- Sử dụng các loại hoá chất thông dụng như 2,4D (Diclorphenoxyacetic acid), α- NAA (acid α – naphthylacetic), BAP (6 – Benzyl amino Purin), các chất khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin, nước dừa, agarose, glucose và nhiều hoá chất thông dụng khác.
- Sử dụng các thiết bị như: Cân điện tử (Đức), buồng cấy vô trùng (Nuare, Mỹ), nồi khử trùng (Tomy,Nhật), máy đo pH …
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 8 năm 2008 đến tháng 8 năm 2009 tại Phòng công nghệ tế bào thực vật thuộc khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Các bước nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ tổng quát sau:
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Tạo đa chồi từ mắt lá mầm Thăm dò môi trường nuôi cấy in vitro
HẠT ĐẬU XANH
Tạo mô sẹo
Xử lý thổi khô
2.2.1. Nhóm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
* Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh
Khử trùng hạt
Mẫu vật ở ngoài môi trường nuôi cấy có thể có nấm mốc và vi khuẩn vì vậy cần phải khử trùng để loại bỏ.
- Khử trùng hạt ngoài buồng cấy: Hạt đậu xanh được rửa bằng nước máy, sau đó rửa sạch bằng xà phòng, cuối cùng tráng lại nhiều lần bằng nước cất.
- Khử trùng trong buồng cấy: Hạt đậu xanh được khử trùng trong điều kiện vô trùng bằng cồn trong thời gian 1 phút, tráng lại bằng nước cất khử trùng 1 đến 2 lần. Thêm dung dịch Javen lắc đều trong 20 - 25 phút, sau đó rửa bằng nước cất khử trùng 3 đến 4 lần. Thí nghiệm với nồng độ cồn 60%,70%,80%, 90%, nồng độ javen 50%,60%,70%. Ngâm hạt đã được khử trùng trong khoảng thời gian 5 giờ.
Tạo mô sẹo
Hạt đậu xanh đã khử trùng được đặt lên đĩa petri có lót giấy thấm vô trùng, dùng panh và dao mỏng tách bỏ lớp vỏ và phần nội nhũ, thu phôi đặt lên môi trường MS cơ bản có bổ sung 2,4D nồng độ từ 3 - 13mg/l, saccharose 3%, agar 0,9%, pH 5,8. Nuôi 1 tuần trong tối và 3 ngày dưới ánh sáng đèn phòng nuôi cấy với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 250
C ± 10C. Đánh giá tỷ lệ tạo mô sẹo theo công thức:
t cp N N
Ci (%)
Trong đó:Ncp là số hạt tạo mô sẹo Nt là tổng số hạt nuôi cấy Ci là tỷ lệ tạo mô sẹo (%)
Đánh giá tốc độ phát triển của mô sẹo của các giống thông qua chỉ số tăng trưởng của khối mô sẹo thu được sau 10 ngày nuôi cấy
Tái sinh cây
Mô sẹo phôi thu được từ môi trường tốt nhất được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây trên nền MS cơ bản, bổ sung BAP (1,5mg/l; 2,0mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l; 3,5 mg/l). Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả được đánh giá sau 10 đến 15 ngày cấy chuyển.
Đánh giá tỉ lệ tái sinh theo công thức:
sv r c N N R (%)
Trong đó: Rc là khả năng tái sinh cây (%) Nr là tổng số mô tái sinh cây Nsv là tổng số mô nuôi cấy
Kéo dài chồi đậu xanh
Khi chồi đạt chiều cao 2 – 2,5 cm được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi trên môi trường MS cơ bản; muối B5 3g/l; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; GA3 với nồng độ (0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l); pH 5,7. Đánh giá khả năng kéo dài chồi của cây sau 10 ngày cấy chuyển. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 chồi và lặp lại 3 lần. Chồi phát triển tốt là những chồi sau 10 ngày cấy chuyển có chiều cao đảm bảo cho cấy chuyển ra rễ, chồi mập và không bị héo ngọn.
Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi sau khi kéo dài được chuyển sang môi trường ra rễ để tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α – NAA (0,2 mg/l; 0,3 mg/l; 0,4mg/l); pH 5,6. Mỗi bình cấy từ 2- 3 chồi. Đánh giá khả năng hình thành và phát triển rễ của cây tái sinh sau 3 tuần và 4 tuần.
