tƣơng đồng cao, khoảng hơn 99%. Kết quả này đã khẳng định gen
Hình 3.8. Trình tự gen GmDREB2 phân lập từ hai giống đậu tƣơng BG, BS
3.2.5. So sánh trình tự amino acid của protein DREB2 của hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự đã công bố
Kết quả so sánh trình tự amino acid trong chuỗi polypeptide do gen
GmDREB2 mã hoá của hai giống đậu tƣơng BS, BG đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Sơ đồ so sánh trình tự amino acid của protein DREB2 suy diễn từ trình tự gen GmDREB2
Trình tự amino acid của protein DREB2 của giống đậu tƣơng BS và BG với trình tự amino acid của protein DREB2 có mã số AAY89658 có sự sai khác ở 1 vị trí amino acid là 68, mức độ tƣơng đồng cao 99%.
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ
TRÌNH TỰ AMINO ACID CỦA GEN DREB2 Ở CÂY ĐẬU TƢƠNG
3.3.1. Sự đa dạng của các giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide của gen DREB2 nucleotide của gen DREB2
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng di truyền và hệ số khác nhau trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide của gen DREB2 ở 11 giống đậu tƣơng, đó là:
BS, BG, NM_001250325, DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự gen GmDREB2
của hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự gen GmDREB2 của 9 giống đậu tƣơng trên GenBank
Kết quả cho thấy hệ số tƣơng đồng di truyền về trình tự gen GmDREB2
của 11 giống đậu tƣơng nghiên cứu là rất cao, dao động từ 96,2% - 100%. Độ tƣơng đồng giữa 9 trình tự gen GmDREB2 đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế thấp nhất là 96,2% và cao nhất là 99,8%.
Gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BS có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 lần lƣợt là 98,5%, 99,8%, 96,4%, 98,8%, 97,8%, 96,2%, 96,4%, 98,6%. Gen GmDREB2 của giống đậu tƣơng BG có độ tƣơng đồng so với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 lần lƣợt là 98,5%, 99,8%, 96,4%, 98,8%, 97,8%, 96,2%, 96,4%, 98,6%.
Hệ số sai khác giữa giống đậu tƣơng BG và BS với các giống có mã số DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 giao động từ 0,2% - 3,9%.
Mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự gen GmDREB2 đƣợc thể hiện ở sơ đồ hình cây trên Hình 3.10.
Hình 3.10. Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình tự gen GmDREB2
Biểu đồ hình cây trên Hình 3.10 cho thấy dựa trên trình tự nucleotide của gen DREB2 thì 11 giống đậu tƣơng phân bố ở 5 nhóm, phân thành 2 nhánh với khoảng cách di truyền là 1,4%.
Nhánh I gồm 8 giống BG, BS, FJ965341, NM_001250325, DQ054363, JF946767, JF946771, JF946768. Nhánh II gồm ba giống JF946766, JF946769, JF946770. 1 2 3 4 5
3.3.2. Phân tích sự đa dạng của 11 giống đậu tƣơng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen DREB2
Kết quả xác định hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác trên cơ sở phân tích trình tự amino acid của protein DREB2 ở 11 giống đậu tƣơng BS, BG, NM_001250325, DQ054363, FJ965341, JF946766, JF946767, JF946768, JF946769, JF946770, JF946771 đƣợc trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein DREB2 ở hai giống đậu tƣơng BS, BG và trình tự amino acid của
protein DREB2 của 9 giống đậu tƣơng công bố trên GenBank
Hệ số tƣơng đồng về trình tự amino acid của protein DREB2 của 11 giống đậu tƣơng khoảng từ 96,4%-100%. Hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein DREB2 của 11 giống từ 0% - 3,7%.
Mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng trên cơ sở phân tích trình tự amino acid của protein DREB2 đƣợc thể hiện trong sơ đồ hình cây ở Hình 3.11.
Hình 3.11. Biểu đồ hình cây mô tả mối quan hệ di truyền của 11 giống đậu tƣơng dựa trên mức độ tƣơng đồng của trình tự amino acid của
protein DREB2
Sơ đồ hình cây ở Hình 3.11 cho thấy 11 giống đậu tƣơng phân bố trong 5 nhóm, đƣợc chia làm 2 nhánh lớn, nhánh thứ nhất chỉ có giống JF946768; nhánh thứ hai gồm 10 giống, khoảng cách di truyền giữa hai nhánh là 1,4%. Nhánh thứ hai lại chia làm hai nhánh phụ: Nhánh phụ I có 3 giống: JF946769, JF946770, JF946766; Nhánh phụ II lại chia làm hai nhánh nhỏ: Nhánh nhỏ 1 có 2 giống JF946767 và JF946771; Nhánh nhỏ 2 gồm có giống NM_001250325 và 4 giống BS, BG, DQ054363, FJ965341. Nhƣ vậy hai giống BS và BG phân bố ở nhóm 5. 1 2 3 4 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1.1. Khả năng 7 giống u đã đƣợc xác định
và giống BS 8821,36, HG1 u
h là 4469,26.
