Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus Epstein Barr ở Việt Nam và quy trình sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.10/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP VÀ CÁC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS EPSTEIN BARR Ở VIỆT NAM VÀ QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN (MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC 10.31/06-10) Cơ quan chủ trì đề tài : TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Chủ nhiệm đề tài : PGS.TS. NGUYỄN ĐÌNH PHÚC 8658 Hà nội - 2011 ĐỀ TÀI KHCN CẤP NHÀ NƯỚC MÃ SỐ: KC 10.31/06-10 CN: PGS.TS. NGUYỄN ĐÌNH PHÚC HÀ NỘI - 2011 B ÁO C ÁO TỔNG HỢP VÀ CÁC SẢN PHẨM KHCN NỘI DUNG PHẦN 1 : BÁO CÁO TỔNG HỢP CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS EPSTEIN-BARR Ở VIỆT NAM CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ CHƯƠNG 5: KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN VẬT LIỆU CHO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ CHƯƠNG 6: KẾT QUẢ TẠO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤ NG KIT CHƯƠNG 7: BÀN LUẬN VỀ ĐỘ NHẠY VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA 2 BỘ KIT PHỤ LỤC PHẦN 2: CÁC SẢN PHẨM KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 1. BÁO CÁO ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM 2. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 3. QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 4. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 5. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 6. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ 7. QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT MIỄN DỊCH H ỌC SẮC KÝ 8. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ 9. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ. PHẦN 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP i MỤC LỤC MỤC LỤC i CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG xiv ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. DỊCH TỄ HỌC CỦA UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG VÀ EBV 4 1.1.1. TẦN SỐ MẮC UTVMH VÀ YẾU TỐ ĐỊA LÝ CỦA EBV 4 1.1.2. VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG 4 1.1.3. SỰ NHÂN LÊN VÀ TÀNG NHIỄM GÂY UNG THƯ CỦA EBV 6 1.2. CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA EPSTEIN-BARR VIRUS 8 1.2.1. CẤU TRÚC PHÂN T Ử CỦA EBV 8 1.2.2. SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ SẮP XẾP HỆ GEN CỦA EBV 9 1.3. CHẨN ĐOÁN EBV BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 15 1.3.1. KỸ THUẬT PCR 15 1.3.2. KỸ THUẬT ĐIỆN DI 18 1.3.3. KỸ THUẬT TÁCH DÒNG 19 1.3.4. KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 21 1.4. NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC ASSAY, ICA) VÀ QUI TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT ICT (IMMUNO CHROMATOGRAPHIC TEST) 21 1.4.1. TẦM QUAN TRỌNG CỦA ICA TRONG CHẨN ĐOÁN 21 1.4.2. NGUYÊN LÝ CH ẨN ĐOÁN KIT ICA 24 1.4.3. THÀNH PHẦN TẠO KIT ICT 25 1.5. NGUYÊN TẮC CHẨN ĐOÁN DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR VÀ QUI TRÌNH XÂY DỰNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ( SHPT) 28 1.5.1. NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 28 1.5.2. NGUYÊN TẮC SỬ DỤNG VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ KIT SHPT 28 1.5.3. NGUYÊN TẮC XÂY DỰNG VÀ SẢN XUẤT BỘ KIT SHPT 29 1.6. TẦM QUAN TRỌNG CỦA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV Ở VIỆT NAM VÀ QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN 29 1.6.1. Chẩn đoán sớm UTVMH có thể phối hợp giữa lâm sàng và xét nghiệm 30 1.6.2. Đề nghị có sự hợp tác chặt chẽ của nhiều chuyên ngành 30 ii CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ 34 2.1.1. ĐỐI TƯỢNG THU MẪU BỆNH PHẨM NGHIÊN CỨU 34 2.1.2. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ BẢO QUẢN MẪU UTVMH 34 2.1.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ 34 2.1.4. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI KIỂM TRA DNA TỔNG SỐ 34 2.1.5. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ THU NHẬ N GEN EBNA-1 35 2.1.6. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU, THỰC HIỆN PCR VÀ THU NHẬN GEN LMP-1 36 2.1.7. PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 37 2.1.8. PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG THU NHẬN TOÀN BỘ SẢN PHẨM GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 38 2.1.9. PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA -1 VÀ LMP-1 39 2.1.10. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VỊ TRÍ ACID AMIN 487 CỦA GEN EBNA-1 ĐỂ XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV 41 2.1.11. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN EBNA-1, LMP-1 VÀ SO SÁNH ĐỐI CHIẾU VỚI CÁC CHỦNG EBV TRÊN THẾ GIỚI 41 2.2. PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42 2.2.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA KIT SINH HỌC PHÂN T Ử 42 2.2.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 42 2.2.3. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ, TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 CHO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 43 2.2.4. PHƯƠNG PHÁP TỐI ƯU HÓA NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU TRÌNH NHIỆT CHO PCR CỦA KHUÔN DƯƠNG TÍNH ĐỂ SẢN XUẤT KHUÔN ĐỐI CHỨNG DƯƠNG TÍNH 46 2.2.5. PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM, KIỂM TRA BỘ KIT SHPT ĐỂ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT SHPT 47 2.2.6. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢ N XUẤT KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 49 2.2.7. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG QUI TRÌNH SỬ DỤNG KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 50 2.2.8. PHƯƠNG PHÁP XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ KIT SHPT 50 2.3. PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (ICT) 50 2.3.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ, THÀNH PHẦN CỦA KIT ICT 50 iii 2.3.2. PHƯƠNG PHÁP THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN KHÁNG NGUYÊN EBNA-1 (THIẾT KẾ MỒI, PCR, NHÂN DÒNG, KIỂM TRA VÀ THU NHẬN PROTEIN EBNA-1) 51 2.3.3. PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN, TINH SẠCH PROTEIN EBNA-1 53 2.3.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO TẾ BÀO LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT HÓA KHÁNG NGUYÊN EBNA-1) 55 2.3.5. PHƯƠNG PHÁP NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN PHÁT TRIỂN TẾ BÀO LAI EBNA-1 (để sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và kháng thể đơn dòng MAb EBNA-1) 58 2.3.6. PHƯƠNG PHÁP TẠO BÁNG CHO CHUỘT BẰNG TẾ BÀO HYBRID, THU DỊCH, TINH SẠCH KHÁNG THỂ 60 2.3.7. PHƯƠNG PHÁP GẮN KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 VÀO HẠT NANO VÀNG 62 2.3.8. PHƯƠNG PHÁP CHẾ TẠO VÀ HOÀN CHỈNH BỘ SINH PHẨM SẮC KÝ MIỄN DỊCH ICT 63 2.3.9. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY ĐỘ ĐẶ C HIỆU CỦA BỘ KIT SĂC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) 67 2.3.10. TRÊN CƠ SỞ PHƯƠNG PHÁP TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH (ICT), ĐÃ ĐƯỢC THỬ NGHIỆM THÀNH CÔNG, LÀ CƠ SỞ KHOA HỌC ĐỂ XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, SỬ DỤNG, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VÀ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH CHẨN ĐOÁN EBV 68 2.4. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 70 2.4.1. DỤNG CỤ VÀ TRANG THIẾT BỊ MÁY MÓC 70 2.4.2. HÓA CHẤT 71 2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 73 2.5.1. QUI TRÌNH CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ MÔ BỆNH HỌC 73 2.5.2. QUI TRÌNH LẤY MẪU BỆNH PHẨM SINH THIẾT CHẨN ĐOÁN GEN EBV 73 2.6. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊM CỨU 74 2.6.1. THU MÃU BỆNH PHẨM 74 2.6.2. NGHIÊN CỨU LABO 74 2.7. XỬ LÝ SỐ LIỆU 74 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ VIRUS EPSTEIN BARR Ở VIỆT NAM 76 3.1. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN LÂM SÀNG VÀ THU MẪU BỆNH PHẨM 76 iv 3.2. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT THU DNA TỔNG SỐ HỆ GEN EBV TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM 76 3.3. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 76 3.3.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 76 3.3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 78 3.3.3. KẾT QUẢ CHẨN ĐOÁN SỰ CÓ MẶT EBV TRONG 50 MẪU BỆNH PHẨM SINH THIẾT BẰNG PCR ĐẶC HIỆU GEN EBNA-1 (EBK1F và EBNA1R) 79 3.4. KẾT QU Ả TÁCH DÒNG VÀ THU NHẬN GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 80 3.5. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 81 3.5.1. THU NHẬN TOÀN BỘ GEN EBNA-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN EBNA-1 81 3.5.2. THU NHẬN TOÀN BỘ GEN LMP-1 QUA GIẢI TRÌNH TỰ GEN LMP-1 82 3.5.3. BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN 82 3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH, XỬ LÝ TRÌNH TỰ CHUỖI GEN ĐỂ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC PHÂN TỬ GEN EBNA-1 VÀ LMP-1 CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆT NAM 84 3.6.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN EBNA-1 84 3.6.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC GEN LMP-1 87 3.6.3. KẾT LUẬN 92 3.7. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆ T NAM 92 3.7.1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI CHIẾU GEN EBNA-1 VỚI THẾ GIỚI 92 3.7.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI CHIẾU GEN LMP-1 VỚI THẾ GIỚI 96 3.7.3. XÁC ĐỊNH PHÂN TYP EBV Ở VỊ TRÍ ACID AMIN 487 GEN EBNA-1 102 3.7.4. BÀN LUẬN 104 3.7.5. KẾT LUẬN 107 CHƯƠNG 4 : KẾT QUẢ TẠO KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108 4.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108 4.1.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 108 4.1.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT SHPT 108 4.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VÀ TỔNG HỢP MỒI ĐẶC HIỆU NHÂN GEN EBNA-1 CHẨN ĐOÁN EBV 109 4.2.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ MỒI ĐẶC HIỆU CHO GEN EBNA-1 109 v 4.2.2. KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VÀ ĐIỆN DI KIỂM TRA VỚI CẶP MỒI ĐẶC HIỆU NHÂN ĐOẠN GEN EBNA-1 111 4.2.3. BÀN LUẬN 111 4.3. KẾT QUẢ ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT PHÙ HỢP CHO PHẢN ỨNG PCR 112 4.3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHỈNH THÔNG SỐ KỸ THUẬT CHO PCR 112 4.3.2. KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM PCR VỚI CÁC THÔNG SỐ ĐÃ ĐIỀU CHỈ NH 113 4.3.3. KẾT QUẢ TỐI ƯU HOÁ NHIỆT ĐỘ BÁM MỒI VÀ CHU TRÌNH NHIỆT 115 4.3.4. KẾT LUẬN 117 4.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHẢN ỨNG PCR ĐỂ XÂY DỰNG CÁC QUI TRÌNH BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 117 4.4.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA PHA LOÃNG NỒNG ĐỘ DNA TỔNG SỐ CỦA MẪU THỬ 117 4.4.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐẶC HIỆ U QUA KHẢO SÁT PCR VỚI CẶP MỒI ĐẶC HIỆU GEN LMP-1 118 4.4.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ NGHIỆM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM LÀ UNG THƯ VMH VÀ KHÔNG UNG THƯ 119 4.5. KẾT QUẢ SẢN XUẤT 100 BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ VÀ XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT, TIÊU CHUẨN CƠ SỞ, QUI TRÌNH SỬ DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN EBV 128 4.5.1. NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT SHPT 128 4.5.2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 129 CH ƯƠNG 5 : KẾT QUẢ TẠO NGUYÊN LIỆU CHO KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (ICT) 135 5.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ VÀ THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ (ICT) 135 5.1.1. XÁC ĐỊNH NGUYÊN LÝ CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ(ICT) 135 5.1.2. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CỦA BỘ KIT MIỄN DỊCH HỌC SẮC KÝ(ICT) 135 5.2. KẾT QUẢ SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP EBNA-1 136 5.2.1. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN EBNA-1 136 5.2.2. KẾT QUẢ XỬ LÝ GEN EBNA-1, VECTOR pET22b(+) VỚI ENZYME GIỚI HẠN XhoI, EcoRI VÀ NỐI GHÉP VỚI NHAU 137 5.2.3. KẾT QUẢ BIẾN NẠP VECTOR TÁI TỔ HỢP VÀO E. coli TG1 137 vi 5.2.4. KẾT QUẢ CHỌN DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP MANG GEN EBNA-1 138 5.2.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, THU PROTEIN EBNA-1 TÁI TỔ HỢP VÀ KIỂM NGHIỆM ĐẶC TÍNH SINH HỌC 139 5.2.6. TINH SẠCH PROTEIN EBNA-1 TRÊN CỘT SẮC KÝ ÁI LỰC 146 5.2.7. KẾT LUẬN 147 5.3. KẾT QUẢ TẠO TỔ HỢP LAI MYELOMA-LYMPHO (BIỆT HOÁ KHÁNG NGUYÊN EBNA-1) VÀ CHỌN LỌC, NUÔI CẤY, KIỂM NGHIỆM DÒNG TẾ BÀO LAI 147 5.3.1. KẾT QUẢ GÂY MIỄN DỊCH CHO CHUỘT THUẦN CHUẨN DÒNG BALB/C BẰNG PROTEIN EBNA1 147 5.3.2. KẾT QUẢ T ẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU EBNA-1 148 5.4. KẾT QUẢ NUÔI DƯỠNG, BẢO QUẢN, KIỂM TRA, PHÁT TRIỂN TẾ BÀO LAI EBNA-1 (ĐỂ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG MAB EBNA-1) 155 5.4.1. KẾT QUẢ KIỂM TRA ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA DỊCH NỔI CỦA 5 DÒNG TẾ BÀO 155 5.4.2. KẾT QUẢ NHÂN NUÔI LƯU GIỮ DÒNG TẾ BÀO LAI EBNA-1-1 157 5.5. KẾT QUẢ SÀNG LỌC VÀ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA- 1 TRÊN CHUỘT BALB/C 160 5.5.1. KẾT QUẢ GÂY BÁNG CHO CHU ỘT 160 5.5.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG EBNA-1 161 5.5.3. KẾT LUẬN 162 5.6. KẾT QUẢ TẠO PHỨC HỆ KHÁNG THỂ - HẠT NANO VÀNG 162 CHƯƠNG 6 : KẾT QUẢ TẠO KIT SẮC KÝ MIỄN DỊCH (ICT) VÀ THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG KIT 165 6.1. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ LẮP BỘ KIT 165 6.1.1. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ NGUYÊN VẬT LIỆU SINH HỌC 165 6.1.2. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ VẬT LIỆU CƠ HỌC 166 6.1.3. KẾT QUẢ CHUẨN BỊ THÀNH PHẦN PHỤ TRỢ CỦA KIT ICT 168 6.2. BAO GÓI BỘ KIT ICA (EBV-Ag/Fast KIT) 170 6.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA KIT MIỄN DỊCH HỌC ( ICT ) 171 6.3.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ NH ẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU QUA THỬ KIT VỚI 3 LOẠI MẪU THỬ: MÔ UTVMH, MẪU TẾ BÀO BONG Ở THÀNH SAU HỌNG, MẪU MÁU NGƯỜI BÌNH THƯỜNG 171 6.3.2. XÁC ĐỊNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU KIT ICT (EBV-Ag/FastKIT ® ) QUA THỬ NGHIỆM Ở QUI MÔ VỪA VÀ SO SÁNH VỚI KIT SHPT (EBV-PCRKIT) 173 vii 6.4. KT QU SN XUT 100 B KIT SC Kí MIN DCH ICT V XY DNG TIấU CHUN C S 175 CHNG 7 : BN LUN V NHY V C HIU CA 2 B KIT EBV-PCRKIT (SHPT) V EBV-Ag/FastKIT (ICA) 177 7.1. NHY 177 7.2. C HIU 180 7.3. BN LUN 182 KT LUN, NH GI CHUNG V NGH 186 TI LIU THAM KHO PH LC 1. Phơng pháp nghiên cứu 2. Kết quả nghiên cứu và danh sách bệnh nhân nghiên cứu 3. Mẫu bệnh án nghiên cứu 4. Một số bộ kit lu hành trên thế giới 5. Phiếu kiểm định sinh học 6. Xét duyệt quyết toán ngân sách [...]... Virus Epstein- Barr ở Việt nam và xây dựng qui trình sản xuất bộ sinh phẩm chẩn đoán mã số KC.10.31/ 06-10, với 2 mục tiêu sau đây : 1 Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử EBV ở Việt nam 2 Xây dựng qui trình sản xuất, qui trình sử dụng, tiêu chuẩn cơ sở bộ kit Sinh học phân tử và kit sắc ký miễn dịch học (ICA) đẻ chẩn đoán EBV Đề tài có 5 Nội dung sau đây: Nội dung 1: Thu thập mẫu ung thư vòm mũi họng ở. .. Trung), TP HCM (miền Nam) và kiểm tra sự có mặt của EBV PGS TS Nguyễn Đình Phúc Chủ trì Nội dung 2: Nghiên cứu, xác định đặc điểm cấu trúc phân tử của các chủng virus Epstein- Barr ở Việt Nam PGS.TS Lê Thanh Hòa và Nguyễn Đình Phúc Chủ trì Nội dung 3: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở, quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán EBV bằng sinh học phân tử 2 Thử nghiệm và báo cáo kết quả... kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận gen LMP-1 125 Hình 4.16 Tiêu chuẩn cơ sở, thành phần và qui trình sử dụng và bảo quản bộ kit sinh học phân tử 131 xi Hình 4.17 Ảnh trình