3. Nội dung nghiên cứu
2.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Phƣơng pháp tách DNA tổng số theo Gawel và cs năm 1991 [42] nhƣ sau:
Tách DNA tổng số đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau: - Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
- Thêm 0,8 ml đệm rửa, li tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi (lặp lại bƣớc này 2 lần).
- Bổ sung 700 μl đệm tách, trộn nhẹ.
Ủ ở 65оC trong thời gian 1h, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Thêm 600 μl chloroform: isoamyl (24:1), dùng máy trộn trộn đều khoảng 20 phút.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút 500 μl dịch trong sang ống 1,5 ml, bỏ tủa.
- Thêm isopropal, trộn nhẹ đặt nên đá (để trong 1h), chờ đến khi xuất hiện tủa trắng.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô. - Thêm 300 μl cồn 70%, búng nhẹ.
- Li tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ cồn (bƣớc này lặp lại 2 lần). - Làm khô DNA bằng máy speed vac;
- Hòa tan DNA trong 30 μl nƣớc tinh khiết (nƣớc đã đƣợc ủ ấm ở 60о trong thời gian 10 phút). Lắc đều để DNA hòa tan hoàn toàn.
Kiểm tra sản phẩm DNA tách chiết đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8% - 1%. Sản phẩm điện di đƣợc nhuộm bằng ethidium bromide, soi bản gel trên máy soi gen tia UV và chụp ảnh. Dựa vào hình ảnh điện di kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm đã tách chiết.
2.2.2.2. Kỹ thuật PCR
Sau khi đã tách chiết và tinh sạch DNA tổng số, tiến hành nhân gen DREB2 bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế dựa trên trình tự gen đã công bố trên GenBank có mã số DQ054363. Bảng 2.3 trình bày trình tự nucleotide của cặp mồi SoyDreb2F/SoyDreb2R.
Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi nhân gen DREB2
Mồi Trình tự mồi
SoyDreb2F 5’ ATG GAA GAA GCG GGT TTA G 3’
Thành phần, chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong bảng 2.4 và bảng 2.5. Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Bảng 32.Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 11 2 Dung dịch đệm 10X 2,5 3 MgCl2 (25mM) 2,5 4 dNTPs (2,5 mM) 2,0 5 Mồi xuôi (10 pM/µl) 2,0 6 Mồi ngƣợc (10 pM/µl) 2,0
7 Taq-polymerase (5U/1µl) 1
8 DNA mẫu 2
Tổng 25
Bảng 2.5. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
Lặp lại 30 chu kỳ
3 Gắn mồi 56 1 phút
4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây
5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, nhuộm bản gel trong ethydium bromid 10 phút, rửa lại bằng nƣớc với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
2.2.2.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
Sau khi nhân đƣợc gen DREB2, bƣớc tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh sạch và không lẫn gel agarose. Vì vậy, cần phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR .
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo bộ Kit DNA extraction Kit K05013 của hãng Fermentas theo các bƣớc nhƣ sau:
- Cắt lấy bản điện di có kích thƣớc khoảng 924 bp trên bản gel agarose cho vào ống eppendorf 1,5 ml.
- Bổ sung 1000 μl dung dịch Binding solution.
- Ủ ở 55оC trong khoảng 20 phút, 5 phút trộn nhẹ một lần cho gel tan hoàn toàn thành dịch trong suốt.
- Bổ sung 5-10μl Silica power suspension vào và ủ hỗn hợp ở 55оC khoảng 5 phút. Trộn và lắc đều khoảng 2 phút.
- Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nổi, thu cặn màu trắng. - Thêm 500μl buffer wash. Lắc đều trong 2 phút. Li tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, loại dịch nồi, thu cặn (lặp lại 3 lần).
- Hút dịch nổi bằng pipetman. - Làm khô DNA trong box.
- Hòa tan DNA trong 20μl H2O detion khử trùng rồi ủ sản phẩm ở 55оC trong 5- 10 phút.
Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1%. Sản phẩm tinh sạch sản phẩm PCR nhuộm bằng ethidium bromide, soi và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
2.2.2.4. Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch sẽ đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT
Hình 2.2. Sơ đồ vector pBT
Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT đƣợc thể hiện ở Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng pBT
STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nƣớc cất khử ion khử trùng 12,2 2 DNA 4 3 Ligation buffer 10X 2 4 Vector pBT 1 5 Enzyme T4 ligase 0,8 Tổng 20
Hỗn hợp đƣợc ủ ở 220C trong 1h, sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
2.2.2.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5
- Hỗn hợp đƣợc ủ ở 22оC trong 1h, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến
E.coli DH5α. Bổ sung 7 μl vector đã gắn gen vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ.
- Đặt hỗn hợp vào đá trong 30 phút sau đó ủ ở 42о trong 1 phút. Tiếp tục đặt hỗn hợp trên vào đá trong 5 phút.
- Bổ sung 400 μl môi trƣờng LB lỏng (pepton, cao nấm men, NaCl) vào hỗn hợp rồi tiến hành lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ ở 37оC. sử dụng que cấy trải, trải 200 μl dịch khuẩn lên đĩa môi trƣờng LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agarose) có chứa kháng sinh ampicillin 100 mg/l, X- gal (40 mg/l) và IPTG 100 μM.
- Ủ đĩa ở 22оC trong 16h.
- Chọn những khuẩn lạc có màu trắng nuôi trong môi trƣờng LB lỏng đƣợc bổ sung ampicilline, để qua đêm.
2.2.2.6. Tách chiết plasmid
Sau khi kiểm tra sản phẩm colony-PCR tiến hành tách plasmid bằng bộ Kit AccuPrep Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Các bƣớc tách chiết plasmid:
(1) Lấy dịch vi khuẩn li tâm 3000 vòng/phút trong 7 phút, bỏ dịch thu cặn.
(2) Hòa cặn trong 250 l Resuspension Buffer for plasmid (Buffer 1), đảo nhẹ. (3) Bổ sung 250 l Lysis Buffer for plasmid (Buffer 2) vào ống trên, đảo nhẹ.
(4) Bổ sung 350 l Neutralization Buffer for plasmid (Buffer 3), đảo nhẹ để tránh kết tủa cục bộ.
(5) Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Hút dịch nổi cho chảy qua cột tinh sạch plasmid của hãng Bioneer.
(6) Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(7) Bổ sung 500 l Denaturation Buffer for plasmid (Buffer D), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(8) Bổ sung 700 l Washing Buffer for plasmid (Buffer 4), li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
(9) Đặt cột sang ống 1,5 ml mới, cho 20 l H2O vào chính giữa cột, để ở nhiệt độ phòng khoảng 3 phút và li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Thu nhận plasmid.
Kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dƣới ánh sáng đèn cực tím.
2.2.2.7. Phương pháp phân tích trình tự gen
Trình tự của gen đƣợc xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic Analyzer (Applied Biosystem) sử dụng bộ hoá chất sinh chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing.
2.2.2.8. Xử lý kết quả và tính toán số liệu
Các số liệu đƣợc Xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel với mức ý nghĩa α=0,05 ; n≤ 30.Mỗi thí nghiệm đƣợc nhắc lại 3 lần.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU
Phân tích tác động của hạn đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây đậu tƣơng thông qua tính tỉ lệ cây héo và tỉ lệ cây chết, kết quả cho thấy tỉ lệ cây héo và cây chết của các giống đậu tƣơng tăng theo thời gian gây hạn và có sự phản ứng đối với hạn biểu hiện khác nhau giữa các giống.
Khi bị hạn lƣợng nƣớc trong tế bào giảm gây tổn thƣơng cho cây, các giống khác nhau sẽ có những đáp ứng khác nhau để làm giảm hoặc tránh bị tổn thƣơng. Trƣớc khi gây hạn thì cả 7 giống đậu tƣơng đều chƣa có cây héo và cây chết (Hình 3.1). Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy ở thời điểm 3 ngày sau khi xử lý hạn các cây đậu tƣơng đã bắt đầu có sự thay đổi, bắt đầu có cây héo, tỉ lệ cây không héo khá cao, cao nhất là giống BS (93,33%), thấp nhất là giống HG1 (70%). Sau 5 ngày xử lí hạn mức độ ảnh hƣởng đã tăng lên rõ rệt. Sau 7 ngày thì cả 7 giống tỉ lệ cây héo và tỉ lệ cây chết đã tăng cao (Hình 3.2).
