Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (vigna radiata (l.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (vigna radiata (l.) wilczek) phục vụ chọn dòng chịu hạn và chuyển gen

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH

(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG

CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN – 2009

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH

(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG

CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN – 2009

THAI NGUYEN UNIVESSITY

THE COLLEGE OF EDUCATION

-

SUMMARY OF MASTER ESSAY FOR EDUCATION SCIENCE

NGUYEN THI LUYEN

DEVELOPMENT OF REGENERATION ON MUNG BEAN TOCHOOSE THE DROUGHT – RESISTANT STRAIN AND

TRANSGENATION

Specialyty: GENETICSCode: 60.42.70

Teacher: Prof.PhD CHU HOANG MAU

THAI NGUYEN – 2009

Công trình được hoàn thành tại:

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM - ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS CHU HOÀNG MẬU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

NGUYỄN THỊ LUYỆN

PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG TÁI SINH Ở CÂY ĐẬU XANH

(VIGNA RADIATA (L.) WILCZEK) PHỤC VỤ CHỌN DÒNG

CHỊU HẠN VÀ CHUYỂN GEN

Chuyên ngành: Di truyền học Mã số : 60.42.70

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái nguyên - 2009

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Luyện

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu

này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học

tập và hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tâm, và các chị Vi

Kiều Liên và Nguyễn Thị Thủy (Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác - Viện Ngô Trung ương đã cung cấp các giống đậu xanh làm vật liệu cho các thí nghiệm của đề tài

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Luyện

Chương 1 Tổng quan tài liệu 3

1.1 Sơ lược về cây đậu xanh

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam………

3 3 4 1.2 Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong cải tiến giống cây trồng 7

1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật………

1.2.1.2 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật………

7 7 8 1.2.2 Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng……… 10

1.2.3 Phương thức chọn dòng……… 12

1.2.4 Tái sinh cây……… 13

1.3 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng soma và hệ thống tái sinh ở thực vật và cây đậu xanh

1.3.1 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma……

1.3.2 Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh ………

15 15 16 Chương 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu……… 18

2.1 Vật liệu nghiên cứu……… 18

2.1.1.Vật liệu thực vật……… 18

2.1.2 Hoá chất và thiết bị……… 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro 20

2.2.2 Phương pháp đánh giá khả năng chịu mất nước của mô sẹo

2.2.2.1 Phương pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô

2.2.2.2 Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây

2.2.2.3 Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc………

2.2.2.4 Phương pháp ra cây………

22 22 22 23 23 2.2.3 Phương pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm……… 24

2.2.4 Phương pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu 24

Chương 3 Kết quả và thảo luận……… 26

3.1 Hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ mô sẹo……… 26

3.1.1 Ảnh hưởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt……… 26

3.1.2 Ảnh hưởng của các chất 2.4D, BAP,GA3, NAA đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo

3.1.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4 D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh

3.1.2.2 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh

3.1.2.3 Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của đậu xanh

3.1.2.4 Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh

26 26 31 34 35 3.1.3 Nhận xét về môi trường nuôi cấy mô cây đậu xanh……… 37

3.2 Độ mất nước và khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh các giống nghiên cứu ……… 37

3.2.1.Mức độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh của các giống nghiên cứu 37

3.2.2 Khả năng chịu mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô……… 39

3.2.3 Nhận xét về khả năng chịu mất nước của mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô của các giống đậu xanh nghiên cứu……… 42

3.3 Kết quả tái sinh cây đậu xanh từ mắt lá mầm 43

3.3.1.Môi trường nảy mầm của hạt……… 43

3.3.2 Môi trường tạo đa chồi……… 43

3.3.3 Môi trường kéo dài chồi 45

3.3.4 Môi trường ra rễ 46

3.3.5 Ra cây và chế độ chăm sóc 46

3.3.6 Nhận xét về môi trường tái sinh từ mắt lá mầm 47

Kết luận và đề nghị 48

Công trình công bố liên quan đến luận văn……… 49

Tài liệu tham khảo 50

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

2,4D 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (Axit 2,4-Dichlorphenoxyacetic) ADN Axit deoxyribonucleic (Deoxiribonucleic acid)

ASTT áp suất thẩm thấu

BAP 6 - Benzyl Amino Purin cs Cộng sự

đvms đơn vị mô sẹo MS Murashige – Skoog

α-NAA Naphthyl acetic acid (Axit naphthyl acetic) IAA Axit ß – indol axetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Đặc điểm các giống đậu xanh nghiên cứu 18 3.1 Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%) 27 3.2 Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh 28 3.3 Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh 29 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh cây từ

3.5 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo chồi ở đậu xanh 33 3.6 Ảnh hưởng củ α-NAA tới khả năng ra rễ của cây tái sinh

3.7 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng

3.8 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô

3.9 Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo phôi đậu xanh sống sót sau khi

3.10 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tạo đa chồi ở đậu xanh 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Ảnh mô sẹo phôi đậu xanh nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 2,4D 31 3.2 Hình ảnh tái sinh đậu xanh trên môi trường bổ sung 3mg/l BAP 34

3.3 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 35 3.4 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α-NAA 36 3.5 Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý bằng thổi khô 38 3.6 Tỷ lệ sống sót (%) của mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô và nuôi