1.2. Đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định trình tự gen GmDREB2
phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS và BG. Trình tự gen GmDREB2 có 480 nucleotide, mã hoá 159 amino acid.
1.3. So với trình tự gen DREB2 có mã số DQ054363 trên GenBank, trình tự nucleotide của gen GmDREB2 ở giống BS và BG có độ tƣơng đồng là 98,5% và có sự sai khác ở 7 vị trí nucleotide: 159, 163, 165, 178, 202, 219, 261. Trình tự amino acid của protein DREB2 ở hai giống đậu tƣơng BS và BG so với trình tự amino acid có mã số AAY89658 trên GenBank có mức độ tƣơng đồng 99,4% và sai khác ở 1 vị trí amino acid (vị trí 68).
1.4. Đã xác định đƣợc sự đa dạng của hai giống đậu tƣơng (BS, BG) và 9 giống đậu tƣơng có trình tự trên GenBank. Khoảng cách di truyền của các 11 giống đậu tƣơng dựa trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2 và trình tự amino acid của protein DREB2 là 1,4%.
2. Đề nghị
Tiếp tục phân lập gen GmDREB2 từ mRNA để thiết kế vector phục vụ tạo cây đậu tƣơng chuyển gen nhằm cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tƣơng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi của cây lúa, Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội, 250 trang. 2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình cao học Nông nghiệp, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Ngô Thế Dân và cs(1999), Cây đậu tương, Nxb Nông Nghiệp.
4. Nguyễn Đăng Khôi (1997), Các cây đậu ăn hạt ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, số 2, tr: 5-6.
5. Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hoá sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
6. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội.
7. Chu Hoàng Mậu, Nông Thị Man, Lê Trần Bình (2001), Đánh giá một số tính trạng kinh tế quan trọngvà khả năng chịu hạn của các dòng đậu tương (Glycine max (L.) Merril) Đột biến, Tạp chí Khoa học và Công nghệ,1(13), Đại Học Thái Nguyên,16-21.
8. Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền hiện đại trong chọn giống cây trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên.
9. Nguyễn Thị Tâm (2004), Nghiên cứu khả năng chịu nóng và chọn dòng chịu nóng ở lúa bằng công nghệ tế bào thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học Hà Nội.
10. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2008), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và phân lập một số gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu xanh (Vigna
radiata (L.) Wilczeck), Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội.
Tài liệu Tiếng Anh
11. Barrett AJ, Rawlings ND, Davies ME, Machleidt W, Salvesen G, Turk V (1986), Cysteine proteinase inhibitor of the cystatin superfamily. In: A.J. Barrett, G. Salvesen (Eds.), Proteinase Inhibitors. Elsevier, Amsterdam, The Netherlands, 519- 569.
12. Borbani O, Zhu J, Verslues PE, Sunkar R, and Zhu JK. (2005), Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis- antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis. Cell 123: 1279- 1291.
13. Cao Xin-You., You-Zhi M., (2008), Isolation and Identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybean
(Glycine max), Acta agronomica sinica, 34 (10), pp. 1688−1695.
14. Chen F., Chen S.Y. and Liu Q. (2002), Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses. NCBI, Gen Bank, Accession. AY064403.
15. Chen J, Xia X, Yin W. (2009), Expression profiling and functional characterization of a DREB2-type gene from Populus euphratica. College of Forestry, Beijing Forestry University, No. 35, Qinghua East Road, Beijing 100083, China.
16. Chen M., Wang Q. Y, Cheng X. G, Xu Z. S, Li L. C, Ye X. G, Xia L. Q, Ma Y. Z., (2007). GmDREB2, a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants.
Biochem Biophys Res Commun. 353(2):299-305. Epub 2006 Dec 13.
17. Chen Y., Chen P. and de los Reyes B.G. (2004), Analysis of the expression of DREB1 gene orthologs in cultivated and wild species of
soybean. NCBI, Gen Bank, Accession. AY802779
18. Fujita Y., Fujita M., Satoh R., Maruyama K., Parvez M. M., Seki M., Hiratsu K., Ohme-Takagi M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., (2005), AREB1 is a transcription activator of novel ABRE-dependent ABA signaling that enhances drought stress tolerance in Arabidopsis,
Plant Cel, 17(12), pp. 3470-88.