bày bộ kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV 132 Hình 4.18 Sử dụng kit sinh học phân tử chẩn đoán EBV các mẫu thu nhận từ bệnh nhân nhập viện tại các bệnh viện trong cả nước 132 Hình 4.19 Mô tả bộ kit sinh học phân tử phát... học phân tử và dịch tễ học phân tử của EBV tại Việt Nam, cũng như những hướng ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong chẩn đoán còn rất ít, ngoài một số công trình của Do et al (2008) [1],[3],[4],[6],[7],[11],[24],[52 ] Xuất phát từ nhũng luận cứ khoa học và những yêu cầu cấp thiết về nghiên cứu EBV trên đây chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử Virus. .. ngày nay còn chưa biết rõ.[47],[55],[72],[84] 7 1.2 CẤU TRÚC VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA EPSTEIN- BARR VIRUS 1.2.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA EBV EBV hay Herpes virus type 4, thuộc loại virus ADN 2 sợi xoắn, thuộc họ Herpesviridae (Cohen, 2006) Cấu trúc hệ gen của EBV là chuỗi DNA xoắn kép, mạch hở, kích thước khoảng 172 kb, nếu tính cả phần cấu trúc lặp ở hai đầu là 184 kb Hệ gen được chứa đựng trong một... EBNA-1 của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (763 bp) 85 Bảng 3.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen LMP-1 của chủng S1 (miền Nam, Việt Nam) (1238 bp) .87 Bảng 3.3 Đặc điểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV Việt Nam và thế giới 88 Bảng 3.4 Tỷ lệ (%) đồng nhất về nucleotide và amino acid .95 Bảng 3.5 Đặc điểm cấu trúc gen LMP-1 của các chủng EBV Việt Nam và thế giới ... khối, đó là cấu trúc protein đóng kín để bảo vệ nhân ADN của virus và mang tính kháng nguyên đặc hiệu của EBV A: Virus Herpes dưới kính hiển vi điện tử B: Sơ đồ cấu trúc virus Herpes Hinh 1.2 Sơ đồ cấu trúc phân tử của Herpesvirus Capsid là một vỏ chắc, được xác định bởi 20 mặt bên, với 12 đỉnh và 3 trục đồng dạng đối xứng theo kiểu 5-3-2 Vỏ capsid bao gồm 162 capsome, là những đơn vị cấu trúc trên 5... PGS.TS Lê Thanh Hòa và Nguyễn Đình Phúc chủ trì Nội dung 4: Sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp EBNA-1 và kháng thể đơn dòng (Mab-EBNA-1) PGS.TS Lê Thanh Hòa chủ trì Nội dung 5: Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất, tiêu chuẩn cơ sở và quy trình sử dụng bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên EBV theo nguyên lý sắc ký miễn dịch học (ICA) và báo cáo kết quả sử dụng PGS.TS Nguyễn Đình Phúc và PGS.TS Lê Thanh... 1.1.2 VIRUS EPSTEIN BARR VÀ UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG Epstein- Barr Virus (EBV) là virus thuộc họ Herpesviridae EBV gây nhiễm rộng trong cộng đồng, được nghiên cứu rất sớm từ những năm 1980 về bệnh sinh và dịch tễ học Đến tuổi trưởng thành, gần như tất cả mọi 4 người đều có khả năng mang EBV Ở các nước đang phát triển, trẻ em đã nhiễm và EBV kích thích sinh kháng thể rất sớm (Biggar và cs, 1978; Ayan và cs,... trùng tiềm tàng EBNA Epstein Barr virus nuclear antigen Kháng nguyên nhân EBV EBV Epstein Barr virus Virus Epstein Barr Gp Glycoprotein Glycoprotein Giải phẫu bệnh GPB HD Hodgkin disease Bệnh Hodgkin HIV Human immunodeficiency virus Virus gây bệnh AIDS HLA Humain leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở người HSV Herpes simplex virus Virus herpes thông . Epstein- Barr ở Việt nam và xây dựng qui trình sản xuất b ộ sinh phẩm chẩn đoán mã số KC.10.31/ 06-10, với 2 mục tiêu sau đây : 1. Nghiên cứu đặc điểm cấu trúc phân tử EBV ở Việt nam 2. Xây. QUẢ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG EBV Ở VIỆ T NAM 92 3.7.1. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ EBV CỦA VIỆT NAM QUA ĐỐI CHIẾU GEN EBNA-1 VỚI THẾ GIỚI 92 3.7.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC PHÂN TỬ. EBV Ở VIỆT NAM 2. QUI TRÌNH SẢN XUẤT BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 3. QUI TRÌNH SỬ DỤNG BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 4. TIÊU CHUẨN CƠ SỞ BỘ KIT SINH HỌC PHÂN TỬ 5. BÁO CÁO KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM, SỬ DỤNG BỘ