3.7 Khả năng tái sinh cây của các mô sẹo phôi đậu xanh sống sót

3.8 Tái sinh mô sẹo sau khi xử lý bằng thổi khô 42 3.9 Hạt đậu xanh nảy mầm sau 3 ngày (A, B), hạt đậu xanh được tách

3.11 Hình ảnh kéo dài chồi đậu xanh trên môi trường bổ sung GA3 46 3.12 Hình ảnh cây đậu xanh ra rễ trên môi trường bổ sung 0,3mg/l α- NAA 46 3.13 Cây đậu xanh tái sinh được trồng trong chậu 47

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây đậu xanh Vigna radiata (L.) Wilczek là một loại cây đậu đỗ quan

trọng của nền nông nghiệp châu Á Cây đậu xanh chủ yếu được trồng lấy hạt để chế biến thức ăn như giá đỗ, chè đậu xanh, dịch cốt đậu xanh, bánh đậu xanh…Không chỉ được coi như nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh còn được coi như một thứ dược liệu có tác dụng giải độc thanh nhiệt, bớt sưng phù, điều hoà ngũ tạng chữa bệnh… cho con người Hạt đậu xanh là một mặt hàng nông sản xuất khẩu có giá trị Ngoài ra, sản phẩm phụ của cây đậu xanh còn được dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng chống xói mòn và cải tạo đất Hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 62,12% hydratcacbon (trong đó có 51,8% tinh bột), các loại vitamin A, B1, B2, C và một số nguyên tố khoáng như: K, Na, Mg, P, Fe, Ca…

Trên thế giới đậu xanh được trồng nhiều ở Ấn Độ, Thái Lan, Philippin, Myanma, Bangladesh, Srilanca… với năng suất từ 18 – 20 tạ/ha

Ở Việt Nam do nhiều nguyên nhân khác nhau nên từ trước tới nay đậu xanh được trồng chưa nhiều, chủ yếu là xen canh, luân canh tăng vụ Chỉ trong thời gian gần đây đậu xanh mới được quan tâm phát triển Chương trình chọn tạo giống đậu xanh ở nước ta hiện nay là hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh có tiềm năng năng suất cao và ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả năng chống chịu hạn, úng, sâu bệnh tốt và chịu thâm canh

Trong công tác chọn giống cây trồng nói chung và chọn giống đậu xanh nói riêng các nhà khoa học đã sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) [10] hoặc lai giống (Trần Đình Long và Lê Khả Tường, 1998) [8] để tạo nguồn biến dị làm nguyên liệu cho quá trình chọn lọc Một trong các kỹ thuật được quan tâm ứng dụng vào chọn giống đậu xanh là sử dụng

công nghệ tế bào thực vật và xây dựng hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen nhằm cải tiến, nâng cao khả năng chống chịu của cây đậu xanh (Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [31], Ignacimuthu và Franklin (1999) [30], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [15], Sita và cs (2006) [43], Kaviraj và cs (2006) [33], Sonia và cs (2007) [44]

Những lý do trên đây là cơ sở để chúng tôi xây dựng đề tài cho luận văn

thạc sĩ là: “Phát triển hệ thống tái sinh ở cây đậu xanh (Vigna radiata (L.)

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc chọn dòng tế bào chịu

mất nước ở đậu xanh

- Xác định hệ thống tái sinh ở đậu xanh phục vụ chuyển gen

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu điều kiện khử trùng hạt sử dụng trong tái sinh cây từ mô sẹo và tạo

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, có nguồn gốc từ Ấn Độ và được phân bố rộng rãi ở các nước châu Á

Cây đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek) thuộc ngành Magnoliopyta, lớp Magnoliopsida bộ Fabales, họ đậu (Fabaceae), chi Vigna Chi Vigna là một trong những chi lớn của họ đậu, bao gồm 7 chi phụ là: Vigna, Haydonia, Plectropic, Macrohynchus, Ceratotropic, Lasionspron, Sigmoidotrotopis Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt bao gồm các loại thuộc hai chi phụ là Vigna và Ceratotropic Chi phụ Ceratotropic còn được gọi là nhóm đậu châu Á mang những đặc điểm điển hình thể hiện ở mức độ cao nhất cho Vigna Năm 1970, Vercourt đã công bố 5 trong số 16 loài của Ceratotropic đã được thuần hoá là: Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek), Đậu gạo (Vigna Umbellata(thumb), đậu adzukia (Vigna anguilaris (Willd), đậu ván (Vigna aconiti folia (Jacq)), Vigna trilobata (L) Wildzek

Thân đậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng đứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình khoảng 40 – 70 cm, đường kính trung bình từ 8 – 12 mm Thân cây gồm 7 – 8 đốt Thân phân cành muộn và có trung bình từ 10 -12 cành, một số giống có từ 9 – 10 cành

Lá thuộc loại lá kép mọc cách, lá chét có ba thuỳ với các hình dạng như ovan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thuỳ Trên thân chính của cây có từ 7 – 8 lá Số lá, hình dạng lá có thể thay đổi tuỳ theo giống, đất trồng và thời vụ Diện tích của các lá tăng từ các lá ở phía dưới lên các lá ở giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn Hoa đậu xanh là hoa lưỡng tính mọc thành chùm trên các trục hoa Mỗi trục hoa có thể phát triển thành hai hàng hoa mọc đối nhau, các hoa trên

hàng xếp liên tục với nhau tạo cho hoa có hình dạng co rút Hoa đậu xanh có màu tím hoặc màu vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1 Đậu xanh là loài thực vật tự thụ phấn, tỷ lệ hoa hình thành quả từ 10 – 25%.Thụ phấn xong tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển

Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹp, dài từ 8 – 10 cm, đường kính từ 4 – 6 mm, có hai gân nổi rõ dọc theo hai bên cạnh quả Quả chín có màu vàng, nâu hoặc đen Cũng như các bộ phận khác trên cây đậu xanh (thân, cành, cuống, lá) trên vỏ quả đậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng 0,3 – 0,4 mm Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và bệnh sâu đục quả thì mật độ lông khá dầy, mầu trắng Mỗi cây có từ 8 – 35 quả, mỗi quả có từ 8 – 15 hạt

Hạt đậu xanh có hình dạng khá phong phú như hình trụ, hình trụ hơi cạnh, ovan, tròn, thoi, tam giác Màu vỏ hạt có thể là xanh lục, xanh mỡ (xanh sáng), xanh tối (nâu), vàng rơm Ruột hạt có màu trắng, vàng hay xanh nhạt khối lượng 1000 hạt có thể dao động từ 25 – 70g

Rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ cái và rễ con, rễ cái sâu khoảng 20 – 30 cm, có khi sâu tới 70 – 100 cm Đặc biệt do rễ đậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là sát rễ cái hình thành các nốt sần Các nốt sần có khả năng cố định Nitơ thường có kích thước 4 – 5 mm, có màu đỏ, hồng hay nâu Nốt sần bé hơn, dạng que, ruột màu xanh hay đen đều không có hoạt tính Hạn chế của bộ rễ cây đậu xanh là dễ bị thối khi gặp úng

1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh trên thế giới và ở Việt Nam

Theo kết quả điều tra củatrung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á (AVRCD), hàng năm trên thế giới có khoảng 20 nước sản xuất đậu xanh, trong đó Thái Lan, Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan, Philippin, Srilanca được coi là những trọng điểm về diện tích, năng suất và sản lượng đậu xanh Trong những

năm 1950 Trung Quốc là nước sản xuất đậu xanh, với diện tích gieo trồng là 1,64 triệu ha và sản lượng là 800.000 tấn, tuy nhiên năng suất còn thấp và chỉ đạt khoảng 488 kg/ ha Sự sản xuất đậu xanh của Trung Quốc suy giảm qua những năm 1960 và những năm 1970 Sau đó chính phủ Trung Quốc đã có những thay đổi về chính sách nông nghiệp liên quan đến sản xuất đậu xanh, áp dụng khoa học kỹ thuật tiên tiến vào trong sản xuất nên sản xuất đậu xanh lại được phục hồi vào những năm 1980 và đến năm 2000, diện tích trồng là 772000 triệu ha, sản lượng đạt 891000 triệu tấn và năng suất bình quân đạt 1154 kg / ha Trong đó năm 1995 giá trị xuất khẩu đậu xanh đạt ở mức 104 triệu USD (72% tổng giá trị xuất khẩu nông nghiệp) và năm 1999 đạt ở mức rất cao tới 109 triệu USD (93%)

Ở Srilanca, tình hình sản xuất đậu xanh từ năm 1997 đến năm 2001 có xu hướng giảm: về diện tích trồng từ 16.636 ha (1997) xuống 10.976 ha (2001), sản lượng từ 15.000 triệu tấn (1997) xuống 10.072 triệu tấn (2001), và tăng nhập khẩu từ 2091 triệu tấn (1997) lên 8916 triệu tấn (2001)

Mặc dù diện tích gieo trồng và sản lượng đậu xanh hàng năm ở Srilanca khá lớn song vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn ở trong nước Do đó lượng đậu xanh nhập khẩu có xu thế tăng nhanh từ năm 2000, 2001 Các giống đậu xanh được gieo trồng phổ biến như Harsha năng suất trung bình 1200 kg/ha, MI-5 năng suất trung bình 1500 kg/ha, Ari năng suất trung bình 1700 kg/ha

Ở Việt Nam, cây đậu xanhđược gieo trồng ở nhiều địa phương trên cả nước Căn cứ vào đặc điểm địa hình, điều kiện khí hậu có thể phân chia các vùng trồng cây đậu xanh như sau:

- Vùng núi phía Bắc bao gồm các tỉnh Sơn La, Lai Châu, Hoà Bình, Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Tuyên Quang và Quảng Ninh Thời vụ gieo trồng từ tháng 4,5 thu hoạch tháng 7,8 là thời điểm có khí hậu nómg ẩm thuận lợi cho

sinh trưởng của cây Tập quán canh tác ở đây đơn giản, ít thâm canh, năng suất thấp

- Vùng Đồng bằng, Trung du Bắc bộ bao gồm các tỉnh Hà Tây, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Hà Nam, Ninh Bình, Thái Bình và Thanh Hoá Đậu xanh ở vùng này được gieo trồng từ tháng 2 đến tháng 9 hàng năm, tập trung ở 3 thời vụ: vụ xuân, vụ hè, vụ thu đông Hàng năm do xu hướng thâm canh tăng vụ, tăng năng suất vì có hệ thống tưới tiêu khá hoàn chỉnh và đầu tư khá nên năng suất đậu xanh vùng này cao, việc tiếp nhận mô hình đậu xanh cao sản khả thi hơn Đây là những điều kiện cơ bản trong phát triển sản xuất