2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo 2.2.2.1. Phƣơng pháp xử lý mô sẹo bằng thổi khô
Mô sẹo phôi đậu xanh sau 10 ngày nuôi cấy được đặt lên đĩa petri trải giấy lọc vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của buồng cấy ở các ngưỡng thời gian khác nhau, từ 0; 3; 5; 7; 9; 11 giờ. Xác định độ mất nước của mô sẹo sau 3, 5, 7, 9, 11 giờ xử lý.
Độ mất nước của mô sẹo phôi đậu xanh sau khi xử lý bằng thổi khô được tính theo công thức: f d f L W W W W (%) Trong đó: WL:độ mất nước (%)
Wf: khối lượng mô tươi (mg)
Wd: khối lượng mô sau thổi khô (mg)
2.2.2.2. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau khi xử lý bằng thổi khô và tái sinh cây
Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nước bằng thổi khô lên môi trường tái sinh cây (MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7).
+ Tỷ lệ sống sót của mô sẹo được đánh giá 15 ngày thổi khô được tính theo công thức: t sv v N N S (%) Trong đó:Sv:tỷ lệ mô sống sót (%) Nsv:số mô sống sót Nt:tổng số mô xử lý
+ Tỷ lệ tái sinh cây:
sv r c N N R (%)
Trong đó: Rc:khả năng tái sinh cây (%) Nr:số mô tái sinh cây
2.2.2.3. Tạo cây hoàn chỉnh từ mô sẹo chọn lọc
Các chồi đậu xanh được tách thành một dòng cây và cấy chuyển trên môi trường tạo cây hoàn chỉnh. Nuôi 4 tuần dưới ánh sáng đền neon trong phòng nuôi cấy với cường độ 200 lux, thời gian chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ phòng nuôi 250C 10C. Môi trường tạo cây hoàn chỉnh: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; nước dừa 100ml/l; α - NAA: 0,3 mg/l; pH 5,6.
2.2.2.4. Phƣơng pháp ra cây
Cây nuôi cấy trong ống nghiệm là cây được sống trong điều kiện tối ưu về mọi mặt trong điều kiện môi trường vô trùng. Khi đưa cây ra ra ngoài ống nghiệm, cây phải chịu tác động của điều kiện bất lợi của môi trường. Do đó để đạt được cây có khả năng sống cao thì trong thời gian đầu mới đưa cây ra phải bảo vệ cẩn thận; từng bước cho cây làm quen dần với những điều kiện sống bên ngoài, cây con dần cứng cáp và phát triển được ở ngoài tự nhiên.
Các bước ra cây được tiến hành như sau:
- Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm, sau đó lắc nhẹ cho thạch rời khỏi rễ cây, dùng panh cặp nhẹ kéo ra (chú ý tránh dập nát) rửa cẩn thận cho hết lớp agar bám quanh gốc bằng nước sạch.
- Chuẩn bị giá thể trồng cây: Đậu xanh kém chịu nước nên tỷ lệ đất: cát: trấu hun là 1:1,5:1,5. Giá thể trồng cây được đựng vào khay trồng với bề dày khoảng 10 cm.
- Trồng cây: cây con được trồng vào khay, sau đó dùng dung dịch MS cơ bản pha loãng 10 lần phun nhẹ nhàng vào gốc.
- Chăm sóc cây đậu xanh non: cây đậu xanh trồng trong khay để ra nơi đủ ánh sáng nhưng tránh nắng và tránh mưa trực tiếp. Sau 2 tuần cây sống ra rễ mới, lá mới có thể đưa ra ngoài vườn ươm.
2.2.3. Phƣơng pháp tạo đa chồi từ mắt lá mầm
Khử trùng hạt: hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, sau đó rửa bằng cồn 70% trong vòng một phút, lắc hạt với dung dịch javen 60% trong vòng 20 - 25 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng ba lần.
Môi trường nảy mầm hạt: Hạt đậu xanh đã được khử trùng cấy vào bình tam giác trong môi trường nảy mầm: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; pH 5,8. Khảo sát khả năng nảy mầm của hạt, theo dõi sự phát triển và tỷ lệ nảy mầm.
Môi trường tạo đa chồi: Sau khi hạt nảy mầm dùng dao cắt bỏ phần trụ rễ cách phần mắt lá mầm khoảng 3- 4 mm. Tách đôi lá mầm thành 2 mẫu cấy, cắt bỏ lá mầm, dùng kim nhọn gây tổn thương ở mắt lá mầm. Các mảnh lá mầm được cấy trên môi trường tạo đa chồi: MS cơ bản, đường saccharose 30g/l; thạch agar: 9g/l; 3g muối B5; BAP 3mg/l; pH: 5,7. Đánh giá tỷ lệ tạo chồi và số chồi / mảnh cấy.