19. Gaiyun Zhang, Ming Chen, Liancheng Li, Zhaoshi Xu, Xueping Chen, JiamingGuo and Youzhi Ma, (2009), Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco ,
Journal of Experimental Botany, 60(13), pp. 3781-3796.
20. Hartl F.U (1996), Moleculer chaperones in cellular protein folding,
Nature, 381, pp. 571- 580.
21. Huang B., Jin,L. and Liu J.(2007), Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton, Sci. China, C, Life Sci. 50 (1), 7-14.
22. Kobayashi F, Ishibashi M, Takumi S. (2008). Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco. Laboratory of Plant Genetics, Graduate School of Agricultural Science, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, 657-8501, Japan.
23. Lei T., Wang Q.Y., Zhai Y., Wang Y., Li J.W., Yan F., Su L.T., (2011), Characterization of a GmHSP70 Gene in Soybean, NCBI, Http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
24. Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y., (2005), Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses, Theor Appl Genet, 110(8), pp. 1355-62.
25. Liao Y., Zou H.F., Wang H.W., Zhang W.K., Ma B., Zhang J.S., Chen S.Y., (2008), Soybean GmMYB76, GmMYB92, and GmMYB177 genes confer stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants, Cell Res,
18(10), pp. 1047–1060.
26. Lin R., Zhao W., Meng X., Wang M., Peng Y., (2007), Rice gene OsNAC19 encodes a novel NAC-domain transcription factor and responds to infection by Magnaporthe grisea, Plant Sci, 172 (1), pp. 120-130.
27. Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein I (ltp 1) mRNA, complete cds, EMBL GenBank, Accession AY300806.
28. Liu K.H., Lin T.Y., (2004), Vigna radiata lipid trasfer protein II (ltp 2) mRNA, complete cds, EMBL Gen Bank, Accession AY300807.
29. Liu L, Zhu K, Yang Y, Wu J, Chen F, Yu D.(2008), Molecular cloning, expression profiling and trans-activation property studies of a DREB2-like gene from chrysanthemum (Dendranthema vestitum). National Center for Soybean Improvement, National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing, 210095, People's Republic of China.
30. Liu W. and Feng F. (2008), Nicotiana tabacum DREB4 mRNA, complete cds, College of Life Science, Henan Agricultural University, Wenhua Road, Zhengzhou, Henan 450002, P.R. China.
31. Lucas S., Hammon N., Glavina del Rio T., Detter J., Dalin E., Tice H., Pitluck S., Tuskan G., Chapman J., Putnam N.H., (2005), Populus
trichocarpa AP2/ERF domain-containing transcription factor (DREB11), mRNA, US DOE Joint Genome Institute, 2800, Mitchell Drive B100, Walnut Creek, CA 94598-1698, USA.
32. Mukai T., Sakaki T., Akiyama T., 2003, Oryza sativa (japonica cultivar-group) lipid transfer protein-like protein (LTP2) mRNA, complete cds, Accession AY466109.
33. Nakashima K, Shinwari ZK, Skuma Y, Seki M, Miura S, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. (2000), Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity-responsive gene expression. Biological Resources Division, Japan International Research Center for Agricultural Sciences, Tsukuba, Ibaraki.
34. Nguyen H.T.T., Chu M.H., Le S.V., Nguyen C.H., Chu H.H., 2009,
Glycine max mRNA for hypothetical protein (P5CS gene), isolate Song
Ma-Son La (SL5), Accession FM999729.
35. Porcel R., Azcon R., Ruiz-Lozano J.M., (2005), Evaluation of the role of genes encoding for delta1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS) during drought stress in arbuscular mycorrhizal Glycine max and
Lactuca sativa plants, NCBI, Accession AJ715851.
36. Qin F., Li J., Zhao J., Chen S.-Y. and Liu Q. (2002) Isolation of a maize cDNA encoding an DREB-like protein induced by stress, NCBI, Gen Bank, Accession. AF448789.
37. Sohn KH, Lee SC, Jung HW, Hong JK, Hwang BK. 2006. Expression snd functional roles of the pepper pathogen- induced transcription factor RAV1 in bacterial disease resistance, and drought and salt stress tolerance.
Plant Molecular Biology 61, 897- 915.
38. Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simopson S. D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi – Shinozaki K., (2007),