- Vùng Duyên hải Trung Bộ và Tây Nguyên Đây là vùng có diện tích và sản lượng gieo trồng đậu xanh lớn Do không chịu ảnh hưởng của khí hậu mùa đông lạnh, mùa mưa, mùa khô phân bố rõ rệt nên thuận lợi để trồng quanh năm Hàng năm đậu xanh được gieo trồng từ 2 – 3 vụ, với phương thức trồng thuần là chủ yếu Hạn chế lớn nhất ở đây là thời điểm thu hoạch vụ hè thu thường gặp mưa bão nên thất thoát nhiều về năng suất và sản lượng

- Vùng Đông Nam bộ Đây là vùng sản xuất đậu đỗ có quy mô lớn chiếm 26% diện tích gieo trồng cả nước Tuy nhiên, do không có thâm canh và việc sử dụng các giống đậu xanh năng suất thấp nên năng suất trung bình của vùng này còn thấp

Một số giống đậu xanh được trồng phổ biến hiện nay như: ĐX044, VC2768A năng suất vụ hè thu khoảng 2000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ/ năm, cây thấp,cứng, chịu mưa và chống đổ tốt ĐX044 đang được trồng nhiều ở vùng đồng bằng và trung du Bắc bộ; V123 năng suất đạt 1800 – 2000 kg/ha, thâm canh có thể đạt 2000 - 7000 kg/ha, có thể trồng 3 vụ /năm; T135 năng suất đạt 2900 kg/ha trồng ở các tỉnh phía Bắc; V91-15 năng suất từ 1200 – 1400 kg/ha cây cứng, ít đổ, ít nhiễm bệnh vàng lá, trồng được trên nhiều loại đất ở các tỉnh

phía Nam; HL-115 năng suất từ 1000 – 1300 kg/ha trồng vụ hè và 1400 – 2200 kg/ha trong vụ thu đông tại các tỉnh phía nam, cây cứng, ít đổ

1.2 ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG

1.2.1 Cơ sở khoa học của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.2.1.1 Cơ sở tế bào học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1838, hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng ra học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi cơ thể sinh vật đều bao gồm các đơn vị nhỏ tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt đó là các tế bào

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật các nhà khoa học đã đạt được những thành công chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào Các tế bào lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ…) nếu được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy thích hợp đều có thể phát triển thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài và ra hoa kết quả bình thường Các loại mô đã phân hoá tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, ngoài ra chúng còn có khả năng phát triển thành tế bào mô sẹo (callus) Đó là loại tế bào không phân hoá, phân chia liên tục và có khả năng phân hoá thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh Như vậy mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào

Tính toàn năng là cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển và hoàn thiện Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào nhanh chóng trở thành công cụ hữu hiệu trong nhiều lĩnh vực của công tác giống cây trồng, đưa nghề trồng trọt vào thế kỷ của công nghệ hiện đại

1.2.1.2 Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hiện nay người ta đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chất điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin

- Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và quan tâm sớm nhất Auxin là những hoocmon thực vật có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hoá cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào Chính chức năng này đã được người ta sử dụng và đánh giá hoạt tính của nó, ví dụ bằng cách đo phần kéo dài lá mầm cây yến mạch trồng trong điều kiện tối sẽ biết được hoạt tính của auxin Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D), α – naphtylaxetic axit (α – NAA), Indolaxetic axit (IAA), trong đó 2,4D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích quá trình phân chia tế bào thường được sử dụng nhiều nhất, α – NAA có tác dụng tạo rễ cho cây con Tuy nhiên, tầm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết sinh trưởng nào đều có thể được đánh giá thông qua số cấc công trình nghiên cứu chúng Ramakishnan và cs đã sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo từ mắt lá mầm của cây đậu đen, sau 5 ngày nuôi cấy xuất hiện mô sẹo với tỷ lệ 60,8% [32] Kaviraj và cs cũng sử dụng 2,4D để tạo mô sẹo từ lá sơ cấp của đậu xanh và kết quả là khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l tỷ lệ tạo mô sẹo là 100% Ngoài sử dụng 2,4D bổ sung vào môi trường tạo mô sẹo, Kaviraj và cs sử

dụng α – NAA kết hợp với kinetin và BAP để tái sinh cây và tạo cây hoàn chỉnh ở đậu xanh …[34]

- Nhóm giberelin là nhóm được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nấm lúa von Nó tác động làm tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như ngô lùn thành ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Đại diện cho nhóm này là axit giberilic (GA3), được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [15]

- Nhóm cytokinin là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Đại diện cho nhóm cytokinin gồm: Kinetin; 6 – Benzyl amino purine (BAP); 6- Dimethylalylamino purine (2iP); Zeatin

Rất nhiều cytokinin được phát hiện trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia Ignaccimuthu và cs sử dụng BAP và α – NAA để tạo chồi từ cuống tử điệp của đậu xanh sau 15 ngày nuôi cấy Chỉ sử dụng BAP, Mai Trường và cs(2001) đã xây dựng được hệ thống tái sinh cây đậu xanh từ cuống tử điệp…[31]