Hình 3.1. Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng trƣớc khi gây hạn
Giống BS có tỉ lệ cây sống và khả năng giữ nƣớc là cao nhất sau đó đến giống HG2. Tỉ lệ cây sống và khả năng giữ nƣớc thấp nhất là giống HG1 (Bảng 3.1). Kết quả theo dõi đã chứng tỏ khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu ở mức độ cây non 3 lá là khác nhau và phụ thuộc vào genotype của mỗi giống.
Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tƣơng ở giai đoạn cây non 3 lá chét đƣợc phân tích với các tính trạng, đó là: (1) tỉ lệ cây không héo ở thời điểm sau 3, 5, 7 ngày hạn; (2) khả năng giữ nƣớc ở thời điểm sau 3, 5, 7 ngày hạn; (3) tỉ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 5, 7 ngày hạn; (4) tỉ lệ thân lá khô/thân lá tƣơi sau 5, 7 ngày hạn (Bảng 3.1). Bảng 3.1 cho thấy chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc sắp xếp theo thứ tự từ cao đến thấp nhƣ sau:
BS > HG4 > HG5 > HG2 > HG3 > BG > HG1
Giống BS có chỉ số chịu hạn tƣơng đối cao nhất và giống có chỉ số chịu hạn thấp nhất là giống HG1. Nhƣ vậy giống BS có khả năng chịu hạn cao nhất, giống HG1 có khả năng chịu hạn thấp nhất.
Hình 3.2. Hình ảnh cây đậu tƣơng non của 7 giống đậu tƣơng sau 7 ngày hạn
Bảng 3.1. Chỉ số chịu hạn của các giống đậu tƣơng nghiên cứu % CKH sau 3 ngày hạn % CKH sau 5 ngày hạn % CKH sau 7 ngày hạn KNGN sau 3 ngày hạn (%) KNGN sau 5 ngày hạn (%) KNGN sau 7 ngày hạn (%) Tỷ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 5 ngày hạn Tỷ lệ rễ khô/rễ tƣơi sau 7 ngày hạn Tỷ lệ thân, lá khô/thân lá tƣơi sau 5 ngày hạn Tỷ lệ thân lá khô/thân lá tƣơi sau 7 ngày hạn Chỉ số chịu hạn tƣơng đối Xếp thứ tự khả năng chịu hạn HG1 70,00 53,33 43,33 76,23 62,62 17,30 0,13 0,16 0,06 0,11 4469,26 4 HG2 83,33 56,67 53,33 82,86 68,74 24,56 0,12 0,15 0,07 0,12 5746,16 3 BS 93,33 83,33 76,67 88,80 71,36 37,79 0,18 0,18 0,12 0,15 8821,36 1 HG4 80,00 73,33 66,67 83,62 61,40 32,84 0,13 0,10 0,08 0,09 6901,22 2 HG5 73,33 70,00 63,33 85,72 62,07 33,20 0,11 0,13 0,09 0,80 6591,66 2 HG3 86,67 63,33 53,33 79,44 60,22 27,52 0,14 0,10 0,10 0,10 5744,97 3 BG 76,67 60,00 50,00 81,84 65,80 26,88 0,15 0,09 0,09 0,11 5539,94 3
3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GEN GmDREB2 TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƢƠNG NGHIÊN CỨU TƢƠNG NGHIÊN CỨU
3.2.1. Tách chiết DNA từ lá non hạt đậu tƣơng
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử. Chất lƣợng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA tổng số của các giống đậu tƣơng theo phƣơng pháp của Gawel và Jarret (1991).
Lá non 7 ngày tuổi của các giống đậu tƣơng địa phƣơng có khả năng chịu hạn khác nhau, nhƣ: BS (chịu hạn tốt nhất), BG, HG4 và HG1 (chịu hạn kém nhất) đƣợc sử dụng để tách DNA tổng số.
Kết quả cho thấy mẫu DNA thu đƣợc sáng rõ và gọn. Điều này chứng tỏ DNA đƣợc tách chiết từ các giống đậu tƣơng đều tƣơng đối sạch, không bị đứt gãy, ít tạp chất và có thể sử dụng để nhân gen bằng kỹ thuật PCR (Hình 3.3).
Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng số của 4 mẫu HG1, BG, HG4 và BS
(1- HG1, 2- BG, 3- HG4, 4 - BS)
1 2 3 4
3.2.2. Kết quả nhân gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR
Trên cơ sở xác định đƣợc nồng độ DNA khuôn tối ƣu cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành nhân gen GmDREB2 từ hệ gen của bốn giống đậu tƣơng BS, BG, HG4 và HG1. Sử dụng DNA hệ gen làm khuôn để khuếch đại gen GmDREB2 với cặp mồi Dreb2soyF/Dreb2soyR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide của gen DREB2 đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số DQ208968. Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với các điều kiện khác nhau và nhận thấy rằng phản ứng PCR xảy ra tối ƣu trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56C. Sau 30 chu kỳ phản ứng, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0%.
Kết quả nhân gen GmDREB2 cho thấy, ở cả bốn giống đậu tƣơng BS, BG, HG4 và HG1 gen GmDREB2 đều có kích thƣớc ƣớc tính khoảng 0,5kb. Kết quả này phù hợp với tính toán lý thuyết khi thiết kế cặp mồi để nhân gen này.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân gen GmDREB2
của bốn giống đậu tƣơng nghiên cứu
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1- HG1, 2- BG, 3- HG4, 4 - BS)
M 1 2 3 4
0,5kb 1,0kb
3.2.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự gen GmDREB2
Sau khi thu nhận đƣợc gen GmDREB2 bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR tinh sạch đƣợc gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT và sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5. Tiến hành nuôi cấy trên môi trƣờng LB có bổ sung Kanamycin và X- gal, để qua đêm, kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng trong và khuẩn lạc màu xanh (Hình 3.5).
Hình 3.5. Đĩa nuôi cấy dòng tế bào khả biến E.coli chủng DH5
chứa vector tái tổ hợp mang gen GmDREB2
Khi trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng, lựa chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong LB lỏng có bổ sung bổ sung ampicillin, để qua đêm. Lấy dịch nuôi khuẩn thực hiện phản ứng colony–PCR để xác định khuẩn lạc có mang gen mong muốn. Sản phẩm colony–PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di tren gel agarose 1% trong đệm TAE 1X (Hình 3.6).
Sau khi biến nạp và chọn dòng đã đƣợc thực hiện tốt, phản ứng PCR đã lựa chọn ở mức tối ƣu, tiếp tục tiến hành tách plasmid theo bộ Kit AccuPrep
Plasmid Extraction của hãng Bioneer. Sản phẩm tách plasmid đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, với sự có mặt của thang DNA chuẩn và chụp ảnh dƣới ánh sáng cực tím.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm colony – PCR gen GmDREB2
trực tiếp từ khuẩn lạc
(M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1, 2- HG1, 3,4- BG, 5,6- BS, 7,8 – HG4)
Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen GmDREB2 của các giống đậu tƣơng nghiên cứu đƣợc thể hiện ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Hình ảnh điện di tách plasmid tái tổ hợp mang gen GmDREB2
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 M 7 8
0,5kb 1,0kb
Kết quả điện di trên Hình 3.7 cho thấy, sản phẩm tách dòng gen và plasmid đảm bảo chất lƣợng và số lƣợng phục vụ giải trình tự gen DREB2. Để xác định trình tự nucleotide của gen GmDREB2 đã tách dòng, chúng tôi tiến hành đọc trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI- 3130 DNA
capillary electrophoresis system. Kết quả đọc trình tự nucleotide của 4 mẫu plasmid tái tổ hợp từ 4 giống đậu tƣơng BS, BG, HG1 và HG4 đƣợc so sánh bằng BLAST trên NCBI cho thấy chỉ ở 2 trình tự phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS và BG là gen GmDREB2. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, kết quả thu đƣợc trình bày ở Hình 3.8.
Hình 3.8 cho thấy kích thƣớc gen GmDREB2 phân lập từ hai giống đậu tƣơng BS, BG đều có kích thƣớc là 480 nucleotide. Từ kết quả này chúng tôi đi đến kết luận đã nhân bản, tách dòng thành công và xác định đƣợc trình tự đoạn gen GmDREB2 của hai giống đậu tƣơng BS và BG.