Môi trường kéo dài chồi: các chồi được tách riêng và cấy vào môi trường kéo dài chồi: MS cơ bản; thạch agar 9g/l; đường saccharose 30g/l; GA3 1mg/l; nước dừa 100ml/l; pH 5,7.
Môi trường ra rễ: Sau khi chồi có kích thước 4 - 5cm cấy chuyển sang môi trường ra rễ gồm có: MS cơ bản; đường saccharose 30g/l; thạch agar 9g/l; nước dừa 100ml/l, α - NAA0,3mg/l.
Ra cây và chế độ chăm sóc: Cây tái sinh hoàn chỉnh được ra bầu và đưa ra trồng ở ngoài (phương pháp và điều kiện ra cây giống như mục phương pháp ra cây ở mục 2.2.2)
2.2.4. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu
Mỗi thí nghiệm được nhắc lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê như trung bình mẫu (x), phơng sai (2), độ lệch chuẩn (), và sai số
trung bình mẫu (Sx), với n ≤ 30, α = 0,05. Các số liệu được xử lý trên máy vi tính bằng chương trình Excel [16].
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HỆ THỐNG TÁI SINH CÂY ĐẬU XANH TỪ MÔ SẸO
3.1.1. Ảnh hƣởng nồng độ các chất đến kết quả khử trùng hạt
Hạt đậu xanh được rửa sạch bằng nước cất vô trùng, ngâm với cồn trong vòng một phút ở các thang nồng độ 60%; 70%; 80%; 90%. Sau đó được lắc nhẹ và đều trong dung dịch javen với nồng độ: 50%; 60%; 70% trong vòng 25 phút.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cồn 70% và javen 60% đảm bảo cho hạt nảy mầm cao, khả năng bị nhiễm và bị thối rất thấp. Nồng độ cồn và javen thấp tỷ lệ nhiễm cao; nồng độ cồn và javen cao tỷ lệ hạt bị thối cao.
3.1.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây từ mô sẹo
3.1.2.1. Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo từ phôi đậu xanh
Phôi đậu xanh sau khi khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau. Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 phôi, lặp lại 3 lần. Theo dõi khả năng hình thành mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.1. Kết quả bảng 3.1 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, phôi đậu xanh đều có khả năng tạo mô sẹo sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 11 mg/l 2,4D thích hợp nhất cho khả năng tạo mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 100%. Còn ở môi trường có nồng độ 3mg/l – 10mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l khả năng tạo mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, khả năng tạo mô sẹo giảm mạnh (79,50%). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;
VC6372; VC2768A, tỉ lệ mô sẹo đạt cao nhất là 99% khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l.
Bảng 3.1. Khả năng tạo mô sẹo của các giống đậu xanh (%)
Công thức
Nồng độ
2.4D (mg/l)
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 85,17 86,50 80,15 81,05 87,15 82,05 87,05 81,15 2 4 86,09 86,29 83,25 81,15 86,90 83,50 86,90 81,25 3 5 86,34 87,30 86,32 86,35 87,30 87,10 87,10 85,35 4 6 89,21 87,20 86,30 87,50 87,90 87,50 87,60 84,50 5 7 92,72 91,02 87,15 89,55 90,20 88,55 90,25 89,55 6 8 95,23 91,20 93,10 94,10 91,90 94,20 91,05 90,10 7 9 96,37 93,07 97,05 95,05 94,07 94,50 92,10 92,05 8 10 99,14 98,10 99,20 97,50 98,50 97,10 99,50 95,50 9 11 94,14 97,23 96,23 100,00 96,03 96,00 96,03 92,00 10 12 94,04 92,05 84,10 84,10 92,15 84,10 90,15 85,10 11 13 82,03 80,80 79,50 79,50 82,50 79,30 83,50 83,50
Ở môi trường có nồng độ 3 mg/l – 9 mg/l 2,4D tỷ lệ tạo mô sẹo thấp. Sử dụng 2,4D cao hơn 10mg/l và khả năng tạo mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống trên đều giảm.