- Ethylen là nhóm có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây nhưng gần đây nó mới được coi là một hoocmon thực vật Ethylen thường được sử dụng để làm chín quả ở chuối, ra hoa đồng loạt ở dứa, nó cũng ảnh hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trong điều kiện ethylen nồng độ cao sẽ kéo dài khoảng ra rễ của thân…[15]

- Axit absixic là hợp chất ức chế sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến tính ngủ nghỉ của hạt, mầm và rụng lá, tăng cường ra hoa cho một số cây ngắn ngày thông qua hiệu quả tổng hợp ARN và protein [15]

Trong nuôi cấy tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nuôi cấy, môi trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cấy mà thành phần, chủng loại và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng có khác nhau

1.2.2 Hệ thống nuôi cấy để chọn dòng

Cơ sở khoa học của kỹ thuật chọn dòng tế bào soma là hiện tượng các tế

bào thực vật khi được nuôi cấy ở dạng mô sẹo trong điều kiện in vitro thường có

những biến đổi di truyền tự phát, được gọi chung là biến dị soma Thông qua phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể chọn ra được những dòng tế bào thích hợp theo định hướng của người thực nghiệm Tuy vậy, đối với mỗi loại thực vật cần thiết phải có nghiên cứu tối ưu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho việc chọn dòng Sau đây là một số hệ thống nuôi cấy đã được thực hiện:

Nuôi cấy mô sẹo: Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc

thấp, chưa phân hoá, phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền

cao Mô sẹo thu được bằng nuôi cấy in vitro từ các cơ quan của thực vật như

thân, lá, rễ, hoa…trong môi trường chứa chất điều hoà sinh trưởng nhóm auxin và điều kiện nuôi cấy thích hợp Mô sẹo có thể được duy trì trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển có định kì, tuy nhiên trong thực nghiệm thấy rằng: i) mô sẹo qua cấy chuyển nhiều lần có ảnh hưởng không tốt đến khả năng tái sinh của cây; ii) tăng tính biến động di truyền của mô

Các tế bào di truyền có tính ổn định khá thấp Nhiều tác giả đã thông báo nhận được cây tái sinh từ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi nhiễm sắc thể (dị bội, đa bội) và những biến đổi di truyền khác Vì vậy việc nhân nhanh và duy trì tính đồng nhất di truyền thông qua nuôi cấy mô sẹo cần thận trọng đối với nhiều loại thực vật và nhất định chỉ sử dụng mô sẹo sơ cấp để tái sinh cây hoàn chỉnh thông qua con đường tạo phôi vô tính Mặt khác những cây tái sinh từ mô sẹo với những biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa trong việc chọn giống và như vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong phú hơn (Lê Trần Bình và cs 1997,1998) [1], [2] Bằng cách này nhiều tác giả đã thông báo thu được kết quả ở những giống cây trồng mới (Bertin và cs, 1995, 1997) [22], [23]

Nuôi cấy tế bào huyền phù: Nuôi cấy tế bào huyền phù là nuôi cấy tế bào

đơn (single cell) hoặc cụm nhỏ tế bào (cell agregate) trong môi trường lỏng Các tế bào này cũng được tạo ra từ mô sẹo có nguồn gốc thân, lá, rễ, hoa, phôi… Muốn thu được tế bào huyền phù nhỏ, mịn cần phải sàng lọc liên tục qua các loại sàng có mắt lọc nhỏ (<0,5 mm) Để đạt được dạng nuôi cấy huyền phù tương đối đều nhau cần phải sàng lọc ít nhất hàng chục lần, như vậy thời gian cần thiết để thiết lập được môi trường nuôi cấy huyền phù ít nhất là 2 – 3 tháng Đây là điều trở ngại trong nghiên cứu với thực vật vì thời gian nuôi cấy dài các tế bào huyền phù sẽ mất khả năng tái sinh cây Lúc đó việc chọn dòng sẽ gặp khó khăn để ứng dụng cho thực tiễn tạo giống Vì vậy chỉ trong trường hợp nhất định, khi tác nhân chọn lọc bắt buộc phải tác động lên toàn bộ bề mặt tế bào thì hệ thống nuôi cấy huyền phù mới được áp dụng

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn có ưu điểm trong chọn dòng vì các tế bào có kích cỡ tương đối đều nhau dưới tác động của điều kiện chọn lọc các dòng tế bào sẽ được chọn lọc một cách tương đối triệt để Điều đáng quan tâm là khả năng tái sinh cây của các tế bào đơn là rất thấp Nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm chỉ thu được các dòng tế bào chọn lọc, nhưng rất tiếc là không thu được cây tái sinh (Dix và cs,1990) [28] Mặc dù vậy cũng đã có một số cây tái sinh từ nuôi cấy tế bào huyền phù đã được công bố như ở cây lúa, cây thuốc lá…(Collin và cs, 1990) [24]

Nuôi cấy tế bào trần: Tế bào thực vật bị phá bỏ toàn bộ lớp vỏ bao bọc

(cell wall) chỉ còn lại khối nguyên sinh chất được bao bọc bởi màng nguyên sinh được gọi là tế bào trần (protoplast) Tế bào trần có thể được tách từ nhiều bộ phận khác nhau của cây nhưng chủ yếu là từ lá, mô sẹo, tế bào đơn và phôi

Các protoplast sau khi tách được nuôi cấy trong môi trường thích hợp thì tái tạo lại thành tế bào, phát triển thành mô sẹo và tái sinh thành cây hoàn chỉnh Vì trong giai đoạn chưa có thành tế bào các protoplast rất mẫn cảm với nồng độ

các chất trong môi trường dinh dưỡng vì vậy trong môi trường nuôi cấy cần giảm bớt các chất vô cơ

Nhìn chung hạn chế lớn nhất trong nuôi cấy tế bào trần là khả năng tái sinh cây thấp đặc biệt là ở cây họ thuộc thảo Cho đến nay đã có khoảng 70 loại cây trồng đã tách và nuôi cấy tế bào trần nhưng việc tái sinh cây chưa được nhiều Tuy nhiên nhiều tác giả tiếp tục công bố những thành công trong việc nuôi cấy tế bào trần, đặc biệt là ở lúa Abdul và cs (1991) đã tách và tái sinh cây

hoàn chỉnh từ tế bào protoplast từ mô phôi non ở lúa dại (Oryza rufipogon Criff)

[18] Biswas và Zapata (1990) đã tái sinh thành cây hoàn chỉnh qua con đường

nuôi cấy protoplast từ tế bào mô phôi lúa (Oryza sativa L.) [24]

Ứng dụng có ý nghĩa nhất của nuôi cấy protoplast là tạo cây soma, tạo cây lai tế bào chất thông qua dung hợp tế bào trần và hiện nay ứng dụng nhiều là để biến nạp gen Việc chọn dòng chống chịu sử dụng phương pháp nuôi cấy protoplast còn ít được sử dụng và hầu như chưa có công bố thành công nào đề cập về vấn đề này

1.2.3 Phương thức chọn dòng

Chọn lọc trực tiếp: Do mô sẹo có tính biến động di truyền cao trong nuôi

cấy in vitro nên thường được các nhà thực nghiệm sử dụng để chọn dòng chống

chịu, đây là một kỹ thuật thông dụng và có hiệu quả cao Mô sẹo được chọn lọc trực tiếp trên môi trường có chứa nồng độ thích hợp của tác nhân chọn lọc như PEG (polyethylene glycol), sorbitol, NaCl…hoặc bị xử lý bằng tác nhân vật lý (tia UV, gamma…) Các tế bào sống sót sẽ được nhận biết trên môi trường chọn lọc thông qua quá trình sinh trưởng hay sự khác biệt về màu sắc từ quần thể tế bào, sau đó tế bào sống sót sẽ được chọn lọc và nhân thành một số lượng lớn Mô hình này được sử dụng nhiều trong chọn dòng chịu muối (Chandler và Vasil, 1984) [25] Trong chọn dòng trực tiếp người ta cũng có thể tiến hành chọn lọc theo kiểu bậc thang, các mô sẹo sống sót trong môi trường chọn lọc có

nồng độ tác nhân chọn lọc thấp sẽ được chuyển lên môi trường có tác nhân chọn lọc nồng độ cao Tuy nhiên, chọn lọc theo kiểu bậc thang cũng có mặt hạn chế của nó, bởi vì các mô sẹo sống sót sau chọn lọc được nhiều khi đó chỉ là các mô sẹo được trải qua quá trình huấn luyện

Hệ thống tế bào được sử dụng là các tế bào nuôi dịch lỏng hoặc trộn tế bào vào môi trường thạch chứa chất chọn lọc hoặc cấy trực tiếp lên môi trường chọn lọc Điều kiện chọn lọc ở đây là sự có mặt của tác nhân chọn lọc với nồng độ hay mức độ khác nhau gây tác động trực tiếp lên sinh trưởng của tế bào Những tế bào sống sót phân chia thành cụm mô sẹo mới Dòng chống chịu thường xuất hiện từ một phần của khối tế bào nuôi cấy này

Điểm hạn chế lớn nhất trong chọn dòng bằng nuôi cấy mô sẹo là chọn lọc không triệt để do kích thước lớn và không đồng nhất của khối mô Vì vậy để đạt được hiệu quả cao người ta phải sử dụng các khối mô có kích thước nhỏ và đều nhau [25]

Chọn lọc gián tiếp: Chọn lọc gián tiếp đôi khi là chọn lọc mô sẹo có khả

năng sống sót nhờ một khuyết tật nào đó của tế bào trên môi trường có chứa tác nhân chọn lọc

Chọn lọc tổng thể: Các tế bào dị dưỡng thường được chọn theo phương

pháp xử lý đột biến và nuôi trên môi trường có chứa yếu tố dinh dưỡng cần thiết

1.2.4 Tái sinh cây

Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong chọn dòng tế bào, nhiều nhà nghiên cứu thực nghiệm thu được các tế bào sống sót nhưng lại không tái sinh được cây hoàn chỉnh Nguyên nhân là chưa xác định một cách đầy đủ đặc điểm quá trình phân hoá hình thái của sự tái sinh cây

Hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy mô và tái sinh cây là khâu quan trọng đầu tiên khi bắt tay vào công việc chọn dòng biến dị soma Theo Raghava và Nabors (1985) [32] cần phải chú ý đến các yếu tố sau:

(1) Nguồn mẫu vật nuôi cấy có tế bào sinh trưởng với tốc độ nhanh (mô phân sinh, phôi non…)

(2) Môi trường và điều kiện nuôi cấy: pH, chiếu sáng, nhiệt độ… (3) Nồng độ và tỷ lệ thích hợp của auxin và cytokinin

Nguồn gốc mô sẹo là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng tái sinh [12] Mức bội thể của mô sẹo cũng là nguyên nhân gây nên sự khác nhau trong

quá trình tái sinh cây Mô sẹo đơn bội từ đoạn thân hay mảnh lá của Dautura innoxia tái sinh chồi nhanh hơn mô sẹo cùng loài của cây lưỡng bội Ở cây

khoai lang tỷ lệ tái sinh cây từ mô sẹo có nguồn gốc từ lá, thân, rễ, cuống lá là rất thấp Mô sẹo có nguồn gốc từ củ khoai lang bị lục hoá mạnh, tạo nhiều rễ và hầu như không có khả năng tái sinh cây [4]

Khả năng tái sinh cây chịu ảnh hưởng lớn bởi thành phần và nồng độ các chất kích thích sinh trưởng thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo có hiệu quả cao ở nhiều đối tượng cây trồng khi bổ sung các chất sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin Theo nghiên cứu của Dix (1990), mô sẹo có khả năng phân hoá tốt trên môi trường MS cơ bản có bổ sung α – NAA (0,4mg/l) BAP (10mg/l) Sau đó chuyển sang nuôi cấy ở môi trường MS cơ bản không có chất kích thích sinh trưởng các mô này vẫn có khả năng tái sinh cao [28]

Khả năng tái sinh cũng chịu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy Nghiên cứu của Poddar (1998) cho thấy, hàm lượng amonium nitrat có ảnh

hưởng đến khả năng tái sinh cây ở cây Eleusine coracana [39] Bổ sung

Spemidine trong quá trình nuôi cấy mô sẹo lúa với thời gian dài 12 tháng đã làm tăng khả năng tái sinh cây [9], Abdul và cs (1999) đã phát hiện sự gia tăng hàm lượng α – amylase ở những mô có khả năng tái sinh cao ở lúa [18]

Khả năng sinh trưởng và tái sinh cây tăng lên ở các mô sau khi xử lý các điều kiện cực đoan đã được nhiều tác giả đề cập (Nabors và cs, 1983) [37] Nguyễn Hoàng Lộc, 1992 cũng thu được kết quả tương tự khi tái sinh cây ở các mô chịu muối và mất nước ở thuốc lá [9] Nguyên nhân của hiện tượng này có thể là dưới tác động của các điều kiện cực đoan ở một mức độ và thời gian nhất định những mô hay tế bào “yếu” thường chết, chỉ còn những tế bào có sức sống cao mới sống sót và cho hiệu quả tái sinh cao

1.3 NGHIÊN CỨU CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT CHỌN DÒNG TẾ BÀO SOMA VÀ HỆ THỐNG TÁI SINH Ở THỰC VẬT VÀ CÂY ĐẬU XANH

1.3.1 Nghiên cứu chọn giống cây trồng bằng kỹ thuật chọn dòng tế bào soma

Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chọn dòng tế bào, đặc biệt là chọn dòng chống chịu stress môi trường như chịu hạn, chịu lạnh, chịu muối NaCl, chịu nhôm [2] Mundy và cs (1988) đã tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất tăng khả năng giữ nước và chịu mất nước của mô sẹo lúa [35] Bằng việc bổ sung PEG8000 vào môi trường nuôi cấy mô sẹo giống lúa Khao Dawk Mali 105, Adkins và cs (1995) đã chọn được dòng lúa chịu hạn có những tính trạng nông học quan trọng và khả năng chịu hạn được duy trì và ổn định ở thế hệ R2 [19] Bằng phương pháp thổi khô mô sẹo lúa, Đinh Thị Phòng và cs (1998, 2001) đã

chọn tạo được 3 giống lúa DR1, DR2, DR3 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn giống gốc [12]

Lê Trần Bình và cs (1998) đã chọn được hai dòng có khả năng chịu muối là C0 và C8 Bằng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù từ mô sẹo lúa trong môi trường có bổ sung AlCl3 ở nồng độ từ 0 – 600ppm có pH tương ứng từ 5,8 – 2,71, tác giả cũng chọn được một số giống địa phương như pokaly, cườm, chiêm bầu và một cố giống lúa lai như tép lai, CR203 có khả năng chống chịu [2] Ngoài ra khi xử lý nhiệt độ thấp tác giả cũng chọn được một số dòng lúa từ các

loài phụ Japonica, Javanica và Indica có khả năng chịu lạnh (10

C) Xử lý nhiệt độ cao ở giai đoạn mô sẹo của một số giống lúa, Nguyễn Thị Tâm (2004), đã tạo được 197 dòng mô có khả năng chịu nóng ở 400