Đặc điểm hình thái của mô sẹo các giống đậu xanh được trình bày ở bảng 3.2. Kết quả bảng 3.2 cho thấy, trên các loại môi trường có bổ sung 2,4D với nồng độ khác nhau và giống đậu xanh khác nhau, hình dạng mô sẹo cũng khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy. Ở môi trường có nồng độ 8mg/l – 13mg/l 2,4D các mô sẹo đều có hình dạng sần sùi, nhưng nồng độ 2,4D từ 8mg/l -
10mg/l đối với 7 giống đậu xanh VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148;VC6372; VC2768A, các mô sẹo đó bó chặt còn nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l mô sẹo sần sùi nhưng không bó chặt. Đối với giống đậu xanh ĐX06 nồng độ 2,4D từ 8 mg/l – 11mg/l các mô sẹo có hình dạng sần sùi và bó chặt, còn nồng độ 2,4D cao hơn 11mg/l thì các mô sẹo đó không bó chặt lại. Nồng độ 2,4D từ 3 mg/l – 7mg/l tất cả các giống đậu xanh đều có hình dạng nhẵn.
Bảng 3.2. Hình dạng mô sẹo của các giống đậu xanh
Công thức Nồng độ 2,4D mg/l
VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A
1 3 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 2 4 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 3 5 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 4 6 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 5 7 Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn Nhẵn 6 8 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 7 9 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 8 10 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 9 11 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
10 12 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi 11 13 Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi Sần sùi
Kết quả theo dõi tốc độ sinh trưởng của mô sẹo được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng mô sẹo của các giống đậu xanh (đvms) (1 đơn vị mô sẹo (đvms) có kích thước khoảng 3 mm2
)
Công thức
2.4-D
(mg/) VN 93-1 VN 99-3 VC 1973A ĐX 06 VC 3902A VC 6148 VC 6372 VC 2768A 1 3 2,700,10 2,630,15 2,53 0,15 2,500,26 2,60 0,25 2,650,50 2,580,15 2,600,50 2 4 2,600,36 2,670,35 2,66 0,25 2,630,40 2,60 0,10 2,70 0,15 2,750,10 2,60 0,15 3 5 2,730,21 2,630,51 2,83 0,21 2,700,21 2,75 0,25 2,78 0,25 2,700,25 2,80 0,35 4 6 3,030,72 3,200,53 3,00 0,35 3,100,35 3,15 0,15 3,05 0,45 3,150,40 3,10 0,52 5 7 3,200,20 3,270,25 3,37 0,15 3,270,25 3,37 0,35 3,38 0,25 3,480,15 3,27 0,25 6 8 3,300,10 3,300,10 3,40 0,15 3,450,15 3,40 0,15 3,45 0,35 3,550,25 3,44 0,32 7 9 3,370,15 3,600,50 3,50 0,10 3,530,40 3,55 0,42 3,50 0,20 3,600,20 3,52 0,21 8 10 3,490,25 3,700,15 3,60 0,15 3,800,15 3,75 0,15 3,650,45 3,650,45 3,75 0,35 9 11 2,900,20 3,100,25 3,00 0,35 3,850,35 2,75 0,25 2,6 0,25 2,850,50 2,95 0,25 10 12 2,700,15 2,800,50 2,65 0,42 3,3 0,20 2,78 0,27 2,58 0,26 2,750,20 2,75 0,26 11 13 2,300,20 2,450,20 2,43 0,25 2,500,27 2,33 0,10 2,50 0,30 2,600,18 2,50 0,25
Bảng 3.3 cho thấy, sau 10 ngày nuôi cấy ở môi trường có nồng độ 3mg/l - 10 mg/l 2,4D mô sẹo của phôi giống đậu xanh ĐX06 có kích thước khối mô tăng dần và đạt kích thước lớn nhất ở môi trường có nồng độ 11mg/l 2,4D. Sử dụng 2,4D cao hơn 11mg/l kích thước mô sẹo của phôi đậu xanh ĐX06 bắt đầu giảm. Đặc biệt với nồng độ 2,4D 13 mg/l, kích thước mô sẹo giảm mạnh (2,5 đvms). Các giống VN93-1; VN99-3; VC1973A; VC3902A; VC6148; VC6372; VC2768A, các phôi nuôi cấy trong môi trường bổ sung từ 3 mg/l – 9 mg/l kích thước khối mô sẹo tăng dần và đạt cao nhất kích thước
lớn nhất khi sử dụng 2,4D với nồng độ 10mg/l. Ở môi trường có nồng độ 2,4D cao hơn 10mg/l và kích thước mô sẹo phôi đậu xanh của 7 giống đó bắt đầu giảm dần.