C, 420C và 520 dòng cây xanh [14] Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo thuốc lá kết hợp với việc tiền xử lý bằng ABA, manitol và saccharose, Nguyễn Hoàng Lộc (1993) [9] cũng thu được 3 dòng thuốc lá SC1, SC2, SC3 (của các giống BV23-5, BG, NTH tương ứng) có khả năng chịu được sự mất nước cực đoan (mô mất nước trên 90% so với khối lượng tươi) Kết quả phân tích về các đặc điểm sinh lý – sinh hoá ở các dòng thuốc lá này cho thấy tính chịu mất nước được điều khiển bởi một nhóm gen

1.3.2 Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở thực vật và ở cây đậu xanh

Trong thực tế đậu xanh được sản xuất dễ dàng và hoàn toàn không có nhu cầu nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tuy nhiên việc nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu xanh khó có thể thực hiện và thành công được nếu trước hết không tiến hành việc tái sinh cây đậu xanh Rudrabhatla Sairam và cs (2005) đã tổng hợp các kết quả nghiên cứu phát triển kỹ thuật tái sinh ở cây một lá

mầm và cây hai lá mầm Sự tái sinh cây được thực hiện bằng nuôi cấy in vitro từ

phôi soma hoặc từ một bộ phận khác độc lập trên cơ thể và điều đó còn phụ thuộc vào genotype của giống [41] Đối với cây ngô, sự tái sinh cây có thể thực

hiện từ mô sẹo hoặc tạo đa chồi; tạo đa chồi từ hạt nảy mầm ở cây Sorghum; tạo

mô sẹo từ hạt nảy mầm, tạo phôi soma từ mô sẹo và tái sinh chồi từ mô sẹo ở

cây Lolium; tạo đa chồi từ cuống lá của cây Begonia; tạo mô sẹo và tái sinh từ lá hay cuống lá ở cây Geranium, nuôi cấy in vitro phôi soma từ tế bào nuôi cấy

huyền phù ở cây đậu đũa (Vigna unguiculata) được thực hiện bởi Ramakrishnan và cs (2005) [33] và bằng phương pháp này đã thu tần số tái sinh cây cao (Prem và cs, 2001) [38] … Đối với cây đậu tương sự tái sinh cây tạo đa chồi từ mắt lá mầm đã được nghiên cứu, tuy nhiên đậu tương là đối tượng thực vật rất khó thực

hiện nuôi cấy in vitro từ khâu khử trùng, tạo mô sẹo, tái sinh cây, tạo rễ và ra cây [6] Nghiên cứu khả năng tái sinh của 27 giống thuộc loài Vigna có nguồn

gốc từ Phillipine, Madagascar, Pakistan, India, Australia, China, Japan Renato và cs (1999, 2001) đã cho thấy kỹ thuật tái sinh cây từ mắt lá mầm của hạt nảy mầm 4 ngày tuổi đạt hiệu quả tái sinh 80% - 100% và tái sinh chồi trực tiếp từ

mắt lá mầm như là chỉ thị cho hệ gen của loài đậu Vigna châu Á (subgenus Ceratotropis) [42], [43] Các kết quả nghiên cứu tái sinh cây ở đậu xanh từ phôi

soma và từ mắt lá mầm phục vụ chuyển gen cũng đã được công bố bởi Jayanti Sen và Spra Guha Mukherjee (1998) [32], Ignacimuthu và Franklin (1999) [31], Renato và cs (1999, 2001) [41], [42], Mai Trường và cs (2001) [16], Sita và cs (2006) [44], Kaviraj và cs (2006) [34] Sonia và cs (2007) [45] nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein ức chế enzyme α-amylase vào cây đậu xanh nhờ vi

khuẩn Agrobacterium được thực hiện nhờ tái sinh đa chồi từ mắt lá mầm Đánh giá hiệu quả chuyển gen ở cây Vigna mungo khi sử dụng kỹ thuật cấy mô từ mắt

lá mầm của Muruganantham và của Amutha và cs (2006) cũng đã khẳng định hiệu quả của phương pháp này [36]

Bảng 2.1 Đặc điểm của các giống đậu xanh nghiên cứu

STT Tên giống Nguồn gốc Màu sắc hạt dạng hạt Hình Khả năng chịu hạn

1 VN93 - 1 Giống lai trong nước (Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo) không bóng Xanh - Tròn Khá

2 VN99- 3

Giống lai khác loài trong nước (Viện Viện Nghiên cứu Ngô lai tạo -VN93-1 x Vigna mungo)

Xanh nâu –

không bóng Tròn Trung bình

3 VC1973A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình

4 ĐX06 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế không bóng Xanh nâu – Tròn Trung bình

5 VC3902A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình

6 VC6148 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu – bóng Tròn Trung bình

7 VC 6372 Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu

–bóng Tròn Trung bình 8 VC 2768A Nhập nội từ Trung tâm Cải tiến Rau màu Quốc tế Xanh nâu –bóng Tròn Trung bình

2.1.2 Hoá chất và thiết bị

- Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác

- Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH …

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Tạo đa chồi từ mắt lá mầm

Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro

HẠT ĐẬU XANH

Tạo mô sẹo

Xử lý thổi khô

Tái sinh cây

2.2.1 Nhóm phương pháp nuôi cấy in vitro

* Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh

Tạo mô sẹo

Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8 Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250

C ± 10C

Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức:

Ci (%)

Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)

Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng

trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy